基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-02-08; 18(4): 350-354
在线出版日期: 2010-02-08. doi: 10.11569/wcjd.v18.i4.350
维药西帕依溃结安在大鼠溃疡性结肠炎模型中对iNOS基因表达的影响
黄静静, 库热西·玉努斯, 贺捷, 倪群, 陈艳, 马文静, 哈木拉提·吾甫尔
黄静静, 库热西·玉努斯, 新疆医科大学基础医学院生物化学教研室 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
贺捷, 新疆医科大学基础医学院机能中心 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
倪群, 陈艳, 马文静, 新疆医科大学厚博学院 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
哈木拉提·吾甫尔, 新疆地方病分子生物学实验室 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
黄静静, 2007新疆医科大学生物化学与分子生物学硕士, 讲师, 主要从事维吾尔医药与分子生物学研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30460163.
作者贡献分布: 此课题由库热西·玉努斯设计; 研究过程由黄静静、贺捷、倪群、陈艳及马文静共同完成; 哈木拉提·吾甫尔提供维医药的理论指导; 研究所用新试剂及分析工具由库热西·玉努斯提供; 数据分析由黄静静完成; 本论文写作由黄静静与贺捷完成.
通讯作者: 哈木拉提·吾甫尔, 教授, 830011, 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市, 新疆地方病分子生物学实验室. halmurat@263.net
电话: 0991-4366176
收稿日期: 2009-12-01
修回日期: 2009-12-30
接受日期: 2010-01-04
在线出版日期: 2010-02-08

目的: 检测维药西帕依溃结安对大鼠溃疡性结肠炎模型中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达的影响, 探讨药物的可能作用机制.

方法: 采用2, 4-二硝基氯苯(DNCB)复合乙酸法构建溃疡性结肠炎大鼠模型, 建立维药西帕依溃结安大、中、小剂量干预组及生理盐水阴性对照组(NS组), 应用半定量RT-PCR和Western blot方法检测各组中iNOS mRNA和蛋白质的表达水平.

结果: 与NS组相比, 维药西帕依溃结安各干预组iNOS mRNA表达水平无统计学意义, iNOS蛋白表达水平下调, 差异有统计学意义(0.44±0.40 vs 1.00±0.07, P<0.05).

结论: 维药西帕依溃结安治疗溃疡性结肠炎可能是通过在转录后水平上调节iNOS的表达而发挥作用.

关键词: 维药西帕依溃结安; 溃疡性结肠炎; 诱导型一氧化氮合酶
引文著录: 黄静静, 库热西·玉努斯, 贺捷, 倪群, 陈艳, 马文静, 哈木拉提·吾甫尔. 维药西帕依溃结安在大鼠溃疡性结肠炎模型中对iNOS基因表达的影响. 世界华人消化杂志 2010; 18(4): 350-354
Xipayi Kui Jie'an downregulates iNOS expression in rat ulcerative colitis
Jing-Jing Huang, Kurexi•Yunusi, Jie He, Qun Ni, Yan Chen, Wen-Jing Ma, Hamulati•Wufuer
Jing-Jing Huang, Kurexi•Yunusi, Department of Biochemistry, Basic Medical College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Jie He, Center of Medical Functional Experiment, Basic Medical College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Qun Ni, Yan Chen, Wen-Jing Ma, Houbo College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Hamulati•Wufuer, Xinjiang Laboratory of Molecular Biology of Endemic Diseases, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30460163.
Correspondence to: Professor Hamulati•Wufuer, Xinjiang Laboratory of Molecular Biology of Endemic Diseases, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China. halmurat@263.net
Received: December 1, 2009
Revised: December 30, 2009
Accepted: January 4, 2010
Published online: February 8, 2010

AIM: To investigate the effects of Uygur medicine Xipayi Kui Jie'an on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene in rat ulcerative colitis and explore possible mechanisms involved.

METHODS: A rat model of ulcerative colitis was established using 2, 4-dinitrochlorobenzene (DNCB) and acetic acid. The UC rats were divided into four groups: normal saline (NS) group and low-, medium- and high-dosage Xipayi Kui Jie'an treatment groups. The expression of iNOS mRNA and protein was detected using semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot, respectively.

