PCNA和C-fos蛋白在人胎食管组织中的表达及意义

摘要

目的: 探讨增殖细胞核抗原(PCNA)和C-fos蛋白在人胚胎食管组织中的表达规律.

方法: 应用免疫组织化学PV法、SP法和图像分析(NIS-DR)软件检测第2、3、4月, 人胚胎食管组织中PCNA和C-fos蛋白阳性表达的积分光密度(IA), 数据的组间比较采用单因素方差分析.

结果: 第2月胚龄组食管组织中, PCNA蛋白阳性细胞的IA值为50.6540±5.92400(n = 5), 3 mo胎龄组IA值为57.8465±9.99749(n= 6), 4 mo胎龄组IA值为69.3626±16.28008(n = 5), 可见IA值依次增高, 两两比较, 差异有统计学意义(P<0.01). 第2、3、4个月胎龄段, C-fos蛋白在人胚胎食管各层组织细胞均呈阳性表达. 2 mo胎龄组食管组织中, C-fos蛋白阳性染色细胞的IA值为77.7867±12.22991(n = 5), 3 mo胎龄组IA值为83.2524±8.63989(n = 6), 4 mo胎龄组IA值为66.5414±9.06673(n = 5), 可见IA值先升高再降低, 两两比较, 差异有统计学意义(P<0.01).

结论: PCNA和C-fos蛋白在人胚胎早期食管组织细胞的生长发育过程中起重要的调节作用.

关键词: 食管; 增殖细胞核抗原; C-fos蛋白; 人胚胎; 免疫组织化学

Expression of PCNA and C-fos proteins in the human fetal esophagus

Xue-Hong Liu, Yong Zhang

Xue-Hong Liu, Yong Zhang, School of Medicine, Shaoxing University, Shaoxing 312000, Zhejiang Province, China

Supported by: the Science Plan Foundation of Zhejiang Provincal Education Department, No. Y200805569; and the Key Fund of Shaoxing University, No. 08LG1018.

Correspondence to: Xue-Hong Liu, School of Medicine, Shaoxing University, Shaoxing 312000, Zhejiang Province, China. lxh6588@yahoo.com.cn

Received: September 6, 2010
Revised: October 25, 2010
Accepted: November 2, 2010
Published online: December 8, 2010

Abstract

AIM: To investigate the expression pattern of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and c-Fos proteins in the human fetal esophagus.

METHODS: The expression of PCNA and c-Fos in the esophagus tissue samples taken from human fetus at 2, 3 or 4 months was detected by immunohistochemistry. The integral absorbance (IA) values of PCNA and C-fos staining were calculated using the Nikon imaging system (NIS-DR). One-way ANOVA was applied to compare these IA values.

RESULTS: Positive PCNA protein expression was detected in all the layers of the esophagus of human fetus at 2, 3 or 4 months. The IA value of PCNA-positive cells in the esophagus of human fetus at 2 months was significantly lower than those at 3 and 4 months (50.6540 ± 5.92400 vs 57.8465 ± 9.99749 and 69.3626 ± 16.28008, both P < 0.01). With the increase in fetal age, the IA values of PCNA-positive cells showed an upward trend. Positive expression of C-fos protein was also detected in all the layers of the esophagus of human fetus at 2, 3 or 4 months. The IA value of C-fos-positive cells in the esophagus of human fetus at 3 months was significantly higher than those at 2 and 4 months (83.2524 ± 8.63989 vs 77.7867 ± 12.22991, 66.5414 ± 9.06673, both P < 0.01). With the increase in fetal age, the IA value of C-fos-positive cells rose initially and then dropped.

CONCLUSION: PCNA and C-fos proteins play an important role in regulating the growth and development of the human fetal esophagus.

