ANXA2、VEGF对HepG2肝癌细胞系转移的促进作用

摘要

目的: 探讨膜联蛋白2(ANXA2)、血管内皮生长因子(VEGF)促进HepG2肝癌细胞系转移的作用.

方法: 应用Transwell 、RT-PCR、Western blot, 检测在不同5-氟尿嘧啶(5-FU)剂量(50、100、200、400 mg/L)干扰下, ANXA2、VEGF的表达及其促进HepG2肝癌细胞系转移的作用.

结果: Transwell方法检测HepG2肝癌细胞随着5-FU剂量的增加侵袭力较对照组明显降低, 各剂量组间差异具有明显统计学意义(22±5, 25±4, 13±2, 12±2 vs 39±7, 均P<0.05); RT-PCR、Western blot方法检测HepG2肝癌细胞中ANXA2、VEGF mRNA、蛋白的表达量随着5-FU剂量的增加逐渐下降, 与对照组间的差异具有显著统计学意义(ANXA2 mRNA: 0.527±0.008, 0.419±0.046, 0.213±0.007, 0.176±0.007 vs 0.718±0.008; ANXA2蛋白: 0.669±0.055, 0.484±0.072, 0.180±0.034, 0.099±0.009 vs 1.236±0.102; VEGF mRNA: 0.818±0.016, 0.558±0.101, 0.386±0.009, 0.352±0.017 vs 1.176±0.035; VEGF蛋白: 0.960±0.085, 0.962±0.056, 0.376±0.069, 0.219±0.008 vs 1.124±0.170, 均P = 0.000), 且两者具有相关性(r_p = 0.900, r_w = 0.856).

结论: 随着5-FU剂量的逐渐增加, HepG2肝癌细胞侵袭率及ANXA2、VEGF表达量逐渐下降, 两者呈显著正相关, 提示两者在肝癌细胞的侵袭转移机制中可能起重要作用.

关键词: 膜联蛋白-2; 血管内皮生长因子; 肝细胞癌; HepG2肝癌细胞系; 5-氟尿嘧啶

ANXA-2 and VEGF promote invasiveness of human liver cancer HepG2 cells

Yan-Hong Qu, Jia-Mei Yang, Qing-Xia Fan, Yue Zhou

Yan-Hong Qu, Jia-Mei Yang, Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Qing-Xia Fan, Yue Zhou, Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Correspondence to: Professor Jia-Mei Yang, Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China. qyh771012@163.com

Received: January 5, 2011
Revised: March 24, 2011
Accepted: April 11, 2011
Published online: April 18, 2011

Abstract

AIM: To investigate the role of annexin-2 (ANXA-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in promoting invasiveness of human liver cancer HepG2 cells .

METHODS: After HepG2 cells were treated with different doses of 5-fluorouracil, cell invasiveness was detected by Transwell assay, and the mRNA and protein expression of ANXA-2 and VEGF was detected by RT-PCR and Western blot, respectively.

RESULTS: The invasiveness of HepG2 cells decreased with the increase in the dose of 5-fluorouracil, with significant differences among cells treated with different doses of 5-fluorouracil (22 ± 5, 25 ± 4, 13 ± 2, 12 ± 2 vs 39 ± 7, all P < 0.05). The mRNA and protein expression of ANXA2 and VEGF in HepG2 cells decreased gradually with the increase in the dose of 5-fluorouracil (ANXA2 mRNA: 0.527 ± 0.008, 0.419 ± 0.046, 0.213 ± 0.007, 0.176 ± 0.007 vs 0.718 ± 0.008; ANXA2 protein: 0.669 ± 0.055, 0.484 ± 0.072, 0.180 ± 0.034, 0.099 ± 0.009 vs 1.236 ± 0.102; VEGF mRNA: 0.818 ± 0.016, 0.558 ± 0.101, 0.386 ± 0.009, 0.352 ± 0.017 vs 1.176 ± 0.035; VEGF protein: 0.960 ± 0.085, 0.962 ± 0.056, 0.376 ± 0.069, 0.219 ± 0.008 vs 1.124 ± 0.170, all P < 0.001). There were significant correlations between the mRNA and protein expression of ANXA2 and VEGF (r_p = 0.900, r_w = 0.856).

