EGFR在结直肠癌组织中的表达及其意义

摘要

目的: 探讨结直肠癌患者肿瘤组织中表皮生长因子受体(epidermal growth factor, EGFR)过表达与临床病理特征及其预后的关系和意义.

方法: 收集2004-01/2010-04在中国人民解放军南京军区福州总医院手术切除的结直肠癌组织标本1 228例, 选择其中资料完整的病例1 100例, 采用EliVisionTM plus免疫组织化学方法检测癌组织EGFR的表达. 通过Ridit分析和生存分析判断EGFR表达与各临床病理参数及其预后的关系.

结果: 1 100例结直肠癌组织中EGFR阳性表达270例, 表达率为24.55%. 男性患者阳性表达率明显高于女性(27.04% vs 19.01%, P = 0.015), Ⅳ期、Ⅲ期肿瘤患者阳性表达率明显高于其他各期病例(40.74% vs 30.58%, P<0.001), 有淋巴结转移者EGFR阳性表达率明显高于无淋巴结转移者(32.10% vs 19.09%, P<0.0001), 有远处转移者EGFR阳性表达率明显高于无远处转移者(75.31% vs 20.51%, P<0.0001); EGFR表达与患者年龄、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度等均无明显相关性, EGFR表达水平与患者总生存期无明显相关.

结论: EGFR检测可以作为评估结直肠癌恶性生物学行为及其预后的参考指标.

关键词: 结直肠癌; 表皮生长因子受体; 免疫组织化学; 病理学; TNM分期; 预后

Significance of expression of epidermal growth factor receptor in colorectal cancer

Li Wang, Ying-Hao Yu, Wei Liu, Lie Wang, Xue-Nong Ouyang, Xi-Sheng Xiong

Li Wang, Ying-Hao Yu, Wei Liu, Xi-Sheng Xiong, Department of Pathology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of Chinese PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China.

Lie Wang, Department of General Surgery, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of Chinese PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China

Xue-Nong Ouyang, Department of Oncology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of Chinese PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China

Supported by: the Research Foundation of the Nanjing Military Command of Chinese PLA, No. 10MA107.

Correspondence to: Professor Ying-Hao Yu, Department of Pathology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of Chinese PLA, 156 North Xihuan Road, Fuzhou 350025, Fujian Province, China. yuyinghao0808@126.com

Received: February 20, 2011
Revised: April 25, 2011
Accepted: May 5, 2011
Published online: May 18, 2011

Abstract

AIM: To detect the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) in colorectal cancer and to evaluate its relationship with clinicopathological parameters and prognosis in patients with colorectal cancer.

METHODS: A total of 1 228 specimens were collected from patients with colorectal cancer who were treated at Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of Chinese PLA from January 2004 to April 2010. Immunohistochemistry was used to detect the expression of EGFR in 1 100 specimens taken from patients who had complete clinical data. Univariate and multivariate analyses were used to study the relationship of EGFR expression with clinicopathological parameters and prognosis in patients with colorectal cancer.

RESULTS: The positive rate of EGFR expression was 24.55% (270/1 100). Males had a significantly higher positive rate of EGFR expression than females (27.04% vs 19.01%, P = 0.015). Patients with stages III and IV colorectal cancer had a significantly higher positive rate of EGFR expression than other patients (40.74% vs 30.58%, P < 0. 001). The positive rate of EGFR expression was significantly higher in patients with lymph node or distant metastasis than in those without metastasis (32.10% vs 19.09%, P < 0.0001). EGFR expression was not significantly correlated with age, tumor location, invasion depth, differentiation, or overall survival.

CONCLUSION: Detection of EGFR protein expression can be used to evaluate the malignant behavior and prognosis of colorectal cancer.