Key Words: Esophagus; Proliferating cell nuclear antigen; C-fos protein; Human fetus; Immunohistochemistry

0 引言

细胞增殖是食管壁组织细胞生长发育的基本特征, 他与细胞凋亡相互作用, 维持食管的正常生长发育. 胚胎时期是食管壁细胞增殖的关键时期, 细胞增殖的异常将会导致食管发育的畸形. 增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是一种在增殖细胞中合成或表达的核内多肽, 是目前一个能较好反映细胞增殖状况的指标[1-3]. C-fos属于myc癌基因家族, 编码产物为核内转录因子, 参与细胞生长, 增殖、分化和信息传递等活动[4,5]. 目前联合应用PCNA和C-fos研究人胚胎食管壁组织细胞生长发育过程中细胞增殖的表达规律及作用机制, 国内外未见文献报道. 本文应用免疫组织化学方法, 研究人胚胎生长发育过程中, PCNA和C-fos在食管组织中的分布、变化趋势, 探讨两者在食管组织细胞生长发育过程中的作用及意义.

1 材料和方法

1.1 材料

收集人工流产、发育正常的人胎标本16例, 每例标本均取得产妇本人同意和学院伦理委员会批准. 根据产妇末次月经和B超所测胎儿双顶径等确定胎龄为7-16 wk. 妊4-8 wk为第2个月胚龄组, 妊9-12 wk为第3个月胎龄组, 妊13-16 wk为第4个月胎龄组, 每月龄为一研究组, 其例数分布如下: 第2个月胚龄组5例, 第3个月胎龄组6例, 第4个月胎龄5例.

1.2 方法

1.2.1 取材和免疫组织化学染色: 从胎尸内取出食管标本, 分别从每例标本中切取食管长约0.5 cm, 用4 ℃生理盐水冲洗管腔, 放入10%的中性甲醛水溶液中固定12 h后, 取出流水冲洗30 min, 行常规脱水、透明、浸蜡和包埋. 石蜡切片, 片厚4 μm, 每个标本取4片, 行免疫组织化学染色(所用试剂PCNA一抗小鼠抗人单克隆抗体和C-fos一抗兔抗人多克隆抗体及其辅助试剂盒均购于北京中杉生物技术有限公司). C-fos免疫组织化学染色采用SP法: 即切片常规脱蜡至水, 微波抗原修复, 3% H₂O₂灭活内源性酶, 正常山羊血清封闭, 滴加一抗(抗体浓度为1:150), 生物素化山羊抗兔血清(二抗), 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(在以上各步之间均用PBS洗涤3次, 每次5 min), DAB显色, 自来水冲洗, 苏木精轻度复染, 然后脱水, 透明, 中性树胶封片, 显微镜观察. PCNA免疫组织化学染色采用PV法: 即切片常规脱蜡至水, 3% H₂O₂灭活内源性酶, 微波抗原修复, 滴加一抗(抗体浓度为1:100), PV9005(在以上各步之间均用PBS洗涤3次, 每次5 min), DAB显色, 自来水冲洗, 苏木精轻度复染, 然后脱水, 透明, 中性树胶封片, 显微镜观察.

1.2.2 对照实验: 用PBS替代一抗、二抗作阴性对照, 结果均为阴性. 用已知阳性切片作阳性对照, PCNA和C-fos蛋白阳性表达定位与阳性对照片一致.

1.2.3 结果判定和图像分析: 切片经染色后, 第2、3、4月龄段人胚胎食管切片经染色后, PCNA和C-fos阳性细胞的细胞核呈黄色或深黄色, 细胞质或细胞膜不着色. 用NIS-DR专业图像处理分析软件(日本Nikon)测定某一视野下PCNA和C-fos蛋白阳性染色细胞的积分光密度(integral absorbance, IA), 每张切片随机选取3个视野, 对每份样本的4张切片的3个视野阳性染色细胞的IA值取平均值.

