基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-10-18; 18(29): 3078-3083
在线出版日期: 2010-10-18. doi: 10.11569/wcjd.v18.i29.3078
苦参碱对肝癌细胞株SMMC-7721凋亡和自噬相关基因表达的影响
查勇, 寸英丽, 黄云超
查勇, 寸英丽, 黄云超, 昆明医学院第三附属医院 云南省肿瘤医院腹部肿瘤外科 云南省昆明市 650118
查勇, 主治医师, 主要从事腹部肿瘤外科的基础和临床方面的研究.
基金项目: 云南省自然科学基金资助项目, No. 2009CD184.
通讯作者: 黄云超, 教授, 650118, 云南省昆明市昆州路519号, 昆明医学院第三附属医院. zhayong888@sina.com
电话: 0871-8185656-2572
收稿日期: 2010-06-16
修回日期: 2010-09-16
接受日期: 2010-09-27
在线出版日期: 2010-10-18

目的: 研究苦参碱对肝癌细胞株SMMC-7721凋亡的影响及其分子机制.

方法: 肝癌细胞分组为: 5-FU治疗组、苦参碱治疗组、5-FU联合苦参碱治疗组及对照组. 5-FU和苦参碱的给药浓度分别为半数肝癌细胞抑制浓度. 用流式细胞仪检测各组肝癌细胞凋亡率. 采用RT-PCR检测苦参碱对转录因子NF-κB p65、IκB、凋亡抑制基因Bcl-2和自噬相关基因Atg5和Beclin1表达的影响.

结果: 流式细胞仪检测结果提示, 苦参碱联合5-FU组的肝癌细胞凋亡率比5-FU治疗组、苦参碱治疗组及对照组高, 组间比较存在显著差异(81.3%±2.6% vs 34.6%±3.5%, 45.6%±2.4%, 5.2%±2.1%, 均P<0.05). RT-PCR检测结果显示, 与5-FU组相比, 苦参碱联合5-FU治疗组中NF-κB p65、Bcl-2表达下降(P<0.05), IκB、Atg5及Beclin1表达上调(P<0.05).

结论: 苦参碱可通过上调IκB、Atg5及Beclin1的表达和下调NF-κB p65、Bcl-2的表达, 促进肝癌细胞凋亡, 提高肝癌细胞的化疗敏感性.

关键词: 苦参碱; 肝癌; 凋亡; 自噬
引文著录: 查勇, 寸英丽, 黄云超. 苦参碱对肝癌细胞株SMMC-7721凋亡和自噬相关基因表达的影响. 世界华人消化杂志 2010; 18(29): 3078-3083
Matrine promotes cell apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721
Yong Zha, Ying-Li Cun, Yun-Chao Huang
Yong Zha, Ying-Li Cun, Yun-Chao Huang, Department of Abdominal Surgery, the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650118, Yunnan Province, China
Supported by: the Natural Science Foundation of Yunnan Province of China, No. 2009CD184.
Correspondence to: Professor Yun-Chao Huang, the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical College, 519 Kunzhou Road, Kunming 650118, Yunnan Province, China. zhayong888@sina.com
Received: June 16, 2010
Revised: September 16, 2010
Accepted: September 27, 2010
Published online: October 18, 2010

AIM: To investigate the effect of matrine on cell apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 and to explore potential mechanisms involved.

METHODS: SMMC-7721 cells were divided into four groups: 5-fluorouracil group, matrine group, 5-FU plus matrine group, and control group. Matrine and 5-FU were administered at the half maximal inhibitory concentration. After 24 h, apoptosis was analyzed by flow cytometry. To identify genes involved in the antiapoptotic responses to 5-FU and matrine, the expression of NF-κB p65, IκB, Atg5, beclin1 and Bcl-2 was determined.