Key Words: Colorectal cancer; Epidermal growth factor receptor; Immunohistochemistry; Pathology; TNM staging; Prognosis

0 引言

结直肠癌是全球范围内第3位常见的恶性肿瘤, 其相关死亡占第4位[1]. 我国结直肠癌的发病率亦呈逐年上升趋势. 手术仍是治疗结直肠癌的主要手段[2], 但效果并不理想, 近年来, 应用靶向药物治疗结直肠癌取得了重要进展, 在目前抗肿瘤分子靶向治疗中, 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是最受关注的治疗靶点之一[3]. EGFR是ErbB家族成员, 在多种人类肿瘤中高表达, 其具有酪氨酸激酶活性, 当其与配体结合时, 通过激活酪氨酸蛋白激酶途径, 可促进肿瘤细胞生长和迁移、肿瘤血管形成及抑制肿瘤细胞凋亡[4]. 至今已有许多关于结直肠癌中EGFR蛋白表达的报道, 但总体例数均较少, 阳性表达率在8%-83%之间[5,6], 存在较大的差异, 其表达意义也一直有争议[7,8]. 为此, 本研究拟采用EliVision^TM plus免疫组化方法对1 100例结直肠癌患者肿瘤标本进行EGFR检测, 以期了解EGFR在结直肠癌组织中的表达情况, 并分析其与各临床病理参数及其预后的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

收集2004-01/2010-04在中国人民解放军南京军区福州总医院手术切除的结直肠癌组织标本1 228例, 选择其中资料完整的病例1 100例进行研究, 所有病例术前均未经放疗或化疗. 1 100例患者中男758例, 女342例, 年龄17-85(中位年龄51)岁. 结肠癌536例, 直肠癌564例. 按照肿瘤分化程度进行病理学分类: 高、中分化者961例, 低分化、未分化者139例. TNM分期参照2006版WHO结直肠肿瘤分类及诊断标准: 0期4例, Ⅰ期190例, Ⅱ期462例, Ⅲ期363例, Ⅳ期81例. 有淋巴结转移者461例. 总生存期(overall survival, OS)为患者手术病理确诊直至由于任何原因死亡的时间. 在数据截止时尚生存的患者, 以其最后1次随访的日期作为截尾数据进行分析. 所有组织标本经40 g/L中性甲醛固定, 石蜡包埋, 3 μm厚连续切片, 分别进行HE和免疫组织化学染色. 免疫组织化学试剂均购自福州迈新生物技术开发公司, EGFR一抗为鼠抗人单克隆抗体. 试剂盒选用EliVision^TM plus试剂盒. 其他仪器设备: 石蜡切片机(LEICA RM2245); 全自动免疫组织化学染色仪(德国LEICA公司); 显微镜(OLYMPUS BX51); 电热恒温干燥箱(上海-恒科技有限公司). 所有标记均设阳性对照并用PBS缓冲液代替一抗做阴性对照.

1.2 方法

1.2.1免疫组织化学染色方法: 采用EliVision^TM plus法. 步骤如下(1)结直肠癌石蜡组织3 μm厚连续切片3张, 置于防脱玻片上, 将切片放入70 ℃烤箱过夜; (2)二甲苯脱蜡2缸10 min; 1 L/L酒精5 min、1 L/L酒精2 min、850 mL/L酒精2 min、700 mL/L酒精2 min水化, 过蒸馏水; (3)PBS冲洗3×3 min; (4)采用胃酶进行酶消化抗原修复, 在切片上滴加胃酶, 置入37 ℃水浴箱中15 min; (5)PBS冲洗 3×3 min; (6)加3%过氧化氢溶液, 室温下孵育10 min, 以阻断内源性过氧化物酶; (7)PBS冲洗3×3 min; (8)加第一抗体, 室温下孵育60 min; 阴性对照切片以蒸馏水代替一抗; (9)PBS冲洗3×5 min; (10)加聚合物增强剂(试剂A), 室温下孵育20 min; (11)PBS冲洗3×3 min; (12)加酶标抗鼠聚合物(试剂B), 室温下孵育30 min; (13)PBS冲洗3×3 min; (14)加新配制的DAB显色液, 显微镜下观察3-10 min, 阳性显色为棕色; (15)蒸馏水冲洗, 苏木素复染, 0.1%盐酸分化, 蒸馏水冲洗, PBS冲洗返蓝; (16)梯度酒精脱水干燥, 中性树脂封片, 显微镜下观察.