RESULTS: No significant differences were noted in the expression levels of iNOS mRNA between the Xipayi Kui Jie'an treatment groups and the NS group. In contrast, the expression level of iNOS protein was down-regulated in the high-dosage Xipayi Kui Jie'an treatment group when compared to the NS group (0.44 ± 0.40 vs 1.00 ± 0.07, P < 0.05).

CONCLUSION: Xipayi Kui Jie'an exerts therapeutic action against UC in rats perhaps by downregulating iNOS expression at the post-transcription level.

Key Words: Xipayi Kui Jie'an; Ulcerative colitis; Inducible nitric oxide synthase
0 引言

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)也称慢性非特异性溃疡性结肠炎, 是一种病因不明的慢性肠道炎症, 病变主要累及黏膜层及黏膜下层, 以溃疡、糜烂为主, 多累及直肠和远端结肠. 临床上以腹泻、腹痛、黏液脓血便和里急后重等为主要表现. 该病病程长, 病情轻重不一, 呈反复发作, 近年来发病率有明显增加趋势[1,2], 并与结肠癌关系密切, 已被世界卫生组织列为难治病之一. 新疆维吾尔医药西帕依溃结安在治疗肠道炎症方面疗效确切[3], 但其作用机制尚不清楚. 我们在前期研究中已应用2, 4-二硝基氯苯(2, 4-dinitrochlorobenzene, DNCB)与乙酸复合法诱导了大鼠溃疡性结肠炎模型, 其症状、结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分和组织病理学改变都表明模型建立成功, 同时半定量RT-PCR结果显示模型中炎症相关因子核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的mRNA表达水平均有增高[4-6], 提示他们可能参与了UC的发生发展, 与众多文献报道相一致[7-9]. 为明确药物作用的分子机制, 本研究在前期研究基础上应用维药西帕依溃结安对溃疡性结肠炎大鼠进行干预, 以iNOS为候选基因, 检测药物对iNOS的mRNA及蛋白质表达水平的影响从而探讨药物的可能作用机制, 为临床治疗提供理论及实验依据.

1 材料和方法
1.1 材料

健康SPF级Wistar大鼠, ♂, 体质量200-250 g, 由新疆医科大学实验动物中心提供. RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司, 异丙醇、乙醇购自MERCK公司, 氯仿为国产光谱纯, 逆转录试剂盒、PCR试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司, 引物借助Primer 5.0软件设计, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成. iNOS一抗和β-actin一抗均购自Santa Cruz公司, 辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗为北京中杉金桥公司产品. DNCB、丙酮、乙酸等试剂均为国产分析纯. 维药西帕依溃结安由新疆维吾尔医研究所提供.

1.2 方法

1.2.1 动物处理及分组: 参照文献构建UC模型[10]: 大鼠先适应性喂养1 wk, 颈背部脱毛, 每天用2%的DNCB丙酮液滴背, 每次5滴, 连用14 d, 于第15天用直径3 mm的导管(导管头端3 cm打孔, 使液体均匀分布于结肠)经肛门插入大鼠结肠内8 cm左右注入0.1%的DNCB乙醇液0.25 mL, 第16天同法灌体积分数为5%的乙酸2 mL, 作用15 s后立即注入生理盐水5 mL冲洗, 以消除乙酸的作用(灌肠前禁食24 h, 自由饮水). 灌肠7 d后按完全随机法将大鼠分为生理盐水阴性对照、维药西帕依溃结安大、中、小剂量干预共4组, 分笼喂养, 开始药物干预, 用直径3 mm的导管经肛门插入大鼠结肠内5-8 cm左右分别注入: 生理盐水2.25 mL/(100 g•d)、维药西帕依溃结安225 mg/(kg•d)、150 mg/(kg•d)、75 mg/(kg•d), 治疗20 d后脱颈椎处死大鼠, 取距肛门5-8 cm的结肠组织, 分别留取RT-PCR和Western blot标本, 液氮冷冻后-80 ℃冰箱冻存.