RESULTS: Increased sensitivity to 5-FU was observed in cells in the matrine plus 5-FU group as compared with those in the 5-FU group and control group (81.3% ± 2.6% vs 34.6% ± 3.5%, 45.6% ± 2.4%, 5.2% ± 2.1%, all P < 0.05). Compared to cells treated with 5-FU alone, cells exposed to a combination of matrine and 5-FU for 24 h had a significant reduction in the levels of NF-κB p65 and Bcl-2 (P < 0.05) and an increase in the levels of IκB, Atg5 and beclin1 (P < 0.05).

CONCLUSION: Matrine can enhance the sensitivity of SMMC-7721 cells to 5-FU by inducing increased expression of autophagy-related gene and decreased expression of anti-apoptotic genes.

Key Words: Matrine; Hepatocellular carcinoma; Apoptosis; Autophagy
0 引言

肿瘤细胞凋亡功能障碍与其化学治疗敏感性差存在密切的关系, 有研究表明[1-3], 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)和阿霉素等化学药物可诱导肝癌细胞中NF-κB转录因子(nuclear factor-κB, NF-κB)激活, 而NF-κB转录因子激活可促进凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)和B细胞淋巴瘤/白血病-2因子(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)等的表达, NF-κB激活与肝癌细胞的凋亡耐受存在密切的关系[4-6].

苦参碱是中药苦参、山豆根和苦豆子的主要成分, 经临床证实苦参碱可抑制机体的炎症反应[7,8]. 亦有研究表明苦参碱可诱导肝癌细胞发生自噬和凋亡, 但苦参碱抗炎、抗肿瘤生长的分子机制尚未完全阐明[9-11]. 本实验中, 我们进一步观察苦参碱对肝癌细胞凋亡和化学治疗敏感性的影响, 分析其作用机制.

1 材料和方法
1.1 材料

肝癌细胞株SM-7721(中科院上海细胞库), 高糖DMEM细胞培养基(Hyclone公司), 胎牛血清(Hyclone公司), 苦参碱(西安东华生物工程技术有限责任公司), 5-FU(上海海普药业有限公司), RNA提取试剂TRIzol(Invitrogen公司), RT-PCR引物(根据软件Oligo和Premier设计, 由上海生工生物工程公司合成, 表1), 一步法RT-PCR检测试剂盒(Invitrogen公司).

表1 RT-PCR引物序列.
基因引物序列
β2-GM5'-TTAGCTCTCGCGCTACTCCTCTC-3'
5'-GTCGGATTGATGAAACCCAGACACA-3'
NF-κB p655'-GGGAAGGAACGCTGTCAGAG-3'
5'-TAGCCTCAGGGTACTCCATCA-3'
IκB5'-GATCCGCCAGGTGAAGGG-3'
5'-GCAATTTCTGGCTGGTTGG-3'
Bcl-25'-GTGGAGGAGCTCTTCAGGAG-3'
5'-AGGCACCCAGGGTGATGATGCAA-3'
Beclin15'-ACCAGATGCGTTATGCCC-3'
5'-TTGATTGTGCCAAACTGTCC-3'
Atg 55'-TATCATCCCACAGCCAACAG-3'
5'-TCTTCTTAGGCCAAAGGTTTC-3'
1.2 方法

1.2.1 实验分组: 按照处理因素的不同将SM-7721肝癌细胞实验分组为: 5-FU治疗组、苦参碱治疗组、5-FU联合苦参碱治疗组和对照组. 参照文献[12,13], 本实验中我们采用选择5-FU和苦参碱的给药浓度为细胞半数抑制浓度, 分别为4.7×10-3 mol/L和5.3×10-6 mol/L, 用药处理时间为48 h.

1.2.2 细胞培养: SMMC-7721细胞采用高糖DMEM培养, 培养液中含100 mL/L的胎牛血清, 置入含50 mL/L CO2的培养箱中, 温度为37 ℃.

1.2.3 流式细胞仪检测肝癌细胞的凋亡: 应用流式细胞仪, 采用TUNEL法检测肝癌细胞的凋亡, 用0.25%-0.5%的胰酶消化6孔板中各实验组细胞, 收集放入EP管中. PBS洗涤细胞, 离心收集细胞, 40 mL/L多聚甲醛固定细胞, TUNEL法标记后, 进行流式细胞分析.

