基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-12-28; 18(36): 3857-3862
在线出版日期: 2010-12-28. doi: 10.11569/wcjd.v18.i36.3857
APC/β-catenin/TCF通路在奥曲肽调控结肠癌SW480中的分子机制
王松, 包铮, 龙建武, 肖忠盛, 李峰, 梁庆模
王松, 包铮, 龙建武, 李峰, 梁庆模, 南华大学附属南华医院肿瘤外科 湖南省衡阳市 421002
肖忠盛, 南华大学附属第一医院普通外科 湖南省衡阳市 421001
王松, 硕士, 主要从事普外肿瘤防治临床与基础研究.
基金项目: 湖南省自然科学基金资助项目, No. 07JJ6158; 湖南省教育厅基金资助项目, No. 07C631.
作者贡献分布: 此课题由梁庆模与王松设计; 研究过程由王松、包铮、龙建武及肖忠盛完成; 数据分析由王松与李峰完成; 论文书写由王松与梁庆模完成.
通讯作者: 梁庆模, 教授, 主任医师, 421002, 湖南省衡阳市珠晖区东风南路336号, 南华大学附属南华医院肿瘤外科. hylqm@vip.sina.com
电话: 0734-8193128
收稿日期: 2010-09-14
修回日期: 2010-10-22
接受日期: 2010-11-02
在线出版日期: 2010-12-28

目的: 研究奥曲肽(Octrotide, OCT)对结肠癌SW480细胞中APC/β-catenin/TCF通路各热点分子在mRNA水平和蛋白水平表达量的影响, 初步探讨OCT调控SW480细胞APC/β-catenin/TCF通路的分子靶点.

方法: (1)mRNA检测: 体外培养人结肠癌SW480细胞, 分为对照组和OCT组(10-10 mol/L), 分别提取两组细胞的总RNA, 以RT-PCR法检测APC2、AXIN、CK1α、Cyclin D1、FZD7的mRNA, 筛选出两组细胞5个基因mRNA的表达差异; (2)蛋白检测: 体外培养人结肠癌SW480细胞, 分为对照组和OCT 1、2、3组(10-14、10-12、10-10 mol/L), 分别提取4组细胞的总蛋白, 以Western blot法检测APC2、CK1α、Cyclin D1的蛋白质, 鉴定4组细胞中3个基因在蛋白水平的表达差异.

结果: (1)mRNA检测: OCT组(10-10 mol/L)中APC2、CK1α的mRNA表达上调(均P<0.05), Cyclin D1的mRNA表达下调(P<0.05), AXIN和FZD7的mRNA改变无统计学意义(P>0.05); (2)蛋白检测: OCT 1、2、3组中APC2、CK1α蛋白表达上调(P<0.05), Cyclin D1蛋白表达下调(P<0.05), 且呈浓度依赖性.

结论: OCT通过强化APC2、CK1α"负反馈"调节作用, 下调靶基因Cyclin D1, 负性调控结肠癌SW480中APC/β-catenin/TCF通路.

关键词: 奥曲肽; SW480细胞; APC/β-catenin/TCF信号通路; APC2; CK1α; Cyclin D1
引文著录: 王松, 包铮, 龙建武, 肖忠盛, 李峰, 梁庆模. APC/β-catenin/TCF通路在奥曲肽调控结肠癌SW480中的分子机制. 世界华人消化杂志 2010; 18(36): 3857-3862
Involvement of the APC/β-catenin/TCF signaling pathway in the regulatory effects of octreotide on SW480 colon cancer cells
Song Wang, Zheng Bao, Jian-Wu Long, Zhong-Sheng Xiao, Feng Li, Qing-Mo Liang
Song Wang, Zheng Bao, Jian-Wu Long, Feng Li, Qing-Mo Liang, Department of Surgical Oncology, the Affiliated Nanhua Hospital of South China University, Hengyang 421002, Hunan Province, China
Zhong-Sheng Xiao, Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of South China University, Hengyang 421001, Hunan Province, China
Supported by: the Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 07JJ6158; and the Foundation of Hunan Provincial Education Department, No. 07C631.
Correspondence to: Professor Qing-Mo Liang, Department of Surgical Oncology, the Affiliated Nanhua Hospital of South China University, 336 South Dongfeng Road, Zhuhui District, Hengyang 421002, Hunan Province, China. hylqm@vip.sina.com
Received: September 14, 2010
Revised: October 22, 2010
Accepted: November 2, 2010
Published online: December 28, 2010

AIM: To investigate whether the APC/β-catenin/TCF signaling pathway is involved in the regulatory effects of octreotide (OCT) on SW480 colon cancer cells.