1.2.2 EGFR过表达的判读: 阳性染色呈棕黄色颗粒, 位于细胞膜. 根据肿瘤阳性细胞数所占比例分为: 肿瘤细胞不着色<10%的肿瘤细胞着色为(-), 10%-25%(+), 26%-50 %(++), 50%-75%(+++), >75 %(++++)[9,10].

统计学处理 数据采用EXCEL2003进行录入整理, 统计学分析采用SAS9.1软件, 结直肠癌患者EGFR表达与患者临床病理学特征之间的关系统计学方法采用Ridit分析. 不同分组之间的生存分析比较采用Log-Rank检验, 双侧检验P≤0.05为有统计学意义.

2 结果

2.1 EGFR蛋白在结直肠癌中的表达

EGFR在不同分化程度的结直肠癌组织中通常为不同程度的棕色膜染色(图1). 所有患者肿瘤组织中EGFR的阳性表达率为24.55%(270/1 100), 其中(+)者118例, (++)者77例, (+++)者51例, (++++)者24例.

图1 EGFR在结直肠癌组织中的表达(EliVision×400). A: 高分化腺癌; B: 中分化腺癌; C: 低分化腺癌; D: 腺癌组织中的阴性表达.

2.2 EGFR表达与各临床病理参数之间的关系

EGFR表达与患者的性别相关, 男性患者EGFR阳性率为27.04%, 女性患者阳性率为19.01%, 有统计学意义(Hc = 5.9091, P = 0.0151). EGFR表达与患者的TNM分期亦有显著相关性(Hc = 32.6849, P<0.001), Ⅳ期、Ⅲ期患者EGFR阳性率明显高于其他各期, 0期、Ⅰ期、Ⅱ期之间差异无统计学意义; 有淋巴结转移者与无淋巴结转移者EGFR阳性表达差异亦有统计学意义(Hc = 28.2867, P<0.001); 手术时有远处转移者EGFR阳性表达明显多于无远处转移者(75.31% vs 20.51%, Hc = 152.36, P<0.001). EGFR表达与年龄, 肿瘤部位, 肿瘤浸润深度, 分化程度等均无明显相关性(表1).

表1 EGFR表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系.

临床病理参数	n	-	+	++	+++	++++	EGFR阳性率(%)	Hc值	P值
性别							24.55
男	758	553	97	61	32	15	27.04	5.9091	0.0151
女	342	277	21	16	19	9	19.01
年龄(岁)
<60	559	432	33	37	45	12	22.72	0.0307	0.8609
≥60	541	398	85	40	6	12	26.43
肿瘤部位
结肠	536	414	35	40	31	16	22.76	0.3779	0.5387
直肠	564	416	83	37	20	8	26.24
浸润深度
Tis+T1	14	10	2	0	1	1	28.57	3.3394	0.3422
T2	227	165	28	13	15	6	27.31
T3	795	611	77	62	29	16	23.14
T4	64	44	11	2	6	1	31.25
分化程度
高、中分化	961	730	107	56	49	19	24.04	1.3667	0.2424
低、未分化	139	100	11	21	2	5	28.06
TNM分期
0	4	3	0	0	0	1	25.00	32.6849	<0.0001
Ⅰ	190	153	23	5	6	3	19.47
Ⅱ	462	374	32	37	13	6	19.05
Ⅲ	363	252	55	31	17	8	30.58
Ⅳ	81	48	8	4	15	6	40.74
淋巴转移
N0	639	517	57	37	19	9	19.09	28.2867	<0.0001
N1	298	209	40	16	25	8	29.87
N2	163	104	21	24	7	7	36.20
远处转移
M0	1 019	810	105	67	27	10	20.51	152.3555	<0.0001
M1	81	20	13	10	24	14	75.31
预后	222
存活	152	110	14	18	6	4	27.63	0.2461	0.6198
死亡	70	48	8	10	2	2	31.43

