四藤方对人胃癌SGC-7901细胞黏附和侵袭的影响

摘要

目的: 观察四藤方对胃癌细胞SGC-7901黏附、侵袭、移动等转移生物学行为的影响.

方法: 体外培养SGC-7901细胞, 分为四藤方50、100、200 mg/L组和对照组, 采用Cytoselect 48-Well Cell Adhesion Assay检测胃癌细胞与基质黏附能力, 利用Transwell侵袭转移模型评价四藤方对胃癌细胞侵袭能力的影响, 划痕实验观察四藤方对SGC-7901细胞移动能力的影响.

结果: 终浓度50、100、200 mg/L四藤方能显著降低SGC-7901细胞黏附能力(0.34±0.05, 0.13±0.00, 0.12±0.01 vs 1.34±0.12, P<0.01), 抑制SGC-7901细胞侵袭(39±3, 26±6, 8±2 vs 80±5, P<0.01), 终浓度50 mg/L四藤方作用48 h可显著抑制SGC-7901细胞迁移(28.57%±4.10% vs 59.68%±5.98%, P<0.01).

结论: 四藤方可降低SGC-7901细胞的黏附能力, 侵袭能力, 抑制细胞迁移.

关键词: 四藤方; 中药复方; 胃癌; 黏附; 侵袭; 移动

Treatment with Sitengfang decreases cell adhesion, invasion and migration in human gastric carcinoma cell line SGC-7901

Ke-Ping Shen, Wei Liu, Bing Hu, Chuan-Fang Pan

Ke-Ping Shen, Wei Liu, Bing Hu, Chuan-Fang Pan, Department of Oncology (Division V), Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30873258; the Foundation for Chinese Medicine Leading Talents in Shanghai Pudong New Area, No. PWZ2008-20-104; and the Foundation to Support Clinic and Scientific Resources Shared by Shanghai Municipal Hospitals, No. SHDC12007206.

Correspondence to: Ke-Ping Shen, Department of Oncology (Division V), Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China. shen0313@163.com

Received: September 1, 2010
Revised: October 19, 2010
Accepted: October 26, 2010
Published online: December 8, 2010

Abstract

AIM: To investigate the influence of treatment with Sitengfang on cell adhesion, invasion and migration in human gastric carcinoma cell line SGC-7901.

METHODS: SGC-7901 cells were cultured in vitro and treated with different concentration of Sitengfang (0, 50, 100 and 200 mg/L, respectively). Cell adhesion was detected by CytoSelect^TM 48-Well Cell Adhesion Assay. Cell invasion was analyzed by Transwell invasion assay. Cell migration was detected by scratch wound healing assay.

RESULTS: Treatment with Sitengfang at a concentration of 50, 100 or 200 mg/L significantly inhibited the adhesion and invasion of SGC-7901 cells (adhesion: 0.34 ± 0.05, 0.13 ± 0.00, 0.12 ± 0.01 vs 1.34 ± 0.12; invasion: 39 ± 3, 26 ± 6, 8 ± 2 vs 80 ± 5, all P < 0.01). Wound healing assay showed a significant reduction in the migration capacity of cells treated with 50 mg/L Sitengfang for 48 h (28.57% ± 4.10% vs 59.68% ± 5.98%, P < 0.01).

CONCLUSION: Treatment with Sitengfang significantly decreases cell adhesion, invasion and migration in human gastric carcinoma cell line SGC-7901.

Key Words: Sitengfang; Chinese herbal formula; Gastric carcinoma; Adhesion; Invasion; Migration

0 引言

胃癌转移是患者死亡的主要原因, 也是胃癌治疗所面临的最大障碍[1]. 肿瘤细胞黏附和侵袭是肿瘤发生转移的重要生物过程, 抑制肿瘤的黏附和侵袭可以降低肿瘤转移的发生. 胃肠安是龙华医院中西医结合肿瘤专家邱佳信教授的临床验方, 前期研究证实胃肠安方具有一定的抑制胃癌转移的作用[2,3], 为进一步探讨其机制, 我们从中选取部分祛邪中药组成四藤小复方, 在细胞模型中观察其对SGC-7901细胞黏附、侵袭、移动能力的影响, 旨在进一步探讨胃肠安方的抗肿瘤转移作用, 为临床应用提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM培养基、胎牛血清为Thermo Fisher产品; Cytoselect 48-Well Cell Adhesion Assay(fibronectin-Coated, Colorimetric format)购自西美杰公司; Transwell小室购于Corning Costar; Matrigel胶购自BD公司. 酶标仪: 美国Thermo Varioskan; 倒置显微镜: 日本Nikon DXM1200. 人胃癌细胞SGC-7901购自中国科学院细胞库. 人胃黏膜细胞GES-1购自ATCC.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 人胃癌细胞SGC-7901培养于DMEM培养基(含100 mL/L胎牛血清、青霉素100 kU/L、链霉素100 kU/L)中, 37 ℃, 50 mL/L CO₂、饱和湿度环境的条件下连续培养.