1.2.2 半定量RT-PCR检测iNOS mRNA表达水平: 总RNA的提取采用经典的TRIzol法, 经琼脂糖凝胶电泳、浓度和纯度鉴定后, 取1.0 μg总RNA以Oligo-(dT)18为引物将mRNA逆转录成cDNA, 反应体系20 μL, 操作按试剂盒说明书进行. 以1 μL cDNA做模板, 对大鼠iNOS基因进行扩增, PCR反应体系50 μL, 以β-actin为内参照, 引物序列: iNOS[11]上游5'-CCACATCTGGCAGGATGAGAA-3', 下游5'-AGGCACAGAACTGAGGGTACA-3', β-actin上游5'-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3', 下游5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3', 扩增产物长度分别为416 bp和445 bp. PCR反应参数: 94 ℃预变性4min; 94 ℃变性40 s、56 ℃ iNOS(61 ℃ β-actin)复性30 s、72 ℃延伸45 s, 循环35次; 72 ℃总延伸7 min. 将PCR产物在含溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶上电泳, 采用Bio-Rad凝胶成像仪分析系统根据电泳条带的面积和亮度计算出每个条带的积分光密度. 以待测因子iNOS的光密度对同一标本β-actin(内参照)光密度的比值表示iNOS mRNA的表达水平.

1.2.3 半定量Western blot检测iNOS蛋白表达水平: 将结肠组织标本按1:5质量比例加入细胞裂解液, 冰上匀浆, 裂解后离心, 取上清. 用BCA(bicinchoninic acid)比色法检测样品蛋白浓度后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(上样60 μg), 电泳结束后将蛋白电转移至NC膜上, 丽春红S染色鉴定, 根据Marker剪下相应的iNOS(130 kDa)和β-actin(43 kDa)蛋白条带, 洗去丽春红, 以50 g/L脱脂奶粉4 ℃封闭过夜, 洗膜后分别加入iNOS的兔mAb(1:100)、β-actin的山羊mAb(1:200)4 ℃孵育12 h, 洗膜后分别加入结合有HRP标记的抗兔二抗(1:4 000)、抗山羊二抗(1:5 000)4 ℃孵育12 h, 洗膜后于暗室中将杂交膜放入已混匀的ECM化学发光剂中, 反应1 min后曝光、显影、定影, 使目的蛋白印迹于X光胶片上. 采用Image Tool凝胶图像分析系统对X光胶片扫描分析, 根据蛋白条带的面积和灰度计算出每个条带的积分光密度. 以每组iNOS表达的面积灰度值对同一标本β-actin(内参照)表达的面积灰度值的比值表示iNOS蛋白表达水平.

统计学处理 数据采用SPSS15.0统计软件处理. 半定量RT-PCR结果: 数据方差齐, 进行完全随机设计资料的方差分析, 采用Dunnett法比较药物干预组与NS阴性对照组间iNOS mRNA的表达差异; 半定量Western blot结果: 数据方差不齐, 经数据变换后仍采用上述方法比较药物干预组与NS阴性对照组间iNOS蛋白的表达差异, 检验标准α = 0.05.

2 结果
2.1 iNOS mRNA的表达

与NS组相比, 维药西帕依溃结安各干预组iNOS mRNA表达差异未显示出统计学意义(图1, 表1).

表1 各实验组中iNOS mRNA及蛋白的表达 (mean±SD).
分组niNOS mRNAiNOS蛋白
NS组180.651±0.3831.00±0.07
大剂量干预组210.613±0.1800.44±0.40a
中剂量干预组190.494±0.2230.56±0.49
小剂量干预组220.867±0.3100.87±0.36
aP<0.05 vs NS组.
图1
图1 结肠组织中iNOS mRNA的表达. 1: DNA Marker; 2: iNOS(416 bp); 3: β-actin(445 bp).
2.2 iNOS蛋白的表达

与NS组相比, 维药西帕依溃结安大剂量干预组iNOS蛋白表达水平有下调, 差异有统计学意义(图2, 表1).

图2
图2 结肠组织中iNOS、β-actin蛋白的表达.
3 讨论

溃疡性结肠炎属炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)中的一种, 其病因和发病机制尚不清楚, 一般认为是由遗传、环境、免疫等因素相互作用而引起的一种以肠道炎症为主要表现的慢性疾病, 其中炎症介质起重要作用[12], 尤其是炎症前因子与抗炎因子之间的平衡失调被视为溃疡性结肠炎的一个重要发病机制[13,14].