统计学处理 数据用SPSS11.5统计软件分析, 结果以mean±SD表示, 组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA), P<0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果

第2-4月龄段, PCNA蛋白在食管壁各层组织中均有阳性细胞表达, 尤其在食管黏膜上皮层表达明显. 随着胎龄的增大, PCNA蛋白在食管黏膜上皮层表达逐渐减弱, 在肌层组织细胞表达逐渐增强(图1). C-fos蛋白在食管壁各层组织中均有阳性细胞表达, 尤其在食管黏膜上皮层和肌间神经丛处表达明显, 到第4个月胎龄时, C-fos蛋白在食管表达明显增高. C-fos蛋白的阳性表达强度随胚胎龄的增大呈先降低再升高的趋势(图2). 第2-4月龄段, 食管PCNA蛋白表达IA依次增高, 两两比较其差异有统计学意义(P<0.05). C-fos蛋白表达IA值先升高再降低, 两两比较, 其差异有统计学意义(P<0.05, 表1).

表1 PCNA和C-fos蛋白在人胚胎食管细胞的表达 (mean±SD).

分组	n	食管细胞PCNA蛋白阳性平均IA值	食管细胞C-fos蛋白阳性平均IA值
第2个月胚龄组	6	50.6540±5.92400a	77.7867±12.22991a
第3个月胚龄组	5	57.8465±9.99749	83.2524±8.63989
第4个月胚龄组	5	69.3626±16.28008a	66.5414±9.06673a
F值		16.065	14.128
P值		＜0.01	＜0.01

^aP<0.05 vs 第3个月胚龄组.

图1 免疫组织化学法示第2-4个月胚龄时, PCNA蛋白在人胚食管组织细胞的阳性表达(↑)(×400). A: 第2个月胚龄; B: 第3个月胎龄; C: 第4个月胎龄.

图2 免疫组织化学法示第2-4个月胚龄时, C-fos蛋白在人胚食管组织细胞的阳性表达(↑)(×400). A: 第2个月胚龄; B: 第3个月胎龄; C: 第4个月胎龄.

3 讨论

胚胎时期, 食管的生长发育始终处于细胞增殖大于细胞凋亡的一种动态平衡模式. 研究胚胎食管生长发育时期细胞增殖规律, 有助于人们进一步了解食管的生理功能和发育机制. 自从1978年Miyachi等首次发现和提纯PCNA抗原, 使人们对细胞增殖的研究向前迈进了一大步. PCNA是一种DNA聚合酶δ的辅助蛋白, 是DNA合成必不可少的因子, 在细胞核内合成并存在于细胞核内, 在DNA合成期开始增高, S期达到高峰, G2期开始下降, 其阳性表达的强弱代表细胞增殖活动的高低, 是目前研究细胞增殖规律的一项很好指标[6]. 本研究应用PCNA蛋白研究人胚胎食管组织细胞的分化发育、增殖演变规律. 结果显示, 第2-4个月胎龄段, PCNA在食管壁各层组织中均有阳性细胞表达, 尤其在食管黏膜上皮层表达明显. 随着胎龄的增大, PCNA蛋白在食管黏膜上皮层表达逐渐减弱, 在肌层组织细胞表达逐渐增强. 结果提示, 在第2个月胚龄时, 食管黏膜上皮层细胞正处于发育、增殖的高峰期, 细胞增殖信号表达较强, 这时期食管组织内的大部分细胞可能处于细胞增殖周期的DNA合成后期或S期. 在第3-4个月胎龄段, 食管黏膜上皮组织内PCNA阳性信号表达逐渐减弱, 提示此阶段食管黏膜上皮组织内大部分细胞正由S期向G₂期分化发育. 而PCNA蛋白在食管肌层细胞的阳性表达时间与黏膜上皮层细胞相反的结果, 说明食管肌层的发育滞后于食管黏膜上皮层, 这与徐邦生等[7]报道人胚胎食管发育形态学演变是一致的. 连小珂等[8]报道各个胎龄的胎儿(胎龄均>4 mo)食管上皮组织中PCNA免疫组织化学表达无明显差异. 而邢国兰等[9]报道人胚胎(胎龄3-10 mo)食管黏膜层的单位面积中PCNA免疫组织化学阳性表达随胎龄的增大而降低, 与我们的研究结果基本一致. 据报道用PCNA的免疫组织化学检查E11-14d的小鼠胚胎发育中期小肠上皮细胞, 随着胎龄的增大, PCNA表达信号强度由弱到强, 由少到多, E17d、E19d、E21d的胚胎大鼠肠道PCNA蛋白表达部位主要在肠黏膜杯状细胞的胞核中[10,11]. 说明在动物和人胚胎发育期间, PCNA蛋白均参与消化器官组织的发生、增殖过程, 但在时空上可能具有不同的表达规律.

