临床研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-02-08; 18(4): 355-360
在线出版日期: 2010-02-08. doi: 10.11569/wcjd.v18.i4.355
肿瘤-睾丸抗原MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在胃肠间质瘤中的表达
赖斌, 朱培谦, 朱胜昌, 罗洪亮
赖斌, 朱培谦, 罗洪亮, 南昌大学第二附属医院胃肠外科 江西省南昌市 330006
朱胜昌, 宜春市人民医院普外科 江西省宜春市 336000
赖斌, 南昌大学医学院硕士, 主要从事胃肠外科基础与临床研究.
作者贡献分布: 赖斌与朱培谦对此文所作贡献均等; 此课题在朱培谦指导下由赖斌设计; 实验过程由赖斌与罗洪亮共同完成; 数据分析由赖斌、罗洪亮及朱胜昌完成; 本文撰写由赖斌与朱培谦完成.
通讯作者: 朱培谦, 教授, 330006, 江西省南昌市, 南昌大学第二附属医院胃肠外科. zhupeiqian@163.com
电话: 0791-6298907
收稿日期: 2009-11-25
修回日期: 2009-12-27
接受日期: 2009-12-29
在线出版日期: 2010-02-08

目的: 探讨肿瘤-睾丸抗原(CTA)MAGE-1和NY-ESO-1作为胃肠间质瘤(GISTs)免疫治疗特异性靶点及MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA作为辅助GISTs危险度分级指标的可能性, 及其与GISTs生物学行为的关系.

方法: 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术, 检测30例GISTs中MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA的表达, 并取正常胃肠道组织作为阴性对照组, 同时分析MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达与病理特征的关系.

结果: 正常对照组中无阳性表达, 30例GISTs中, 18例至少表达一种CTA, MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs中的表达率分别为30%和47%. MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达与患者年龄、性别和病理类型无关, 而与肿瘤生长部位、肿瘤大小及危险度分级有关(P<0.05). MAGE-1 和NY-ESO-1 mRNA在低危、中危、高危三个组中表达量随着危险度分级的升高而增高, 三组间差异有统计学意义(P<0.05). MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs中的表达不存在相关性(r = 0.018, P>0.05).

结论: MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs中的高特异性表达, 其抗原有望成为GISTs免疫治疗特异性的靶点; MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达与GISTs危险度分级有关, MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA有望成为辅助GISTs危险度分级的诊断指标.

关键词: 胃肠道间质瘤; 肿瘤-睾丸抗原; 逆转录-聚合酶链反应; MAGE-1; NY-ESO-1
引文著录: 赖斌, 朱培谦, 朱胜昌, 罗洪亮. 肿瘤-睾丸抗原MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在胃肠间质瘤中的表达. 世界华人消化杂志 2010; 18(4): 355-360
Clinical implications of expression of MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNAs in gastrointestinal stromal tumors
Bin Lai, Pei-Qian Zhu, Sheng-Chang Zhu, Hong-Liang Luo
Bin Lai, Pei-Qian Zhu, Hong-Liang Luo, Department of Gastrointestinal Surgery, the Second Affiliated Hospital to Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Sheng-Chang Zhu, Department of General Surgery, the People's Hospital of Yichun City, Yichun 336000, Jiangxi Province, China
Correspondence to: Professor Pei-Qian Zhu, Department of Gastrointestinal Surgery, the Second Affiliated Hospital to Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China. zhupeiqian@163.com
Received: November 25, 2009
Revised: December 27, 2009
Accepted: December 29, 2009
Published online: February 8, 2010

AIM: To evaluate the possibility of using melanoma antigen-1 (MAGE-1) and New York-esophageal-1 (NY-ESO-1) antigens as specific targets for immunotherapy of gastrointestinal stromal tumors (GISTs) and using MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNA levels as auxiliary parameters for risk classification of GISTs.

METHODS: The expression of MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNAs was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) in 30 GIST tissue specimens. The correlation of MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNA expression with pathological parameters was analyzed in GISTs.

RESULTS: The positive rates of MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNA expression in GIST specimens were 30% and 47%, respectively. At least one of these two cancer-testis antigens (CTAs) was detected in 18 GIST tissue specimens. The expression of MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNAs was not correlated with age, sex or pathologic type (P > 0.05), but correlated with tumor site, tumor diameter and risk grade (all P < 0.05). The expression levels of MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNAs in GISTs of high risk grade were significantly higher than those in GISTs of low risk grade (P < 0.05). No negative correlation was noted between the expression of MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNAs in GISTs (r = 0.018, P > 0.05).

CONCLUSION: MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNAs are expressed specifically in GIST tissue and may be potentially promising targets for antigen-specific immunotherapy of GISTs. The expression of MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNAs is correlated with the risk grade of GISTs. MAGE-1 and NY-ESO-1 mRNA levels are promising auxiliary parameters for risk classification of GISTs.