1.2.2 中药提取: 参考相关文献[4,5]将四藤方饮片(菝葜、野葡萄藤、藤梨根等)浸泡30 min, 煎煮2次, 每次30 min, 纱布粗滤去渣, 将所得滤液以5 000 r/min, 30 min离心以初步去掉大的颗粒杂质. 取上清液浓缩至300 mL, 加等体积的无水乙醇后置于4 ℃冰箱过夜沉淀. 取出各药物与乙醇的混合液, 再以5 000 r/min, 30 min离心, 取上清液旋转蒸发回收乙醇浓缩药液, 浓缩至50 mL左右时取出室内挥发24 h后冰冻干燥, 当药物成粉末状时取出, 称取质量, 临用时用PBS溶解, 0.22 µm微孔滤器过滤除菌.

1.2.3 细胞-基质黏附实验: 细胞培养至对数生长期, 0.25%胰酶常规消化, 制成单细胞悬液, 分别接种于6孔细胞培养板各孔中, 24 h后加入含四藤方提取物的培养基, 实验组终浓度分别为200、100、50 mg/L, 对照组加入与药物等体积的PBS. 作用24 h后在不含药物的培养基中继续培养24 h, 以此时间点仍贴壁的活细胞作为以下实验对象.

取出Cytoselect 48-Well Cell Adhesion Assay(fibronectin-Coated, Colorimetric format)试剂盒室温下平衡10 min. 收获上述药物干预后各组细胞, 用无血清培养基制成单细胞悬液, 计数, 调整浓度为5×10⁸ cells/L. 48孔板中每孔加入150 μL细胞悬液, BSA包被的孔作为非特异性对照. 每孔设3个复孔. 细胞培养箱内孵育90 min,吸弃培养液, 每孔用PBS轻洗4次后, 各孔再加入Cell Stain Solution 200 μL, 置室温下10 min, 再次吸掉液体, 以蒸馏水清洗各孔4次后风干. 最后每孔加入200 μL Extraction Solution放在摇箱内孵育10 min. 每孔移出150 μL到96孔板中经酶标仪在560 nm处读取各孔吸光度A值.

1.2.4 细胞侵袭实验: 利用Transwell小室膜上面涂Matrigel胶可较好模拟肿瘤细胞侵袭模型. 终浓度分别为200、100、50 mg/L四藤方提取物预处理24 h 后, 收集细胞用无血清培养基制成1×10⁹个/L的细胞悬液, Transwell小室上室中加100 μL细胞悬液, 下室中加600 μL含100 mL/L胎牛血清的培养基. 每孔设3个复孔. 37 ℃, 50 mL/L CO₂培养24 h. 取出小室, 棉签擦去小室上面未侵袭细胞, PBS清洗, 0.1%结晶紫染色10 min, 清洗风干, 光镜下观察记录膜背面侵袭的细胞数, 共计数中央和四周各5个视野(×100), 取平均值, 计算侵袭抑制率: 侵袭抑制率 = (对照组侵袭细胞数-实验组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数. 实验重复3次.

1.2.5 划痕实验方法: 参考文献[6,7]报道的方法将对数生长期的SGC-7901细胞以0.25%胰蛋白酶消化, 用含100 mL/L胎牛血清的培养液制成细胞悬液, 按1×106个/孔的密度接种到6孔板, 24 h后吸掉培养液, PBS洗涤1次, 用10 μL Tip头沿着培养板底部划"一"字形划痕. PBS再次洗去未贴壁细胞, 实验组配成终浓度为50 mg/L的四藤方提取物的不含血清的DMEM培养液, 对照组加入无血清培养基及同体积PBS培养. 拍照记录为0 h划痕间距, 并分别于24、48 h观测划痕间距. 所得图像数据用Image Pro Plus 6.0分析处理. 在划痕每侧边缘均匀选取30个点后取其中线代表划痕边缘, 测量划痕间距, 并用以下公式计算迁移率: n小时细胞迁移率 = 边缘距离(0 h)-边缘距离(24 h)/边缘距离(0 h). 实验重复3次.

统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行数据分析. 数据以mean±SD表示. 样本均数间比较行方差分析(One-way ANOVO), q检验P<0.05为差异有统计学意义, P<0.01为差异有显著性统计学意义.