METHODS: (1) mRNA testing: SW480 cells were cultured in vitro and divided into control group and OCT group (treated with 10-10 mol/L OCT). Total RNA was prepared from the two groups of cells and used to detect the mRNA expression of APC2, AXIN, CK1α, cyclin D1 and FZD7 by RT-PCR. (2) Protein testing: SW480 cells were cultured in vitro and divided into control group and OCT group (treated with /L OCT at a concentration of 10-14, 10-12 or 10-10 mol/L). Total protein was prepared from the two groups of cells and used to detect the protein expression of APC2, CK1α and CyclinD1 by Western blot.

RESULTS: (1) mRNA testing: Treatment with OCT increased the mRNA levels of APC2 and CK1α (both P < 0.05), decreased that of cyclin D1 (P < 0.05), but had no significant impact on those of FZD7 and axin (both P > 0.05) in SW480 cells; (2) Protein testing: Treatment with different concentrations of OCT increased the protein levels of APC2 and CK1α and decreased that of cyclin D1 in SW480 cells in a dose-dependent manner (all P < 0.05).

CONCLUSION: OCT can negatively regulate APC/β-catenin/TCF signaling by up-regulating APC2 and CK1α expression and down-regulating cyclin D1 expression.

Key Words: Octreotide; SW480 cells; APC/β-catenin/TCF signaling pathway; APC2; CK1α; CyclinD1
0 引言

结肠癌的发病率为恶性肿瘤的第4位, 而且近年来有逐渐增加的趋势. 结肠癌发生、发展机制较为复杂, 目前的分子模型提示其多阶段的发展过程中, 涉及到许多癌基因、抑癌基因和信号通路的改变. 其中约80%-90%的结肠癌中存在APC突变, 而非APC突变结肠癌中50%为β-catenin突变, 两者均为APC/β-catenin/TCF通路关键分子, 因此APC/β-catenin/TCF通路是控制结肠癌发生、发展的主要通路, 亦是结肠癌治疗的主要靶点之一. 近年来, 大量的研究发现奥曲肽对多种实体肿瘤的生长具有良好的抑制作用, 而其不良反应小, 患者耐受性好, 具有广阔的应用前景. 我们的前期工作也已证实奥曲肽可抑制结肠癌SW480增殖, 下调β-catenin蛋白[1], 并通过基因芯片初步了解到奥曲肽使结肠癌SW480细胞APC/β-catenin/TCF通路30个基因发生差异性改变, 其中13个基因显著上调, 主要涉及APC2、AXIN家族、CK1家族, 17个基因显著下调[2], 但是奥曲肽调控APC/β-catenin/TCF通路的机制尚未阐明. 因此本文参考基因芯片结果对热点基因进行研究, 以期证实奥曲肽调控结肠癌SW480中APC/β-catenin/TCF通路的分子机制, 为奥曲肽治疗结肠癌提供理论基础.

1 材料和方法
1.1 材料

人结肠腺癌细胞株SW480, 系人结肠低分化黏液腺癌, 购于中南大学湘雅医学院. 醋酸奥曲肽注射液(批号: S0065, 北京诺华制药有限公司); RPMI 1640培养基(美国Gibco公司); 新生牛血清(杭州四季青公司); 胰蛋白酶(美国Amresco公司); DAB显色试剂为福州迈新公司; RT-PCR试剂盒、溴化乙锭(EB)、Taq酶等(美国Promega公司); 1, 4二硫苏糖醇、逆转录试剂盒(美国Amersham Biosciences公司); Tripure RNA 提取试剂盒、甲叉丙烯酰胺(美国Roche公司); APC2、AXIN、CK1α、FZD7和Cyclin D1引物由上海生工生物技术公司合成. CK1α(F158)兔抗人多克隆抗体、APC2(N32)兔抗人多克隆抗体和Cyclin D1(L283)兔抗人多克隆抗体(美国Abzoom公司); β-actin单克隆抗体、辣根酶标记羊抗兔IgG、辣根酶标记羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: SW480细胞培养于含10%小牛血清, 1×105 U/L青霉素及1×105 U/L链霉素RPMI 1640完全培养基中, 在37 ℃, 50 mL/L CO2及饱和湿度条件下培养, 细胞呈单层生长, 铺满培养瓶约2-3 d传代1次. 取对数生长期细胞用于实验.