Key Words: Gastrointestinal stromal tumors; Cancer-testis antigen; Reverse transcription-polymerase chain reaction; Melanoma antigen-1; New York-esophageal-1
0 引言

胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumors, GISTs)是一种具有恶性潜能, 同时也是消化系最常见的间叶源性肿瘤. 近年研究发现, GISTs可能起源于胃肠道Cajal间质细胞(interstital cells of Cajal, ICC)或胃肠道ICC与平滑肌细胞共同起源的原始细胞, 其特征性改变是原癌基因c-kit功能获得性改变和蛋白产物CD117的表达[1,2]. 肿瘤-睾丸抗原(cancer-testis antigen, CTA)在多种肿瘤组织中表达, 但在正常组织中表达仅限制于睾丸和胎盘组织[3]. 由于CTA这种与肿瘤相关的特异性表达方式, 使其成为特异性免疫治疗的理想靶分子. CTA在GISTs中的表达情况, 国内尚未见文献报道. 我们应用RT-PCR法检测CTA在GISTs中的表达, 旨在为GISTs的特异性免疫治疗提供分子理论依据, 并探讨其作为辅助GISTs危险度分级指标的可能性.

1 材料和方法
1.1 材料

2008-2009年南昌大学第二附属医院胃肠外科提供的资料完整、诊断明确的GISTs新鲜肿瘤标本30例, 其中男17例, 女13例, 发病年龄31-78(平均55.7±3.6)岁; 胃间质瘤18例, 肠间质瘤12例; 梭形细胞型19例, 上皮细胞型7例, 混合细胞型4例; 按肿瘤最大径可分为<5.0 cm组6例, 5.0-10.0 cm组10例, >10.0 cm组14例; 按NIH推荐的Fletcher分级标准[4]分为低危组6例, 中危组10例, 高危组14例. 所有患者均经手术切除治疗, 且术前均未接受化疗和放疗. 同时收取正常胃肠道组织作为阴性对照组, 收取南昌大学第二附属医院泌尿外科提供的睾丸组织作为阳性对照组. 引物由江西省南昌东湖生物公司设计并合成, TRIzol及RT-PCR试剂盒购于Fermentas公司.

1.2 方法

总RNA提取按照TRIzol试剂说明书的操作步骤进行, RNA提取后均经电泳鉴定. 逆转录步骤按试剂盒进行, 合成cDNA后以内参照β-actin进行PCR反应. PCR反应条件及引物序列见表1. PCR产物全部加入10 g/L低熔点琼脂糖凝胶进行电泳检测. 利用Bandleader 3.0软件分析PCR产物条带密度. 基因表达值以(目的基因密度值/β-actin基因密度值)×100%表示, 进行半定量数据分析处理.

表1 CTA基因扩增引物序列及PCR反应条件.
基因引物序列3'-5'PCR反应条件循环产物(bp)
T(℃)t(min)T(℃)t(min)T(℃)t(min)
NY-ESO-1CAGGGCTGAATGGATGCTGCAGA94160172135332
GCGCCTCTGCCCTGAGGGAGG
MAGE-1CTGTTCCTGTATCCTCACC94172172235171
GACTCACACTACCTCCAC
β-actinGGTACGGGTGTAGTGCGGGACCACGGACC94156172124580
CTGAAGCTCGTTCTCTACCGGTGC

统计学处理 所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析. 计量资料以mean±SD, 采用t检验, 计数资料采用χ2检验, 以P<0.05为有统计学意义.

2 结果
2.1 MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs组织中的表达

正常对照组中无阳性表达, 阳性率为0%(0/20), 30例GISTs中, 18例至少表达一种CTA, 阳性表达率为60%(18/30), 两者具有显著性差异(P<0.01), 说明MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs组织中高度表达. 其中MAGE-1 mRNA阳性表达率为30%(10/30), 与正常对照组有显著差异(P<0.01), NY-ESO-1 mRNA阳性表达率为47%(14/30), 与正常对照组有显著差异(P<0.01).

2.2 MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA的表达与GISTs病理特征的关系

MAGE-1 mRNA表达与性别、年龄和病理类型无关(P>0.05, 表2). 与肿瘤生长部位、肿瘤大小和危险度分级有关(P<0.05, 表2). NY-ESO-1 mRNA表达与性别、年龄和病理类型无关(P>0.05, 表2). 与肿瘤生长部位、肿瘤大小和危险度分级有关(P<0.05, 表2).