2 结果

2.1 细胞-基质黏附实验

细胞黏附实验结果显示不同浓度的四藤方作用后黏附细胞减少, 与对照组相比差异显著(P<0.01, 表1). 提示四藤方可以抑制SGC-7901胃癌细胞黏附.

表1 四藤方对SGC-7901细胞黏附能力的影响 (mean±SD, n = 3).

分组	A值	F值
对照组	1.34±0.12
四藤方50 mg/L组	0.34±0.05b	235.99
四藤方100 mg/L组	0.13±0.00bd
四藤方200 mg/L组	0.12±0.01bd

^bP<0.01 vs 对照组;

^dP<0.01 vs 四藤方50 mg/L组.

2.2 四藤方对SGC-7901细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示, 四藤方不同浓度组穿膜细胞数显著低于对照组(P<0.01), 不同浓度四藤方组间差异均有统计学意义(P<0.01, 表2, 图1). 提示四藤方可以抑制SGC-7901胃癌细胞侵袭.

图1 四藤方对SGC-7901细胞侵袭能力的影响(×40). A: 对照组; B: 四藤方50 mg/L组; C: 四藤方100 mg/L组; D: 四藤方200 mg/L.

表2 四藤方对SGC-7901细胞的侵袭能力的影响 (mean±SD, n = 3).

分组	穿膜细胞数(n)	侵袭抑制率(%)	F值
对照组	80±5
四藤方50 mg/L组	39±3b	51.25
四藤方100 mg/L组	26±6bd	67.50	199.12
四藤方200 mg/L组	8±2bdf	90.00

^bP<0.01 vs 对照组;

^dP<0.01 vs 四藤方50 mg/L组;

^fP<0.01 vs 四藤方100 mg/L组.

2.3 50 mg/L四藤方对SGC-7901细胞移动能力影响

经过划痕处理, 随时间延长, SGC-7901胃癌细胞逐渐向痕迹内部生长、迁移, 四藤方作用后迁移细胞数减少; 对照组24 h细胞迁移率为17.74%±3.01%, 四藤方50 mg/L组细胞迁移率为11.11%±3.96%, 但差异无统计学意义; 实验组48 h细胞迁移率明显低于对照组, 差异有显著性(P<0.01, 表3, 图2).

图2 50 mg/L四藤方对SGC-7901细胞移动能力的影响(×40). A, B, C: 对照组0, 24, 48 h; D, E, F: 四藤方50 mg/L组0, 24, 48 h.

表3 四藤方对SGC-7901细胞移动能力的影响 (%, mean±SD, n = 3).

分组	24 h迁移率	48 h迁移率
对照组	17.74±3.01	59.68±5.98d
四藤方50 mg/L组	11.11±3.96	28.57±4.10bd

^bP<0.01 vs 对照组;

^dP<0.01 vs 24 h迁移率.

3 讨论

侵袭及转移是恶性肿瘤的主要特征之一, 与肿瘤预后直接相关, 是胃癌治疗失败的主要原因之一. 肿瘤侵袭是一个复杂的过程, 涉及多个因素和步骤, Liotta[8]早在1986年提出了恶性肿瘤的侵袭3步学说, 第1步: 细胞与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)黏附; 第2步: 肿瘤细胞本身或诱导宿主细胞分泌蛋白水解酶, 降解基质; 最后1步即趋化介导的细胞运动和迁移. 肿瘤细胞与基底膜的异质性黏附是肿瘤细胞侵袭转移的前提, 当肿瘤细胞与ECM黏附后穿透血管或淋巴管的基底膜, 进一步运动迁移, 从而向周围组织侵袭. 细胞必须获得移动的能力才能侵入组织和血管[9,10]. 许多黏附和信号分子包括整联蛋白(integrins)、CD44、和一些免疫球蛋白的功能区细胞黏附分子(immune globulin cell adhesion molecules, IgCAMs)在细胞的迁移和肿瘤侵袭过程当中都起着重要作用[11-14]. 但是, 有些分子具有多效的调节作用, 比如神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule)能阻止肿瘤转移[15]却又能促进肿瘤细胞上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[16]这可能与黏附分子的亚型和肿瘤细胞生长环境有关.

