RegⅣ在大肠癌中的表达及其临床意义

摘要

目的: 探讨Reg Ⅳ蛋白在大肠癌发生发展中的作用.

方法: 免疫组织化学染色检测60例临床大肠腺癌组织及其癌旁组织和30例大肠腺瘤组织中RegⅣ蛋白的表达.

结果: RegⅣ蛋白在癌旁组织、腺瘤和癌组织中的阳性表达率分别为75.00%、86.6%和63.33%, 差异具有统计学意义(P<0.01). RegⅣ蛋白与大肠癌进展无显著相关性(P>0.05). RegⅣ蛋白的表达与性别、年龄、肿瘤分级和有无淋巴结转移均无显著性差异(P>0.05).

结论: RegⅣ蛋白是一个在大肠癌发生发展中差异表达的肿瘤相关基因, 可能在腺瘤向腺癌转化的早期阶段起作用, 而与肿瘤的进展无关.

关键词: 大肠癌; RegⅣ蛋白; 免疫组织化学

Clinical significance of Reg IV protein expression in human colorectal cancer

Sheng-Qin Zheng, Jie He, Pei-Lin Huang, Jian-Hua Wang

Sheng-Qin Zheng, Department of Oncology, the Second Hospital of Nanjing, Nanjing 210003, Jiangsu Province, China

Jie He, Department of Pathology, the Fourth People's Hospital of Wuxi City, Wuxi 214062, Jiangsu Province, China

Pei-Lin Huang, Department of Pathology, School of Basic Medical Science, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Jian-Hua Wang, Department of Pathology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Correspondence to: Associate Professor Jie He, Department of Pathology, the Fourth People's Hospital of Wuxi City, Wuxi 214062, Jiangsu Province, China. hejie2005@sina.com

Received: September 1, 2010
Revised: October 17, 2010
Accepted: October 26, 2010
Published online: November 28, 2010

Abstract

AIM: To investigate the expression and distribution of Reg IV protein in colorectal cancer and to elucidate the role of Reg IV in the carcinogenesis and progression of colorectal cancer.

METHODS: The expression of Reg IV protein in 30 colorectal adenoma specimens and 60 colorectal adenocarcinoma specimens was detected by immunohistochemistry.

RESULTS: The positive expression rates of Reg IV protein were 75.00%, 86.67% and 63.33% in tumor-adjacent tissue, colorectal adenoma and colorectal adenocarcinoma, respectively. Reg IV protein expression showed no significant correlation with tumor histological grade (P > 0.05) or lymph node metastasis (both P > 0.05) in colorectal adenocarcinoma.

CONCLUSION: Reg IV protein may play an important role in the early stage of colorectal tumorigenesis but be not directly associated with carcinoma progression.

Key Words: Colorectal adenocarcinoma; Reg IV protein; Immunohistochemistry

0 引言

大肠癌(colorectal cancer)包括结肠癌和直肠癌, 是我国常见的恶性肿瘤之一, 其发病率呈上升趋势. 据统计, 在经济发展较快的城市和地区, 近年来大肠癌的发病率已由原来恶性肿瘤的第4位上升为仅次于肺和胃癌之后的第3位. 近年来, 随着分子生物学的迅速发展, 肿瘤发病的分子机制正逐渐被阐明, 与大肠癌发生发展和生物学特性相关的分子机制的研究也日益受到关注.