1.2.2 RT-PCR法检测基因mRNA表达: 依照前期实验结果[1,2], 取奥曲肽抑制SW480最佳抑制浓度为实验组, 即OCT组(10-10mol/L); 对照组为SW480加入培养基、生理盐水. 以上均培养24 h. 分别提取2组细胞的总RNA, 逆转录合成cDNA, PCR扩增APC2、CSNK1A1L、Cyclin D1、AXIN、FZD7(表1), RT-PCR产物鉴定及半定量分析, 最后凝胶图像分析APC2、CSNK1A1L、Cyclin D1、AXIN、FZD7表达强度.

表1 5个热点基因及β-actin内参引物序列.
热点基因序列(5'-3')扩增片段长度(bp)
APC2A: GGA TGG AGA AGG CGA AAG TGA G352
S: TTG CCA AAG GGT AGG GAA ATG
AXIN1A: CAG TCA AAC TCG TCG CTC AC444
S: CTC CCA CCT CTT CAT CCA A
Cyclin D1A: CCT CCC ACG AAA CGC TAC T404
S: CGA TGC CAA CCT CCT CAA
CK1αA: TCC TCC ACT ACC TCC ACC255
S: AGG CTA CAC CTT TGA CTA TGC
FZD7A: CCT TTA GCG AAG TCA GAA CCT363
S: GCC AAG GAG ACG TGG AGT A
β-actinA: GTGGG GCGCC CCAGG CACCA505
S: CTTCC TTAAT GTCAC GCACG ATTTC

1.2.3 Western blot法检测基因蛋白表达: 取奥曲肽1、2、3组(10-14、10-12、10-10 mol/L)为实验组; 对照组为SW480加入培养基、生理盐水. 以上均培养24 h. 分别提取4组细胞的总蛋白, 制备SDS-PAGE凝胶, 将蛋白质样品上样至SDS-PAGE凝胶加样孔内, 每条泳道上样40 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳, 转移至PVDF膜上, 5%脱脂奶粉封闭室温下2 h. 4 ℃孵育一抗(1:200 β-actin, 1:500 APC2, 1:500 CK1α, 1:500 Cyclin D1)过夜, TBST洗膜后孵育二抗(1:4 000)孵育1 h, TBST再次洗膜, 发光剂显色, X片曝光、显影、定影、水洗, 进行图像分析.

统计学处理 各组实验数据均用mean±SD表示, 采用SPSS13.0统计分析软件包处理. 实验结果采用One-way ANOVA方式行方差分析, 两两比较采用Student' t检验, 进行统计学分析, P<0.05认为差别有显著性意义. 实验重复3遍以上.

2 结果
2.1 RT-PCR检测奥曲肽对结肠癌SW480细胞APC2、CK1α、Cyclin D1、AXIN和FZD7 mRNA表达的影响

经电泳后RNA中28S、18S和5S 3条带清晰可见(图1), 说明细胞总RNA提取的质量可靠, 可以用于RT-PCR实验. RT-PCR法检测奥曲肽组(10-10 mol/L)和对照组细胞中APC2、CK1α、Cyclin D1、AXIN和FZD7各mRNA的表达(图2). 结果显示: 与对照组相比较, OCT组中SW480细胞APC2、CK1α mRNA表达增加, 且Cyclin D1 mRNA表达减少(P<0.05, 图3); 但是AXIN和FZD7 mRNA改变无统计学意义(P>0.05).