表2 MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA的表达与GISTs病理特征的关系.
病理特征nMAGE-1的表达
NY-ESO-1的表达
阳性n(%)χ2值P值阳性n(%)χ2值P值
性别0.0681.0000.0020.961
男176(35)8(47)
女134(31)6(46)
年龄(岁)0.0001.0000.0890.765
<55124(33)6(50)
≥55186(33)8(44)
病理类型2.7290.2550.0620.969
梭形细胞型198(42)9(47)
上皮细胞型72(29)3(43)
混合细胞型40(0)2(50)
部位5.6250.0456.4510.011
胃183(17)5(28)
肠127(58)9(75)
肿瘤大小(cm)7.3710.0256.7350.034
<560(0)1(17)
5-10102(20)3(30)
>10148(57)10(71)
危险度分级7.3710.0256.7350.034
低危组60(0)1(17)
中危组102(20)3(30)
高危组148(57)10(71)
2.3 MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达的半定量结果

MAGE-1和NY-ESO-1的RT-PCR产物电泳结果示扩增片段分别为171 bp和332 bp, 与预期设计的目的片段相同, MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs组织中均有高度表达, 而在正常组织中未发现其表达, 且MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达均与GISTs危险度分级有关(图1). MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在低危、中危、高危3个组中表达量随着危险度分级的升高而增高, 3组间差异有统计学意义(P<0.05, 表3).

图1
图1 GISTs各危险度分级组中MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达. A: MAGE-1 mRNA; B: NY-ESO-1 mRNA; 1: Marker; 2: 阳性对照组; 3: 低危组; 4: 中危组; 5: 高危组; 6: 正常对照组.
表3 GISTs各危险度分级组中MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达量 (mean±SD).
分组nMAGE-1 mRNANY-ESO-1 mRNA
低危组60.10±0.01a0.41±0.01c
中危组100.50±0.020.60±0.01
高危组140.81±0.010.89±0.01
aP<0.05, t = 2.331;
cP<0.05, t = 1.706 vs 中危组, 高危组.
2.4 MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs组中表达的相关性

30例GISTs组织中MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA共阳性表达6例(6/30), 两者表达不存在明显相关性(r = 0.018, P>0.05, 表4).

表4 GISTs组中MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达的关系.
MAGE-1NY-ESO-1
r值P值
+-
+640.1890.317
-812
3 讨论

目前GISTs的治疗倾向于外科治疗与甲磺酸伊马替尼的联合应用. 其中外科手术切除是其主要治疗方法. 完整切除肿瘤及切缘阴性是外科切除治疗的基本标准. 此外以甲磺酸伊马替尼为代表的靶向治疗药物开启了GISTs治疗新时代. 甲磺酸伊马替尼治疗GISTs的主要适应证是c-kit基因突变和CD117阳性的病例, 尤其是c-kit基因11号外显子突变者, 而对PDGFRA 18号外显子有突变者, 则效果不佳[5-7]. 但甲磺酸伊马替尼最大的问题是相当一部分病例服药3年以上均出现不同程度耐药, 当出现耐药时是继续服药, 还是加量或改用多靶点药物, 或继续寻求外科手术, 目前尚无统一的意见.

除了手术和甲磺酸伊马替尼, 免疫治疗在肿瘤综合治疗中同样占有重要地位, 这是因为免疫治疗除了可以直接杀伤已有的肿瘤细胞外, 还可以通过提高机体免疫能力来及时杀灭新产生的肿瘤细胞. CTA抗原基因编码的肿瘤相关抗原能在多种肿瘤组织中表达, 但在正常组织中表达仅限制于睾丸和胎盘组织. 虽然Chen等[8]的研究发现CTA的异位表达能引发自体免疫反应. 但精原细胞不表达位于细胞表面的HLAⅠ类和Ⅱ类抗原, 所以CTA引发的自体免疫反应不会造成自身的损伤[9]. 由于CTA的这个优点, 使CTA成为特异性免疫治疗的理想靶点. CTA是包含MAGE、NY-ESO-1、SSX、LAGE等的一个基因大家族. MAGE由van der Bruggen等[10]于1991年首次在黑色素瘤细胞中成功分离出, 并通过特异性细胞毒性T细胞识别MAGE基因的表达产物, 特异性杀伤肿瘤细胞. 而NY-ESO-1由Chen等[11]在1997年在一食管鳞状细胞癌中患者中发现. 随后的一系列研究显示NY-ESO-1可能是目前已发现的免疫原性最强的抗原之一, 使其成为NY-ESO-1阳性肿瘤最有效的免疫治疗靶点[12-16]. 我们的研究发现: 在GISTs组织中, MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA基因均有高度表达, 表达率分别达到30%和47%. 因此以MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA为靶点的多肽疫苗开发, 有望使特异性免疫治疗成为继手术和甲磺酸伊马替尼外, GISTs重要的辅助治疗手段.