1.2.4 RT-PCR检测p65 siRNA干扰后相关基因的表达: 采用TRIzol法提取各组细胞总RNA, 总RNA紫外分光光度计测A260、A280值, 标本的总RNA的A260/A280值均在1.6-1.8. 按照Invitrogen公司RT-PCR试剂盒设定反应体系, RT-PCR反应条件: NF-κB p65的反应参数为94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 32循环, 最后72 ℃ 10 min (扩增产物长为204 bp). IκB的反应参数为94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 32循环, 最后72 ℃ 10 min(扩增产物长为304 bp). β2-GM的反应参数为94 ℃ 45 s, 55.5 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 32循环, 最后72 ℃ 10 min(扩增产物长为264 bp). Bcl-2的反应参数为94 ℃ 45 s, 45.5 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 32循环, 最后72 ℃ 10 min(扩增产物长为280 bp). Beclin1的反应参数为94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 32循环, 最后72 ℃ 10 min(扩增产物长为320 bp). Atg5的反应参数为94 ℃ 45 s, 53.5 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 32循环, 最后72 ℃ 10 min(扩增产物长为332 bp).

RT-PCR产物电泳检测后, 紫外灯下观察, 用美国Gene-Genus凝胶电泳成像系统对DNA电泳条带进行光密度β扫描, 以目标基因与β-actin的密度作为目标基因表达水平的参数.

统计学处理 采用SPSS11.0统计软件, 计量资料用mean±SD表示, 两样本均数比较采用成组t检验, 计数资料比较采用χ2检验. P<0.05认为具有统计学意义.

2 结果
2.1 流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率

苦参碱可促进肝癌细胞凋亡, 抑制坏死性死亡. 苦参碱联合5-FU组肝癌细胞凋亡率为81.3%±2.6%, 5-FU治疗组为34.6%±3.5%, 苦参碱治疗组为45.6%±2.4%, 对照组为5.2%±2.1%, 组间比较存在显著差异(P<0.05); 苦参碱联合5-FU组肝癌细胞坏死率为8.3%±2.2%, 5-FU治疗组为15.4%±2.5%, 苦参碱治疗组为5.3%±1.8%, 对照组为2.7%±1.5%(图1). 苦参碱联合5-FU治疗组与5-FU治疗组细胞坏死率比较, 组间存在显著差异(P<0.05); 苦参碱治疗组与对照组细胞坏死率比较, 组间存在显著差异(P<0.05).

图1
图1 流式细胞仪检测肝癌细胞SMMC- 7721的凋亡率. A: 5-FU联合苦参碱组; B: 5-FU治疗组; C: 苦参碱治疗组; D:对照组.
2.2 苦参碱对肝癌细胞NF-κB p65转录因子及其抑制因子表达的影响

肝癌细胞株SMMC-7721 NF-κB p65 mRNA高表达, IκB低表达, 5-FU可使NF-κB p65的表达进一步升高, 而苦参碱能有效的降低NF-κB p65的表达, 上调IκB的表达. 对照组、苦参碱联合5-FU治疗组、5-FU治疗组、苦参碱治疗组肝癌细胞中NF-κB p65 mRNA表达与β-actin的比分别为0.30±0.04、0.82±0.06、1.50±0.08和0.15±0.03; IκB mRNA表达与β-actin的比分别为0.72±0.06、0.84±0.03、0.23±0.02和1.16±0.05(图2).