图1
图1 SW480细胞总RNA电泳检测结果.
图2
图2 奥曲肽作用前后SW480细胞中各个基因mRNA的表达差异. P: 奥曲肽组; N: 对照组; M: DNA Marker.
图3
图3 奥曲肽作用后SW480细胞CK1α, Cyclin D1及APC2 mRNA的表达变化. A: CK1α mRNA; B: Cyclin D1 mRNA; C: APC2 mRNA.
2.2 Western blot检测奥曲肽对结肠癌SW480细胞APC2、CK1α、Cyclin D1蛋白表达的影响

2.2.1 奥曲肽对SW480细胞中APC2蛋白表达的影响: 不同浓度OCT(0、10-14、10-12、10-10 mol/L)孵育SW480细胞24 h后, 提取总细胞蛋白, 用Western blot法检测各组细胞APC2蛋白(图4). 结果显示: 随着奥曲肽浓度的增大, 细胞中APC2蛋白逐渐增加, 呈剂量依赖性, 差异有统计学意义(P<0.05).

图4
图4 不同浓度奥曲肽作用后SW480细胞中APC2蛋白的表达差异. 1: 对照组; 2: 奥曲肽10-14 mol/L组; 3: 奥曲肽10-12 mol/L组; 4: 奥曲肽10-10 mol/L组.

2.2.2 奥曲肽对SW480细胞中CK1α蛋白表达的影响: 不同浓度奥曲肽(0、10-14、10-12、10-10 mol/L组)孵育SW480细胞24 h后, 提取总细胞蛋白, 用Western blot法检测各组细胞CK1α蛋白(图5). 结果显示: 随着奥曲肽浓度的增大, 细胞中CK1α蛋白逐渐增加, 呈剂量依赖性, 差异有统计学意义(P<0.05).

图5
图5 不同浓度奥曲肽作用后SW480细胞中CK1α蛋白的表达差异. 1: 对照组; 2: 奥曲肽10-14 mol/L组; 3: 奥曲肽10-12 mol/L组; 4: 奥曲肽10-10 mol/L组.

2.2.3 奥曲肽对SW480细胞中Cyclin D1蛋白表达的影响: 不同浓度奥曲肽(0、10-14、10-12、10-10 mol/L)孵育SW480细胞24 h后, 提取总细胞蛋白, 用Western blot法检测各组细胞Cyclin D1蛋白(图6). 结果显示: 随着奥曲肽浓度的增大, 细胞中Cyclin D1蛋白逐渐下降, 呈剂量依赖性, 差异有统计学意义(P<0.05).

图6
图6 不同浓度OCT作用后SW480细胞中Cyclin D1蛋白的表达差异. 1: 对照组; 2: 奥曲肽10-14 mol/L组; 3: 奥曲肽10-12 mol/L组; 4: 奥曲肽10-10 mol/L组.
3 讨论

奥曲肽(SMS 201-995, Octreotide)是一种人工合成的八肽生长抑素类似物, 与天然生长抑素比较, 其具有半衰期长(约90 min)、生物活性强、体内代谢稳定、受体选择性较强及分子小易吸收等特点, 已广泛应用于消化系疾病和多种内分泌肿瘤的临床治疗. 近期基础研究显示奥曲肽能有效控制消化系肿瘤, 如奥曲肽可以通过上调Fas/FasL表达而抑制肝癌细胞增殖[3], 通过上调Fas/FasL表达且下调突变型p53表达诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡[4]. 同时, 我们的前期工作亦提示奥曲肽可以通过调控APC/β-catenin/TCF通路中30个基因抑制结肠癌SW480细胞增殖, 其中APC2、CK1α和AXIN显著上调(10-10 mol/L奥曲肽组/对照组>2倍), 他们主要参与"β-Catenin破坏复合体"的形成; 而Cyclin D1、FZD7显著下调(10-10 mol/L奥曲肽组/对照组<0.5), 其中Cyclin D1为下游靶基因[2]. 但是上述调控机制尚不清楚, 为此本课题就基因芯片中的热点基因进行了研究.

APC/β-catenin/TCF通路在结肠癌中控制着细胞的命运, 是结肠癌发生的重要早期事件, 控制着结肠癌细胞的增殖、侵袭和转移, 并起到癌细胞微环境调节器的作用[5]. 该通路多个组成成员APC、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1等的突变, 在结肠癌的发生发展过程中起着决定性的作用[6].