CONCLUSION: The expression of ANXA2 and VEGF in HepG2 cells decreased gradually with the increase in the dose of 5-fluorouracil. ANXA2 and VEGF may play an important role in the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma.

Key Words: Annexin-2; Vascular endothelial growth factor; Hepatocellular carcinoma; HepG2 cells; 5-fluorouracil

0 引言

肝癌为我国常见恶性肿瘤之一, 继甲胎蛋白以后, 尚未发现更好的指标指导临床肝癌早期诊断, 因此寻找特异性更高的肝癌早期临床诊断指标具有重要的临床意义. 很多研究表明膜联蛋白(annexin, ANXA)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在肿瘤的发展及远处转移中发挥重要作用, ANXA2是膜联蛋白家族中重要成员, 其在诸多肿瘤(大肠癌、肺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、白血病、多发性骨髓瘤、宫颈癌、甲状腺癌)的侵袭转移机制中发挥重要作用, 但是目前关于ANXA2在肝癌中表达的研究甚少. VEGF是体内最强的一种血管生成因子, 直接参与诱导肿瘤血管生成. VEGF及其受体VEGFR在肝癌癌组织中较正常肝组织表达明显增强, 在肝癌的生长、转移、复发中具有重要作用. 本文通过对ANXA2、VEGF在HepG2肝癌细胞系表达的研究, 探讨两者在肝细胞性肝癌中表达的相关性及意义.

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2肝癌细胞系、Hyclone胎牛血清、高糖DMEM(Gibco)、5-FU、Transwell相关试剂、RT-PCR试剂盒、Western blot相关试剂.

1.2 方法

1.2.1 Transwell检测细胞侵袭力: 24孔培养板中不同5-FU剂量(50、100、200、400 mg/L)干预培养, 每孔加入100 μL无血清培养液稀释的Matrigel, 4 ℃过夜; 饥饿12 h后消化细胞, 离心弃培养基, PBS清洗后无血清培养基重悬, 调至3×10⁸个/L; 以无血清培养基水化小室; 吸取400 μL细胞悬液加入上室; 下室加入小鼠成纤维细胞NIH3T3培养液600 μL趋化; 培养48 h; 4%多聚甲醛固定, 漂洗后HE染色、观察计数. 每个滤膜随机选取5个400倍视野, 计数, 按公式: 抑制率(%) = 对照组细胞数-干扰组细胞数/对照组细胞数×100%.

1.2.2 RT-PCR检测ANXA2和VEGF mRNA表达: 以5×10⁷/L接种细胞常规培养, 完全贴壁后不同剂量5-FU干预48 h后分别提取各组细胞总mRNA, 然后逆转录继而PCR扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 在紫外线投射分析仪下观察结果. D-140图像记录分析系统进行记录, Quantity One软件分析, 目的基因表达量以目的基因的DNA条带和β-actin的DNA条带灰度值比值表示.

1.2.3 Western blot检测ANXA2和VEGF蛋白表达: 收集不同5-FU剂量组细胞, 蛋白质提取, 制备SDS-PAGE, 加样、电泳、转膜. 封闭, 一抗、二抗孵育(第二抗体为羊抗兔), ECL显色、定影、拍照. 以β-actin作为内对照. 胶片扫描后用Bandscan5.0软件进行灰度分析.

统计学处理 SPSS17.0统计软件进行统计学分析处理, 数据采用mean±SD表示. 多组均数比较若满足正态性和方差齐性采用单因素方差分析, 若不满足采用非参数检验, 相关性分析若符合正态及残差正态采用Pearson相关, 若不符合采用Spearman相关. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 Transwell检测细胞侵袭力

随着5-FU剂量的逐渐增加, 细胞侵袭数逐渐下降, 各剂量组细胞侵袭数差异具有统计学意义(39±7 vs 22±5, 25±4, 13±2, 12±2; Hc = 33.676, P = 0.000).