C-fos原癌基因在哺乳动物组织中有高度表达, 在进化中高度保守. C-fos与DNA结合具有直接调节具有转录活性的转录因子的作用, 在静止细胞受到生长的刺激时迅速表达, 在胚胎细胞的发育过程中, 是一种细胞分化的诱导因子, 对细胞的生长、分化及增值起促进作用[12]. 本研究结果表明在第2-4个月龄的人胚胎生长发育过程中, C-fos蛋白在食管壁各层组织中均有阳性细胞表达, 其阳性表达强度随胚胎龄的增大呈先降低再升高的趋势, 尤其在食管黏膜上皮层和肌间神经丛处表达明显. 结果提示, 在人胚发育的第2个月龄段, C-fos蛋白在食管黏膜上皮层和肌间神经丛处的高表达, 其作用可能主要是作为一种细胞分化诱导因子, 启动下游基因, 与增殖性核抗原等细胞因子共同促进食管组织细胞的增殖、分化. 当食管组织细胞分化、增殖启动后, C-fos的任务也将告一段落, 并逐渐退出. 人胎发育到第4个月阶段, 由于前期食管组织的大量增殖, 食管壁明显增厚, 而此时食管壁内血管和神经内分泌系统尚未发育完善, 部分因得不到营养和神经信号支配的细胞将发生凋亡, 此期C-fos在食管组织内再次表达上调, 结合我们前期研究结果[13], 我们认为此期C-fos主要作用可能不是参与促进细胞增殖、分化, 而是参与诱导细胞凋亡. 显示, 有研究表明, C-fos表达增加可能与凋亡的反应性表达增强有关, 促进特异性细胞凋亡, 也可能是对缺血再损伤的应激反应[14,15].

总之, PCNA和C-fos蛋白参与人胚胎早期食管的分化、增殖发育过程, 他们在食管组织不同发育阶段所发挥的作用不同. 在第2个月龄时, PCNA和C-fos可能具有协同作用, 促进食管组织细胞的分化、增殖; 在第4个月龄段, PCNA和C-fos可能具有拮抗作用, 此期的C-fos主要作用可能是参与诱导食管组织细胞发生凋亡.

评论

背景资料

人胚胎食管壁组织细胞的生长发育与食管肿瘤细胞的生长方式相似, 而细胞增殖和凋亡贯穿于食管壁组织细胞生长发育全程. 因此, 研究人胚胎食管的生长发育过程中细胞增殖和凋亡的变化规律, 为探寻临床食管肿瘤的预防和治疗提出了新途径.

同行评议者

沈琳, 主任医师, 北京大学临床肿瘤医院消化内科; 陈洪, 主任医师, 东南大学附属中大医院消化科

研发前沿

胚胎细胞和肿瘤细胞的发生、分化、迁移机制是目前研究的重点和热点. 研究胚胎食管发育过程中不同时期组织细胞的分化演变、增殖、凋亡的蛋白表达水平, 深入探讨基因调控机制, 为食管肿瘤的防治提供新思路.

创新盘点

本研究选用第2-4个月胎龄人胎食管壁组织为研究材料, 应用免疫组织化学法研究人胚胎生长发育过程中, PCNA和C-fos蛋白在食管组织细胞中的分布、变化趋势, 探讨两者在食管组织细胞生长发育过程中的作用及意义. 国内外未见文献报道.

应用要点

已有研究报道胚胎食管组织细胞的分化、发育机制与食管肿瘤相似. 深入研究胚胎食管组织细胞的增殖和凋亡演变规律, 将有助于预防食管先天畸形的发生, 为探寻肿瘤防治新途径提供理论基础.

同行评价

本文选题新颖, 技术路线合理, 为探寻肿瘤的防治提供参考价值.

备注

编辑:李薇 电编:李薇

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