2.3 EGFR表达与结直肠癌患者生存的关系

本研究最终实际随访人数222例(2005-2009年, 采用随机表随机抽取), 中位随访时间42(12-72) mo. 至数据截止时间, 152例患者存活, 70例患者死亡. EGFR阴性组5年生存率57.80%, 中位生存期26 mo; EGFR阳性组5年生存率54.60%, 中位生存期40 mo. EGFR表达水平与患者的总生存期无明显相关(χ² = 2.918, P = 0.088, 图2).

图2 结直肠癌EGFR表达与患者生存的关系.

3 讨论

TNM分期至今仍是结直肠癌最重要的临床病理学预后因子, 也是目前临床进行辅助放化疗的主要依据. 然而, 结直肠癌又是一类个体化差异明显的疾病, T₃,T₄N₀M₀结直肠癌患者术后局部复发和远处转移者占20%-30%, 而其余大部分患者可以达到临床治愈; T3,T4N1M0结直肠癌患者术后局部复发和远处转移者高达50%-80%, 但也有少部分患者可以通过手术和术后化疗达到临床治愈[11]. 因此, 进一步了解结直肠癌患者肿瘤细胞的分子生物学行为, 可能有助于判断患者的预后. 有研究揭示, EGFR的过度表达或异常激活常引起细胞恶性转化, 与结直肠癌的发生、发展、恶性程度及预后等密切相关[12,13].

余英豪课题组前期对大宗中国胃癌人群进行了EGFR表达研究, 发现该指标对评估胃癌的恶性生物学行为有一定意义[14]. 本研究主要目的是通过免疫组织化学方法检测结直肠癌患者EGFR表达情况, 希望籍大宗病例研究以更准确揭示EGFR表达水平与中国结直肠癌患者临床病理参数间的关系, 为临床判断预后和指导治疗提供依据. 研究发现在所有1 100例中国结直肠癌人群中, EGFR的阳性表达率为24.55%, 与以往所报道的EGFR阳性表达率8%-83%[5,6]之间有一定的差异. 国内外的多项研究表明, EGFR表达水平与患者年龄、性别、肿瘤生长部位、浸润深度、大体形态、组织学类型、分化程度无明显相关性[15-17], 而与结直肠癌TNM分期和淋巴结转移相关[18,19], 揭示EGFR阳性的肿瘤可能具有更强的分裂增生及浸润性, 其高表达与肿瘤的高侵袭转移性有关, 可作为判断结直肠癌进展和预后的指标[20]. 本研究结论与其亦略有差异, EGFR表达与性别相关, 男性明显高于女性, 其差别有统计学意义, 这是否与结直肠癌男性发病率本身高于女性相关尚有待研究; 而EGFR的表达与年龄、肿瘤发生部位、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度无显著相关性, 与TNM分期、淋巴结转移及远处转移有显著相关性, EGFR表达水平与患者的总生存期亦无明显相关, 这与以往研究相同.

结直肠癌作为一种消化系常见肿瘤, 对其预后的判断是一个复杂的问题, 尽管EGFR蛋白表达的高低不能有效预测患者的预后, 甚至有研究表明亦不能指导临床抗EGFR分子靶向药物的应用[21], 但是EGFR在肿瘤的增殖和进展方面的作用仍十分重要. 近年来, EGFR已经成为结直肠癌靶向治疗的重要靶点, 尤其西妥昔单抗和帕尼单抗的临床应用更证实了EGFR在结直肠癌发生和发展中的重要作用. EGFR可以在蛋白和基因水平进行检测, 迄今为止, 绝大多数研究在蛋白水平检测EGFR表达与靶向药物的疗效缺乏一致性, 因此引发了许多学者进一步在基因水平上检测肿瘤组织中EGFR的变化以及EGFR下游信号转导途径的改变等, 揭示了诸如k-ras等基因突变与靶向药物疗效、患者临床病理参数及预后之间的关系. 本课题组已展开对结直肠癌组织EGFR蛋白高表达与EGFR基因突变、k-ras基因突变间关系的深入研究[22].