2.2 RT-PCR检测ANXA2和VEGF mRNA表达

5-FU各剂量组的VEGF表达量及ANXA2表达量, 各剂量组间ANXA2表达量的差异具有明显统计学意义(Hc = 36.895, P = 0.000), 各剂量组间VEGF表达量的差异具有明显统计学意义(Hc = 36.713, P = 0.000, 表1). ANXA2的表达量与VEGF的表达量之间是完全正相关性(r_p = 0.975, 图1, 2).

表1 5-FU各剂量组的VEGF及ANXA2 mRNA的表达 (mean±SD).

分组	ANXA2表达量	VEGF表达量
对照组	0.718±0.008	1.176±0.035
50 mg/L	0.527±0.008	0.818±0.016
100 mg/L	0.419±0.046	0.558±0.101
200 mg/L	0.213±0.007	0.386±0.009
400 mg/L	0.176±0.007	0.352±0.017

ANXA2表达量: Hc = 36.895, P = 0.00; VEGF表达量: Hc = 36.713, P = 0.000.

图1 RT-PCR检测ANXA2和VEGF的表达. 1: 对照组; 2: 5-FU 50 mg/L; 3: 5-FU 100 mg/L; 4: 5-FU 200 mg/L; 5: 5-FU 400 mg/L.

图2 RT-PCR中ANXA2与VEGF表达量灰度值的相关性.

2.3 Western blot检测ANXA2和VEGF蛋白表达

5-FU各剂量组的VEGF表达量及ANXA2表达量, 各剂量组间ANXA2表达量的差异具有明显统计学意义(Hc = 10.500, P = 0.000), 各剂量组间VEGF表达量的差异具有明显统计学意义(Hc = 33.003, P = 0.000, 表2). ANXA2与VEGF的表达量之间是完全正相关性(r_w = 0.856, 图3, 4).

表2 5-FU各剂量组的VEGF及ANXA2蛋白的表达 (mean±SD).

分组	ANXA2表达量	VEGF表达量
对照组	1.236±0.102	1.124±0.170
50 mg/L	0.669±0.055	0.960±0.085
100 mg/L	0.484±0.072	0.962±0.056
200 mg/L	0.180±0.034	0.376±0.069
400 mg/L	0.099±0.009	0.219±0.008

ANXA2表达量: Hc = 10.500, P = 0.00; VEGF表达量: Hc = 33.003, P = 0.000.

图3 Western blot检测ANXA2及VEGF的表达. 1: 对照组; 2: 5-FU 50 mg/L; 3: 5-FU 100 mg/L; 4: 5-FU 200 mg/L; 5: 5-FU 400 mg/L.

图4 Western blot中ANXA2与VEGF表达量灰度值的相关性.

3 讨论

ANXA家族是一类钙依赖性膜磷脂结合蛋白, 参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动, 包括钙离子通道的形成、调控炎症反应、纤溶、胞吐、胞吞、细胞增殖、DNA修复合成、细胞分化与凋亡、细胞骨架活动、成骨细胞的形成和骨的重吸收、膜功能区的形成、信号转导等[1]. 广泛存在于核内、胞质、细胞质膜下、储Ca²⁺细胞器附近及细胞外基质中, 约占细胞总蛋白的2%. ANXA2又名P36、LIP2、LPC2等, 是家族中的一个重要成员, 具有Ca²⁺依赖性的RNA结合特性, 主要表达在人体内皮细胞、单核/巨噬细胞、神经细胞、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中, 在细胞中的表达水平受细胞周期的调控.

1990年, Frohlich首次报道ANXA2表达增高与肝癌发生有关, 且能促进肝癌的侵袭转移[2,3], 其在肝癌(包括肝细胞性和胆管型)[4]、胃癌、乳腺癌、胰腺癌[5,6]、肾细胞癌[7]、肺癌、结肠癌[8]、人类神经胶质瘤[9,10]、甲状腺癌[11,12]、宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌[13]、脑癌、幽门螺杆菌感染患者[14]、多发性骨髓瘤[15]及排卵过程[16]表达明显上调, 且与淋巴结、远处转移相关; 而在前列腺癌、食管癌及头颈部鳞状细胞癌组织中表达下调, 在前列腺癌中去甲基药物作用可恢复其mRNA表达, 故高甲基化可能是基因沉默的原因, 但其对前列腺癌仍然具有促进作用[17].