传统中医理论认为癌病多与"虚"、"瘀"、"痰"、"毒"有关, 胃肠安系胃癌临床验方, 具有健脾理气、清热解毒、软坚散结作用, 前期研究表明胃肠安具有抗胃癌转移作用[2], 但其中药作用机制未明, 本实验从胃肠安方中选取主要祛邪中药组成四藤方, 研究其对人胃癌SGC-7901细胞转移生物学行为的影响, 结果表明不同浓度四藤方均可显著抑制SGC-7901细胞黏附、侵袭能力. 纤粘连蛋白(fibronectin, FN)是基底膜和ECM的重要组成部分, 是一种具有高度黏附活性的糖蛋白, 他具有多种功能, 主要包括黏附, 细胞转化, 创伤修复, 及与胶原和糖胺多糖结合促进细胞运动等. 他在胚胎和创伤治愈期能促进细胞的运动, 并发现在癌组织中可促进癌细胞的黏附和移动, 具有促进癌的浸润作用[17]抑制黏附可以进一步抑制肿瘤侵袭[18]. 自ESH肉瘤提取的人工基质胶(Matrigel)主要成分层粘素是基膜和ECM的主要成分. 故研究以FN包被的黏附实验试剂盒来观察细胞黏附力; Matrigel观察细胞的侵袭力, 能反映SGC-7901细胞异质黏附的能力, 较有效地在体外模拟肿瘤细胞侵袭过程. 有研究揭示了肿瘤细胞进入血管是自身先朝着血管的方向排列后, 然后开始定向迁移[19-21]. 肿瘤细胞从血管内再进入到组织器官跟细胞进入血管机制相同, 主要和整联蛋白、埃兹蛋白(ezrin)有关[22,23].

划痕实验当中, 四藤方作用48 h后实验组划痕间距明显小于对照组, 细胞迁移率与对照组相比差异显著. 目前认为, 细胞迁移是在肌动蛋白连续的聚合及解聚的循环作用下开始进行的, 丝切蛋白协同细胞膜的突伸完成移动并与ECM黏附[24]. 丝切蛋白及其他的作为细胞骨架重要组成部分的肌动蛋白大半是由RHO家族鸟苷三磷酸酶调控的[25,26]. 而整联蛋白信号途径则通过调节RHO家族鸟苷三磷酸酶活性对肿瘤细胞迁移和侵袭起着关键作用[12]. 研究表明[27]肿瘤细胞可以通过改变自身特性适应不同的环境条件进行侵袭. 一项在鼠身上进行的活体成像研究清楚的显示了肿瘤细胞沿着ECM胶原纤维快速的变形运动[28]. 细胞有可能通过调整细胞迁移过程中作为细胞骨架重要组成部分的微管和肌动蛋白结构和(或)动力学变化, 而影响细胞迁移的发生[29]. 还有研究指出转移性肿瘤细胞和非转移性细胞在移动能力上并没太大不同, 只在移动定向上有所区别. 如非转移性的乳房肿瘤细胞运动表现出任意的无方向性的, 而具有转移性的肿瘤细胞则朝着血管的方向移动[30].

总之, 四藤方对胃癌细胞黏附、侵袭、移动能力都有一定的抑制作用, 提示四藤方可能是胃肠安抑制胃癌转移的主要中药, 但作用分子机制都有待进一步深入研究.

评论

背景资料

胃癌是我国高发病率的恶性肿瘤. 胃癌转移是患者死亡的主要原因, 也是胃癌治疗所面临的最大障碍, 他是严重危害人民生命健康的疾病之一, 积极寻求中药抗胃癌转移的方法显得尤为必要.

同行评议者

王学美, 研究员, 北京大学第一医院中西医结合研究室

研发前沿

抑制胃癌细胞与细胞质基质黏附及侵袭是寻求抗胃癌转移的方法之一, 也是现在的研究热点. 但国内该项研究限于体外实验, 利用动物活体成像系统进行体内研究肿瘤细胞运动、侵袭.

相关报道

文献中报道的通过体外单层细胞划痕实验方法简便易行, 花费较低, 且具有较高的科学实用价值. 是进行细胞体外移动能力实验研究较理想的模型. 与其他实验方法比较, 该方法更适合研究细胞与基质及细胞之间相互作用, 对细胞迁移作用的影响.

创新盘点

在研究肿瘤细胞黏附、侵袭能力时, 预先使用药物干预细胞, 以尽量排除药物对细胞增殖的抑制作用, 造成对黏附, 侵袭实验的影响. 在划痕实验中, 没有用划痕的绝对间距进行结果统计, 而是用划痕间距的相对比值(迁移率)进行计算, 避免了在细胞单层划"一"字形痕迹时, 各组划痕间距不一致造成的对实验结果的影响.

应用要点

探索寻找抗胃癌及胃癌转移的中药, 为临床应用提供实验依据. 目前胃癌治疗面临很多问题, 如癌症一般发现时多是晚期, 多数患者失去手术机会, 而化学疗法不良反应较大. 积极探索中医药治疗胃癌, 丰富治疗恶性肿瘤的方法具有很好的科研及临床意义.

同行评价

本文研究思路清晰, 实验方法详细, 对寻找抗肿瘤的中药处方及研究其机制具有临床意义.

备注

编辑:李薇 电编:何基才

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