维吾尔医学理论认为结肠炎的病变产生是由于浅黄色胆液质所致[3], 即体液失平衡, 这不仅与上述免疫失衡机制相吻合, 而且其治疗UC的药物(维药西帕依溃结安)一方面可调节体液失衡, 另一方面他的主要成分没食子(turkish galls)历来被视为是治疗各种急、慢性炎症的良药. 没食子所含的没食子鞣质和没食子酸具有固涩、收敛、燥湿、止血、消炎、镇痛、抗免疫、抗腹泻等作用, 主要用于大肠虚滑、泻痢不止、习惯性肠炎、便血、牙龈松弛、牙周炎等的治疗[15]. 众多研究也已证实维药西帕依溃结安确实具有很强的抗炎、清除氧自由基、调节免疫、抗血小板聚集、抗菌等作用[16,17], 在治疗肠道炎症方面疗效确切[3].

NO作为一种新型免疫分子和炎症介质, 同时也是一种自由基, 具有活泼的生化性质, 在消化、循环、免疫等多系统的生理、病理过程中起重要作用, 是目前研究的热点. 他由精氨酸分解产生, 体内催化此反应的一氧化氮合酶(NOS)有四种同工酶: 神经型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)、诱导型NOS(iNOS)和新发现的线粒体型NOS(mtNOS)[18], 其中与炎症关系密切的是iNOS. iNOS本身是一个静止的基因, 正常情况下不表达, 在免疫反应或炎症时可被一些细胞因子(NF-κB、IL-1、IFN-γ、TNF-α)和内毒素(LPS)等激活合成过量的NO, 有促炎、促氧化、促自由基生成、促DNA损伤的作用[19]. 对于肠道组织, NO是近年来发现的重要的气体信号分子和神经递质, 他不仅能通过趋化作用削弱肠黏膜的屏障功能、启动炎症反应, 而且能降低肠道平滑肌的兴奋性, 使肠道内容物在肠道长时间滞留引起肠梗阻、肠炎[20-22]. 同时, 众多研究表明NO与UC的发生、发展、甚至癌变过程密切相关[23,24].

鉴于维药西帕依溃结安的抗炎、抗氧化及清除自由基作用与NO的作用相拮抗, 同时由于NO在生物体内含量低、半衰期极短, 他的结构也不稳定, 很难准确测定其含量, 所以本研究将维药与动物模型相结合, 通过检测药物对iNOS mRNA和蛋白表达水平的影响反映药物对NO合成的影响, 探讨药物的可能作用机制. 研究结果显示维药西帕依溃结安大剂量干预组与NS组相比iNOS蛋白表达水平有下调, 差异有统计学意义(0.44±0.40 vs 1.00±0.07, P<0.05). 提示维药西帕依溃结安治疗溃疡性结肠炎可能是通过在转录后水平上调节iNOS的表达发挥作用的.

与溃疡性结肠炎相关的炎症因子、炎症介质有很多种, 他们之间存在着错综复杂的关系, 许多细胞因子在调节NO合成的同时其本身的分泌又受NO水平的调节[25,26]. 我们正在以与UC密切相关的因子为靶点进行研究[27], 期望为阐明维药西帕依溃结安治疗溃疡性结肠炎的作用机制奠定基础.

评论
背景资料

溃疡性结肠炎(UC)被世界卫生组织列为难治病之一, 近年来发病率有明显增加趋势. 而新疆维吾尔医药西帕依溃结安在治疗肠道炎症方面疗效确切, 但机制不清. 故通过进行药物干预的动物实验研究来探讨该药的作用机制十分必要.

同行评议者

许玲, 副教授, 中国人民解放军第二军医大学长征医院中医科

研发前沿

众多文献表明iNOS参与了溃疡性结肠炎的发生发展甚至癌变过程, 他已成为众多药物研究的靶点.

相关报道

众多研究证实维药西帕依溃结安确实具有很强的抗炎、清除氧自由基、调节免疫、抗血小板聚集、抗菌等作用, 在治疗肠道炎症方面疗效确切.

应用要点

本文结果提示维药西帕依溃结安对iNOS蛋白有调节作用, 提示iNOS可能是维药西帕依溃结安治疗UC的作用靶点, 为药物的治疗作用提供了一定的理论依据, 并为进一步研究奠定基础.

同行评价

本研究立题明确, 实验方法可行, 结论可信, 文章有可读性, 有参考价值. 希望在今后的研究中进一步阐明iNOS基因在mRNA水平与蛋白水平表达不同的原因.

编辑: 李军亮 电编:何基才

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