ANXA2在胞外的主要作用是作为纤溶受体, ANXA2与S100家族成员[18](S100A10、S100A4)、纤溶酶原(plasminogen, PLG)、组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)、腱生蛋白C(抗黏附作用)、组织蛋白酶B、VEGF等相互作用, 使他们在肿瘤细胞表面共区域化, 介导tPA依赖的纤溶酶的产生, 激活蛋白酶前体, 活化基质金属蛋白酶、细胞外基质的重塑及蛋白质水解、新血管形成, 促进肿瘤细胞浸润转移[19-21].

VEGF是目前发现唯一特异性作用于血管内皮细胞的生长因子, 直接参与诱导肿瘤血管生成[22], 可以激活血管内皮细胞基因, 增强尿激酶型纤溶酶原激活物(urine plasminogen activator, uPA)和tPA的表达, 进而诱导蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子的产生来促进血管的形成. 用VEGF处理人脐静脉内皮细胞后, ANXA2的表达量升高[23], 这一相关性提示ANXA2可能参与了VEGF的血管形成机制.

本实验在各剂量组中, 随着5-FU剂量的增加, HepG2肝癌细胞的侵袭力及ANXA2、VEGF的表达逐渐下降且两者具有明显正相关性, 在肝细胞癌中ANXA2、VEGF可能对肝癌细胞的侵袭转移起着协同促进作用, 提示5-FU抑制肝癌细胞, 可能是通过ANXA2、VEGF发挥作用, 与MMP家族、S100家族、PLG、tPA、uPA、组织蛋白酶B、腱生蛋白C等相互作用, 共同促进肿瘤新血管的生成及肿瘤的转移. 总之, 推测ANXA2在肝细胞癌中可能起着中心调节或者关键角色, 为阐明肿瘤侵袭转移分子机制、分子靶向治疗及预后评估方面, 提供了新思路, 有望成为判断肝癌临床分期及预后的新指标, 对指导临床诊治具有深远意义. 我们将在以后的研究中用重组ANXA2、VEGF或者慢病毒转染及基因沉默等方法进一步研究ANXA2、VEGF高表达或者低表达对肝癌细胞转移能力的影响, 进而使肿瘤转移的分子机制更加明确.

评论

背景资料

Annexin家族是一类钙依赖性膜磷脂结合蛋白, 主要参与膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动; VEGF是目前发现唯一特异性作用于血管内皮细胞的生长因子, 直接参与诱导肿瘤血管生成, 两者在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用.

同行评议者

李旭, 副教授, 广东省广州市南方医院急诊科

研发前沿

肿瘤细胞转移机制是目前肿瘤学研究的热点, ANXA2是ANXA家族中研究比较深入的重要成员, 在胞外的主要作用是作为纤溶受体, 在多种肿瘤细胞的转移机制中扮演重要的角色, 但是目前ANXA2在肿瘤细胞转移中的具体分子机制尚未明了.

创新盘点

目前国内外关于ANXA2在肝癌中表达的研究甚少, 本研究通过Transwell、RT-PCR、Western blot等研究方法, 从细胞侵袭力、mRNA、蛋白质表达等方面分析讨论ANXA2、VEGF在肿瘤转移机制中的作用.

应用要点

随着5-FU剂量的逐渐增加, HepG2肝癌细胞侵袭率及ANXA2、VEGF表达量逐渐下降, 两者呈显著正相关, 提示两者在肝癌细胞的侵袭转移机制中可能起重要作用.

同行评价

本文选题较好, 设计合理, 为肝癌的治疗奠定实验基础.

备注

编辑:李薇 电编:何基才

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