评论

背景资料

我国结直肠癌的发病率呈逐年上升趋势, 近年来, 应用靶向药物治疗结直肠癌取得了重要进展, 在目前抗肿瘤分子靶向治疗中, 表皮生长因子受体(EGFR)是最受关注的治疗靶点之一.

同行评议者

黄培林, 教授, 东南大学

相关报道

余英豪课题组前期对大宗中国胃癌人群进行了EGFR表达研究, 发现该指标对评估胃癌的恶性生物学行为有一定意义.

创新盘点

迄今为止本研究属于国内最大宗关于EGFR在结直肠癌患者中表达的病例研究.

应用要点

本研究采用EliVision^TM plus免疫组织化学方法对1 100例结直肠癌患者肿瘤标本进行EGFR检测, 以期了解EGFR在结直肠癌组织中的表达情况, 并分析其与各临床病理参数及其预后的关系.

同行评价

本文具有较高的实用性和可读性, 有较好的学术价值.

备注

编辑: 李薇 电编:何基才

参考文献

1.	Weitz J, Koch M, Debus J, Höhler T, Galle PR, Büchler MW. Colorectal cancer. Lancet. 2005;365:153-165.  [PubMed]  [DOI]

2.	Goodwin RA, Asmis TR. Overview of systemic therapy for colorectal cancer. Clin Colon Rectal Surg. 2009;22:251-256.  [PubMed]  [DOI]

3.	Barozzi C, Ravaioli M, D'Errico A, Grazi GL, Poggioli G, Cavrini G, Mazziotti A, Grigioni WF. Relevance of biologic markers in colorectal carcinoma: a comparative study of a broad panel. Cancer. 2002;94:647-657.  [PubMed]  [DOI]

4.

Van Cutsem E, Peeters M, Siena S, Humblet Y, Hendlisz A, Neyns B, Canon JL, Van Laethem JL, Maurel J, Richardson G. Open-label phase III trial of panitumumab plus best supportive care compared with best supportive care alone in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 2007;25:1658-1664.  [PubMed]  [DOI]

5.	Mehra R, Cohen RB, Burtness BA. The role of cetuximab for the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Adv Hematol Oncol. 2008;6:742-750.  [PubMed]  [DOI]

6.	Ooi A, Takehana T, Li X, Suzuki S, Kunitomo K, Iino H, Fujii H, Takeda Y, Dobashi Y. Protein overexpression and gene amplification of HER-2 and EGFR in colorectal cancers: an immunohistochemical and fluorescent in situ hybridization study. Mod Pathol. 2004;17:895-904.  [PubMed]  [DOI]

7.	Kopp R, Rothbauer E, Mueller E, Schildberg FW, Jauch KW, Pfeiffer A. Reduced survival of rectal cancer patients with increased tumor epidermal growth factor receptor levels. Dis Colon Rectum. 2003;46:1391-1399.  [PubMed]  [DOI]

8.	Li S, Kim JS, Kim JM, Cho MJ, Yoon WH, Song KS, Yeo SG, Kim JS. Epidermal growth factor receptor as a prognostic factor in locally advanced rectal-cancer patients treated with preoperative chemoradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2006;65:705-712.  [PubMed]  [DOI]

9.