再生基因家族成员4(regenerating islet-derived family, member 4, RegⅣ)是Reg家族最新的成员. 组织芯片研究表明, RegⅣ主要在消化系统中表达, 包括胃、小肠、结肠及胰腺. 尽管多种正常组织可表达非常低水平的RegⅣ, 但在结直肠腺癌、腺瘤中RegⅣ的表达明显增加, 且与结肠癌的分化程度、分期及淋巴结转移相关[1]. RegⅣ是Reg家族在大肠腺瘤中高表达的差异表达基因. 该基因在正常胃肠道及胰腺表达水平非常低, 在炎症或肿瘤时可见原位或异位高表达. Zhang等[2]建立了一个同时患有结肠腺瘤及结肠腺癌的病例的正常结肠黏膜、腺瘤及腺癌3个差减文库, 通过抑制性差减杂交筛选出差异表达基因RegⅣ, 并用反向Northern blot证实, 从而证明他的表达与腺瘤的形成、腺癌的发生有关, 是结直肠癌发生的早期事件, RegⅣ可能在结直肠腺瘤的分化起始中扮演重要角色, 而他的检测可能在结直肠腺瘤的形成中起到早期诊断的作用; 基因表达系列表达分析(serial analysis of gene expression, SAGE)结果也显示: RegⅣ在结肠正常黏膜、结肠腺癌、胰腺癌、胃癌和前列腺癌中表达, 通过分析结果还可以预测该基因在不同组织中的表达量的水平. 通过SAGE表达谱预测之后, 发现RegⅣ可能是一个提示消化系统癌微转移的有效标志物[3]. Brambilla等[4]的研究显示在结直肠腺癌、腺瘤中RegⅣ的表达明显增加, 且与结肠癌的分化程度、分期及淋巴结转移相关. RegⅣ与消化系肿瘤的发生、发展、转移、抗药性及预后密切相关, 其可能成为预防、诊断和治疗整个消化系肿瘤的新的重要靶分子[5]. 因此, 本研究采用免疫组织化学染色法检测RegⅣ蛋白在大肠腺癌组织及其癌旁组织和大肠腺瘤组织中的表达, 为阐明RegⅣ与大肠腺癌的关系, 探讨RegⅣ蛋白在大肠腺癌中的作用提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

石蜡标本大肠腺瘤30例[男21例, 女9例, 年龄42-81(中位年龄66±11.7)岁], 大肠腺癌及癌旁正常组织[男32例, 女28例, 年龄35-89(中位年龄66±11.8)岁]标本各60例, 根据2000年WHO诊断标准, 腺癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级分别为10例、40例和10例, 胃腺癌20例, 均取自东南大学附属中大医院病理科, 患者均知情同意, 并得到了医院伦理会的批准. 羊抗人RegⅣ多克隆抗体(IES01, 美国R&D公司); HRP标记兔抗羊IgG抗体(丹麦DAKO公司).

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色: 石蜡包埋的组织5 μm厚连续切片, 57 ℃烤片30 min, 以减少脱片. 切片梯度脱蜡至水: 二甲苯Ⅰ(10 min)→二甲苯Ⅱ(10 min)→无水乙醇Ⅰ(10 min)→无水乙醇Ⅱ(10 min)→95%乙醇(10 min)→80%乙醇(10 min)→自来水水洗3 min以上→PBS洗(立缸)3次共10 min. 供免疫组织化学染色. 免疫组织化学染色采用SP法, 操作程序或方法按照SP系列工作液试剂盒SP9003说明进行. (1)将组织切片在3%过氧化氢室温孵育5-10 min, 以消除内性源过氧化物酶的活性; (2)蒸馏水冲洗, PBS浸泡5 min; (3)5%-10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭, 室温孵育10 min; (4)倾去血清, 勿洗, 分别滴加一抗羊抗人RegⅣ多克隆抗体(1:50), 37 ℃孵育1-2 h; (5)PBS冲洗, 2 min×3次; (6)分别滴加(1:100)的生物素标记兔抗羊IgG二抗, 37 ℃孵育20 min; (7)PBS冲洗, 2 min×3次; (8)滴加适当比例稀释的辣根酶标记霉链卵白素(PBS稀释), 37 ℃孵育20 min; (9)PBS冲洗, 2 min×3次; (10)显色剂DAB显色; (11)自来水充分冲洗, 苏木素复染细胞核, 封片.

2 结果

RegⅣ蛋白阳性部位在大肠癌旁组织、腺瘤和腺癌组织中定位于细胞质, 少数病例伴有胞核着色, 呈棕黄色(图1). RegⅣ蛋白在大肠癌发生发展过程中, 其在癌旁组织与腺瘤和癌组织中的表达相比均有显著性差异(P<0.01), 但在癌组织与腺瘤间RegⅣ蛋白的表达差异无显著性(P>0.05, 表1). 而RegⅣ蛋白在癌旁组织、腺瘤和癌组织中的表达强度相比均有显著性差异(P<0.01), 表达强度顺序依次为癌旁组织>腺瘤组织>癌组织; RegⅣ蛋白的表达在性别、年龄、肿瘤分级和有无淋巴结转移上均无显著性差异(P>0.05, 表2).