APC突变为80%-90%的结肠癌的主要诱癌因素(如本实验对象SW480). APC突变聚集区(mutation cluster region, MCR)正好为β-catenin的结合区域, 导致细胞质内β-catenin异常积聚, β-catenin转导入细胞核内与TCF/LEF蛋白结合形成三聚体, 竞争性抑制TCF/LEF与APC/β-catenin/TCF通路下游靶基因结合, 开启靶基因的异常高表达而至癌.

APC2又称为APCL, 为APC的同源物, 位于染色体19p13.3, 由2 303个氨基酸组成. APC2缺失了保守的羧基端、缺乏3个15-aa重复基序、5个20-aa重复基序和两个SAMP重复基序, 但是仍与APC有76%的同源性, 基本保持了APC的主要功能: (1)Yang等[7]研究显示, 磷酸化位点同时包括了Ser-45位点(CK1作用)和Ser-33/Ser-37/Thr-41位点(GSK3-β作用), 而C-端截短APC蛋白并未影响GSK3-β和CK1对β-catenin的磷酸化功能; 研究还显示, SAMP重复基序与磷酸化β-catenin的降解有关, 与全长APC比较, APC2中的SAMP重复基序的减少使得β-catenin磷酸化降解下降, phosph-β-catenin增加; (2)Fagman等[8]研究认为C-端截短APC蛋白除包含了未被截去NES1APC 63-83及NES2APC的外, 其犰狳类结构区域可能还含有一个NLSX功能区, 他独立于NLS1APC及NLS2APC以外; (3)Neufeld等[9]和Henderson等[10]亦认为APC2和APC一样, 均具有细胞核穿梭功能, 调控β-catenin由细胞核转移至细胞质内. 以上研究表明APC2具有APC相似的功能, 可抑制APC突变激活的异常APC/β-catenin/TCF通路.

本实验采用RT-PCR和Western blot均证实了奥曲肽可以上调APC2 mRNA和蛋白, 并且呈浓度依赖性. 奥曲肽通过上调SW480细胞中APC2, 使得APC2与β-catenin、Axin等相结合, 重装"破坏复合体", 有利于GSK-3β、CK1α磷酸化β-catenin; 促进β-catenin从细胞核内向细胞质、细胞膜转位. 以上提示奥曲肽上调的APC2弥补了SW480细胞中突变APC的功能缺失, 从而抑制异常激活的APC/β-catenin/TCF通路.

CK1也是APC/β-catenin/TCF通路的重要组成部分, 他是一组广泛分布于各类真核生物的蛋白激酶超家族. 该家族中包括了"负性调控子"CK1α以及"正性调控子"CK1γ、CK1ε等. CK1α下降和CK1γ、CK1ε上升, 两种调控子的比例失调可抑制"破坏复合体"的形成, 异常激活APC/β-catenin/TCF通路.

CK1α与β-catenin、APC、Axin、GSK-3β共同形成破坏复合体, 该复合体中的CK1α可使β-catenin的丝氨酸(Ser)45残基磷酸化, 后者有助于GSK-3β对β-catenin的Ser33/37、苏氨酸(Thr)41残基磷酸化, 磷酸化后的β-catenin被泛素蛋白酶体泛素化和降解, 从而下调异常的APC/β-catenin/TCF通路[11]. 此外, 有研究认为CK1α可以通过TCF家族之一NF-AT4蛋白, 掩盖其NLS区域, 减少其转移至细胞核内, 减少基因的异常表达, 从而下调异常的APC/β-catenin/TCF通路[12].

CK1γ、CK1ε作用正好相反. (1)数项研究表明CK1ε通过磷酸化散乱蛋白干扰GSK-3β与AXIN结合, 增强TCF3与β-catenin的亲和力, 及减少异源三聚体参与了"破坏复合体"的形成, 解离"破坏复合体", 从而上调APC/β-catenin/TCF通路[13-15]; (2) CK1γ通过磷酸化促转录受体LRP5/6, 使得AXIN结合不稳定, 从而上调APC/β-catenin/TCF通路[16]; (3)CK1γ、ε通过磷酸化E-cadherin, 使E-cadherin丧失定位于细胞间稳定细胞黏附的作用, 且磷酸化后的E-cadherin与β-catenin作用减弱, 从而上调APC/β-catenin/TCF通路[17].