Bhargava R, Chen B, Klimstra DS, Saltz LB, Hedvat C, Tang LH, Gerald W, Teruya-Feldstein J, Paty PB, Qin J. Comparison of two antibodies for immunohistochemical evaluation of epidermal growth factor receptor expression in colorectal carcinomas, adenomas, and normal mucosa. Cancer. 2006;106:1857-1862.  [PubMed]  [DOI]

10.	Roepstorff K, Grandal MV, Henriksen L, Knudsen SL, Lerdrup M, Grøvdal L, Willumsen BM, van Deurs B. Differential effects of EGFR ligands on endocytic sorting of the receptor. Traffic. 2009;10:1115-1127.  [PubMed]  [DOI]

11.	李 月敏, 徐 建明, 廖 国清, 李 晓兵, 王 岩, 李 明颖, 曹 阳, 李 志强, 葛 飞娇. EGFR在结直肠癌组织中的表达及其临床意义. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2007;14:377-380.  [PubMed]  [DOI]

12.	Klapper LN, Kirschbaum MH, Sela M, Yarden Y. Biochemical and clinical implications of the ErbB/HER signaling network of growth factor receptors. Adv Cancer Res. 2000;77:25-79.  [PubMed]  [DOI]

13.

Casanova ML, Larcher F, Casanova B, Murillas R, Fernández-Aceñero MJ, Villanueva C, Martínez-Palacio J, Ullrich A, Conti CJ, Jorcano JL. A critical role for ras-mediated, epidermal growth factor receptor-dependent angiogenesis in mouse skin carcinogenesis. Cancer Res. 2002;62:3402-3407.  [PubMed]  [DOI]

14.	刘 伟, 余 英豪, 陈 娟, 熊 喜生, 欧阳 学农, 王 烈, 武 一曼. EGFR在中国胃癌患者中的表达及其临床意义. 世界华人消化杂志. 2010;18:2648-2653.  [PubMed]  [DOI]

15.	杨 树钢, 叶 建新. DCR3和EGFR在结直肠癌中的表达及临床意义. 中国医药导报. 2009;6:30-32.  [PubMed]  [DOI]

16.	Deng Y, Kurland BF, Wang J, Bi J, Li W, Rao S, Lan P, Lin T, Lin E. High epidermal growth factor receptor expression in metastatic colorectal cancer lymph nodes may be more prognostic of poor survival than in primary tumor. Am J Clin Oncol. 2009;32:245-252.  [PubMed]  [DOI]

17.	梁 君林, 万 德森, 潘 志忠, 周 志伟. Dukes'A、B期结直肠癌c-erbB-2, EGFR和TGF-α表达与复发转移的关系. 癌症. 2007;26:647-651.  [PubMed]  [DOI]

18.	侍 立志, 王 兆春. EGF, EGFR和PCNA表达与大肠癌临床病理学特征及关系. 中国普通外科杂志. 2004;13:253-256.  [PubMed]  [DOI]

19.	李 峰, 严 家芹, 陈 壬寅, 赵 国强, 李 晟磊, 曹 娟娟. EGFR基因单核苷酸多态性与结直肠癌的相关性. 山东医药. 2009;49:4-6.  [PubMed]  [DOI]

20.	王 丽霞, 肖 彦增, 殷 卫东. C-erbB-2和EGFR在大肠癌中过表达及意义. 肿瘤研究与临床. 2003;15:314-316.  [PubMed]  [DOI]

21.

Lenz HJ, Van Cutsem E, Khambata-Ford S, Mayer RJ, Gold P, Stella P, Mirtsching B, Cohn AL, Pippas AW, Azarnia N. Multicenter phase II and translational study of cetuximab in metastatic colorectal carcinoma refractory to irinotecan, oxaliplatin, and fluoropyrimidines. J Clin Oncol. 2006;24:4914-4921.  [PubMed]  [DOI]

22.	王 丽, 余 英豪. 结直肠癌k-ras基因检测及其靶向治疗的研究现状. 世界华人消化杂志. 2011;19:62-67.  [PubMed]  [DOI]