GISTs被普遍认为是具有不同恶性潜能的肿瘤, 因此对GISTs危险程度的准确分级, 不仅关系到预后的判断, 更为重要的是, 还能指导术后如何正确联合甲磺酸伊马替尼进行辅助治疗. 目前对于GISTs危险程度的准确分级, 尚无统一意见. 现在广泛采用的是美国国立卫生院(NIH)推荐的Fletcher分级标准[4]: 即按肿瘤的大小和核分裂相数将GISTs分为极低危、低危、中危和高危4个等级. 但史恩溢等[17]认为按此标准, 一方面过高地评估了约4%的非恶性患者, 另一方面又过低地评估了约17%的恶性患者, 且对恶性GISTs的分级也欠准确. 同时美国陆军研究所(AFIP)的1项研究表明: 在肿瘤大小和核分裂相数相似的情况下, 小肠间质瘤恶性生物学潜能明显比胃间质瘤更高[18,19]. 因此GISTs治疗指南(2007版)关于GISTs危险因素分级新增了肿瘤部位的因素, 认为上消化系的肿瘤较下消化系肿瘤的危险程度低, 即Miettinen新分级标准[20,21]. 尽管Miettinen新分级标准比Fletcher分级标准更能准确反应GISTs危险程度, 但实际工作中, 仍有一小部分GISTs不能按此标准准确分级. 能否引入一特异性高, 又方便检测的临床指标辅助GISTs危险因素分级值得研究. Perez等[22]应用免疫组织化学方法检测了CTA在35例GISTs中的表达, 结果显示: 高危组CTA的表达明显高于中、低危组, 并认为CTA能作为一个新的独立指示预后的指标. 我们的研究同样发现: MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs组织中有高度表达, 且MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达均与GISTs危险度分级有关. MAGE-1 mRNA的表达由低危组的无表达, 上升到中危组的20%和高危组的57%, 同样, NY-ESO-1 mRNA的表达由低危组的17%, 上升到中危组的30%和高危组的71%, 说明MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA抗原可能参与了疾病的发展. 同时经RT-PCR半定量检测, MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在各危险度分级组中表达量均随危险程度升高而增高, 这使MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA有望成为辅助GISTs危险因素分级的检测指标. 在12例肠间质瘤中, MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA的表达分别达到了58%和75%, 两者均高于其在胃间质瘤中的表达(17%, 28%), 这也在一定程度上说明肠间质瘤的恶性程度高于胃间质瘤. 此外, 在MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA同时表达的6例GISTs中, 5例属于高危组, 说明随着疾病的发展, MAGE-1和NY-ESO-1表现出聚集表达的趋势, CTA抗原的这种聚集表达为研究CTA抗原疫苗的应用提供了可能性. 但我们也发现, MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA的表达率略高于Perez等的免疫组织化学结果. CTA基因与蛋白在GISTs中的表达关系及其在GISTs发生、发展中的作用有待于我们进一步的研究与证实.

评论
背景资料

近年来许多研究表明, 肿瘤睾丸抗原基因编码的肿瘤相关抗原在多种肿瘤中均有较高的表达, 同时在除睾丸和胎盘外的正常组织中不表达, 是特异性免疫治疗的理想靶分子, 因此肿瘤睾丸抗原已成为多肽疫苗研发的最有希望的一类抗原.

同行评议者

田晓峰, 教授, 大连医科大学附属第二医院普通外科; 李淑德, 主任医师, 中国人民解放军第二军医大学长海医院消化内科

研发前沿

肿瘤-睾丸抗原在多种恶性肿瘤中的表达情况, 国内外有大量文献报道, 但其在胃肠道间质瘤中的表达, 国内外报道罕见.

相关报道

Perez等在2008年首次报道了肿瘤-睾丸抗原在胃肠道间质瘤中的表达情况, 并指出肿瘤-睾丸抗原可作为一个新的独立指示预后的指标.

创新盘点

目前尚未见运用RT-PCR法检测胃肠道间质瘤中肿瘤-睾丸抗原表达情况的报道, 本研究不仅分析肿瘤-睾丸抗原表达与临床病理的关系, 还运用RT-PCR半定量分析胃肠道间质瘤各危险度分级组间表达的差异情况.

应用要点

以肿瘤-睾丸抗原MAGE-1和NY-ESO-l为靶点的多肽疫苗开发, 有望使特异性免疫治疗成为继手术和甲磺酸伊马替尼外, GISTs重要的辅助治疗手段. 此外, MAGE-1和NY-ESO-1基因在各危险度分级组中表达量均随危险程度升高而增高, MAGE-1和NY-ESO-1有望成为辅助GISTs危险因素分级的检测指标.

同行评价

本文新颖性强, 具有较好的临床参考价值.

编辑:李军亮 电编:何基才

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