我们的前期工作显示, CK1家族中CK1α(10-10 mol/L奥曲肽组/对照组 = 6.41)的上调大于CK1γ(10-10 mol/L奥曲肽组/对照组 = 5)及CK1ε(10-10 mol/L奥曲肽组/对照组 = 0)[2]. 本实验RT-PCR和Western blot均证实, 奥曲肽可以上调CK1α的mRNA和蛋白, 呈浓度依赖性. 以上均提示奥曲肽可以选择性增加此"负性调控子]CK1α, 平衡两种调控子的比例, 重装"破坏复合体", 促进β-catenin的磷酸化, 从而抑制异常激活的APC/β-catenin/TCF通路.

Cyclin D1基因是一种细胞周期调控因子, 在结肠癌组织中通常是过表达, 而该基因直接发生突变的情况很少, 但他可被异常的APC/β-catenin/TCF信号通路直接激活. 我们的实验结果显示, 奥曲肽不但可上调APC2、CK1α的mRNA和蛋白, 还可以下调Cyclin D1的mRNA和蛋白, 且呈浓度依赖性.

目前, 研究显示多种化合物抗结肠癌的作用与APC/β-catenin/TCF通路有关, 如非甾体类抗炎药物可促进β-catenin蛋白的降解和核转出, 如阿司匹林[18]、舒林酸[19]; 酪氨酸激酶抑制剂可调控β-catenin的酪氨酸残基磷酸化, 促使β-catenin与E-cadherin结合增加, 如格列卫[20]、绿茶酚[21]等; 姜黄素[22]、槲皮素[23]等天然化合成分可减少细胞核内的β-catenin和TCF-4蛋白及其相互结合等.

本研究认为奥曲肽调控结肠癌SW480中APC/β-catenin/TCF通路的分子机制为: 奥曲肽通过上调APC2、CK1α, 重装"破坏复合体", 利于β-catenin蛋白分解, 减少β-catenin与TCF/LEF蛋白的结合, 从而抑制下游靶基因Cyclin D1, 强化"负反馈机制", 最终抑制APC/β-catenin/TCF通路. 这可能是奥曲肽抑制结肠癌细胞增殖的关键机制, 将为奥曲肽治疗结肠癌的策略提供理论依据.

评论
背景资料

APC/β-catenin/TCF通路异常是结肠癌发生的重要早期事件, 以其关键成分为靶标的药物将成为防治结肠癌的重要手段. 目前已有NASID、选择性COX-2抑制剂通过抑制该通路治疗结肠癌的临床干预试验, 但缺少奥曲肽抑制APC/β-catenin/TCF通路治疗结肠癌的相关研究.

同行评议者

李永翔, 主任医师, 安徽医科大学第一附属医院普外科

相关报道

本课题组的前期工作提示奥曲肽可以通过调控APC/β-catenin/TCF通路中30个基因抑制结肠癌SW480细胞增殖, 其中APC2、CK1α和AXIN显著上调, 而Cyclin D1、FZD7显著下调.

创新盘点

化合物拮抗结肠癌机制研究大多集中在APC/β-catenin/TCF通路的β-catenin分子上, 而本课题以前期基因芯片热点基因的改变为研究对象, 对APC/β-catenin/TCF通路多个分子进行联合研究, 有利于充分阐明奥曲肽抑制结肠癌细胞增殖的关键机制.

应用要点

奥曲肽具有半衰期长、生物活性强、体内代谢稳定、受体选择性较强及分子小易吸收等优势,已广泛应用于消化系疾病和多种内分泌肿瘤的临床治疗, 对其抑制结肠癌细胞APC/β-catenin/TCF通路的机制研究, 将为奥曲肽治疗结肠癌的策略提供理论依据.

同行评价

本文可读性较好, 具有一定的科学性和创新性.

编辑:曹丽鸥 电编:何基才

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