表1 RegⅣ蛋白在大肠腺瘤、腺癌、及癌旁组织中的表达.

组织类型	n	RegⅣ表达
		-(n)	+(n)	++(n)	+++(n)	阳性率(%)	表达强度(%)
癌旁组织	60	15	3	19	23	75.00	70.0
腺瘤组织	30	4	9	10	7	86.67b	56.6d
腺癌组织	60	22	15	17	6	63.33b	38.3cd

阳性率: χ² = 12.032, χ² = 19.401,

^bP<0.01 vs 癌旁组织; 表达强度: χ² = 8.231,

^cP<0.05 vs 腺瘤组织; χ² = 14.187, χ² = 25.683,

^dP<0.01 vs 癌旁组织. 表达强度是++和+++所占的比率.

图1 免疫组织化学SP法示RegⅣ蛋白在大肠癌旁正常组织、大肠腺瘤及腺癌组织中的表达(HE). A: 正常肠黏膜; B: RegⅣ蛋白阴性和阳性表达; C: 大肠腺瘤; D: RegⅣ蛋白阴性和阳性表达; E: 大肠腺癌Ⅱ级; F: RegⅣ蛋白胞质阳性表达.

表2 RegⅣ基因与大肠癌生物学行为的关系.

	n	旁组织(n)		癌组织(n)		n	腺瘤组织(n)
		-	+	-	+		-	+
性别
男	32	8	24	13	19	17	3	14
女	28	7	21	9	19	13	1	12
χ2值		0.357		0.763			0.632
P值		0.618		0.341			0.409
年龄(岁)
>50	54	15	39	20	34	28	3	25
<50	6	0	6	2	4	2	1	1
χ2值		2.222		0.032			2.493
P值		0.163		0.616			0.253
分级
Ⅰ	10			2	8
Ⅱ	40			16	24
Ⅲ	10			4	6
χ2值				1.435
P值				0.488
淋巴结转移
有	26			9	17
无	34			13	21
χ2值				0.083
P值				0.494

3 讨论

众所周知, 大肠癌的发生大都经历着腺瘤-腺癌发展模式, 是多基因、多因素参与、多步骤形成的复杂过程. 大肠癌的发生发展一般可分为启动、发展和演变3个阶段, 这种有顺序的进展是由于多种基因突变, 例如腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli, APC)基因, Ras, 大肠癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma gene, DCC), p53及错配修复基因等进行性积累, 表现为细胞增殖和细胞凋亡数量间的失衡, 使正常结直肠黏膜上皮细胞增生为息肉, 然后转变为腺瘤, 继之恶性转化为腺癌. 在正常大肠黏膜演变成癌的过程中, 正常的大肠黏膜最初由上皮增生发展成为良性的腺瘤, 再经腺癌发展成为转移癌. 国内学者发现RegⅣ mRNA水平在结直肠腺瘤中高表达;经原位杂交方法分析, RegⅣ mRNA水平与结直肠腺瘤的发育不良严重程度相关, 提示RegⅣ的过表达可能是结直肠癌发生的早期事件, RegⅣ过表达的检测可能有益于腺瘤向癌转变的早期诊断[6-8].

本研究发现RegⅣ在癌旁组织、大肠腺癌组织和腺瘤组织中表达明显上调, 其表达率分别为75.00%、86.67%和63.33%, 癌旁组织、腺瘤和腺癌组织相比表达均有显著性差异(P<0.01). RegⅣ蛋白在大肠癌旁组织中表达75. 00%, 进展到腺瘤阶段表达86.67%, 但是发展到腺癌后, 其表达反而下降为63.33%, 说明RegⅣ是一个在大肠癌发生发展中差异表达的肿瘤相关基因, 可能在腺瘤向腺癌转化的早期阶段起作用, 而与肿瘤的进展无关. Zhang等[9]也曾报道, RegⅣ mRNA在结直肠腺瘤-癌进程中癌变阶段丰度最高, 认为RegⅣ过度表达可能是结直肠癌发生的早期事件. 本研究通过对RegⅣ在正常肠黏膜、大肠腺癌和腺瘤中的表达强度的分析, 也显示RegⅣ在癌旁组织中表达阳性强度明显高于腺瘤组织, 而腺瘤组织明显高于腺癌组织. 国外也有学者研究发现RegⅣ在癌旁组织和腺瘤组织中表达上调, 而腺瘤组织中表达降低, 认为RegⅣ可能是肠黏液腺癌的一个标志物, 可能成为肠癌新的分子靶向治疗的代表[10].

本研究结果还表明大肠腺癌中RegⅣ蛋白的表达与性别、年龄、肿瘤分级和有无淋巴结转移均无相关性, 说明其与大肠癌的进展无显著性相关. RegⅣ基因在大肠癌进展中为何不起作用, 是否是表观遗传机制发生改变, 将作为我们下一个研究方向. Pankova-Kholmyansky等[11]以APC基因的一个无意突变小鼠做原始模型研究RegⅣ在结肠癌发生中的作用机制时发现: RegⅣ的表达增加发生在APC二次突变之前, 而腺瘤发生于二次突变之后. 提示RegⅣ在结肠癌前病变区、腺瘤的发展和扩展过程中有重要作用, RegⅣ可能是对癌前病变的一个促进作用. 因此, RegⅣ可能就是人们一直追寻的生物学标志物: 可以判断结肠黏膜是否有转变为腺瘤或腺癌的危险.

有关RegⅣ蛋白的生物学功能目前所知较少, Zhang等[6]报道RegⅣ mRNA在结直肠腺瘤癌进程中丰度最高, 认为RegⅣ过度表达可能是结直肠癌发生的早期事件. Violette等[12]研究结肠癌耐药相关基因发现RegⅣ mRNA过度表达可能与结肠癌细胞对52氟尿嘧啶和甲氨蝶呤的耐药有关; RegⅣ也可能通过抑制凋亡参与肿瘤细胞的生长. Gu等[13]对前列腺癌的研究亦表明RegⅣ在肿瘤生长、抑制凋亡方面具有一定作用. 而且目前已有人通过细胞实验发现RegⅣ阳性的结直肠癌细胞对放射线敏感性降低, 初步显示了RegⅣ在结直肠癌放射治疗中的重要意义[14]. 因此, 进一步探讨RegⅣ蛋白的功能可能为临床应用提供重要的实验依据, 其可能成为预防、诊断和治疗整个消化系肿瘤的新的重要靶分子.

评论

背景资料

RegⅣ是再生基因家族的新成员, 其在消化系统尤其是大肠癌中的作用越来越受到人们的关注.

同行评议者

颜宏利, 教授, 中国人民解放军第二军医大学遗传学教研室

相关报道

有学者研究发现, RegⅣ在癌旁组织和腺瘤组织中表达上调, 而腺瘤组织中表达降低, 认为RegⅣ可能是肠黏液腺癌的一个标志物, 可能成为肠癌新的分子靶向治疗的代表.

创新盘点

国内目前还少有人在大肠癌癌旁组织、腺瘤及腺癌中进行RegⅣ的研究. 本研究采用免疫组织化学染色法检测RegⅣ蛋白在大肠腺癌组织及其癌旁组织和大肠腺瘤组织中的表达, 为阐明RegⅣ与大肠腺癌的关系, 探讨RegⅣ蛋白在大肠腺癌中的作用提供实验依据.

应用要点

RegⅣ蛋白是一个在大肠癌发生发展中差异表达的肿瘤相关基因, 可能在腺瘤向腺癌转化的早期阶段起作用, 而与肿瘤的进展无关.

同行评价

本文可读性较好, 为大肠癌的治疗奠定了实验基础.

备注

编辑:李薇 电编:何基才

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