图2
图2 各组细胞中自噬和凋亡相关基因的表达. A: Bcl-2; B: Atg5; C: Beclin1; D: NF-κB p65; E: IκB. M: Marker; 1: 对照组; 2: 苦参碱联合5-FU治疗组; 3: 5-FU治疗组; 4: 苦参碱治疗组.
2.3 苦参碱对肝癌SMMC-7721细胞自噬和凋亡相关基因表达的影响

RT-PCR检测凋亡抑制基因Bcl-2和自噬相关基因Atg5、Beclin1的表达, 其结果显示, 5-FU联合苦参碱治疗组和苦参碱治疗组中, Atg5、Beclin1表达均显著的升高, Bcl-2表达下降, 与5-FU治疗组及对照组相比, 差异具有显著性(P<0.05, 图2, 3). 本研究结果提示, 苦参碱促进5-FU诱导的凋亡可能是通过上调NF-κB的靶基因Atg5、Beclin1表达和下调凋亡抑制基因Bcl-2表达.

图3
图3 各组肿瘤细胞中Bcl-2、Atg5、Beclin1与β-actin mRNA的相对表达量.
3 讨论

一些研究表明苦参碱具有抑制肿瘤细胞增生、降低肝脏局部炎症反应的作用[7,8]. 在本实验中, 苦参碱可促进肝癌细胞凋亡, 抑制肝癌细胞坏死, 而5-FU治疗组有很大的一部分细胞通过坏死途径死亡. 苦参碱联合5-FU组肝癌细胞凋亡率为81.3%±2.6%, 5-FU治疗组为34.6%±3.5%, 苦参碱治疗组为45.6%±2.4%, 组间比较存在显著差异(P<0.05); 苦参碱联合5-FU组肝癌细胞坏死率为8.3%±2.2%, 5-FU治疗组为15.4%±2.5%, 苦参碱治疗组为5.3%±1.8%. 苦参碱联合5-FU组不仅提高了肝癌细胞的凋亡率, 而且降低了坏死细胞比率. 肿瘤细胞坏死率降低有利于减轻肿瘤局部的炎症反应, 增强其抗肿瘤效果[14,15].

现有研究表明NF-κB转录因子参与炎症和肿瘤增生等多种病理过程, 可调节肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素6(interleukin 6, IL-6)、Bcl-2、IAP等多种细胞因子的表达, 抑制肿瘤细胞凋亡, 促进肿瘤细胞增生[16-21]. NF-κB转录因子家族有5位成员, 他们是RelA(p65)、RelB、C-Rel、NF-κB1(p50)和NF-κB2(P52). NF-κB家族成员之间可形成同源和异源二聚体, 最常见的二聚体是P65/P50异源二聚体[22-24]. 在静止的细胞中, NF-κB通过与细胞质内抑制蛋白NF-κB(inhibitory proteins NF-κB, IκB)结合, 以P50-P65-IκB多聚体的无活性状态存在, 滞留于细胞质中. 当外界因素刺激时导致IκB激酶β亚单位激活, 从而启动细胞内的泛素化-蛋白酶系统, 使IκB蛋白降解, 活化的NF-κB进入细胞核发挥转录因子的作用, 促进多种细胞因子的表达[22,25]. 现有研究表明NF-κB转录因子激活和化疗耐药有关, 抑制NF-κB转录因子可促进肿瘤细胞凋亡[1,26-28]. 在本研究中, RT-PCR分析结果提示, 5-FU治疗可诱导肝癌细胞NF-κB p65的表达增加, IκB表达下降. 苦参碱可抑制NF-κB p65的表达, 上调IκB的表达. 因此, 在肝癌5-FU化疗时, 若联合苦参碱中药治疗, 可降低NF-κB转录因子的表达, 有助于逆转肝癌细胞化疗耐药, 提高肝癌化学治疗的效果.

有研究表明[29-31], NF-κB转录因子可调节凋亡拮抗基因Bcl-x和Bfl-l、肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF)、IAP等多种凋亡抑制因子的表达. NF-κB转录因子亦可参与肿瘤细胞自噬的调节[32]. 在本研究中我们进一步分析苦参碱对凋亡抑制基因Bcl-2和自噬相关基因Atg5、Beclin1表达的影响, 结果显示, 苦参碱治疗组、5-FU联合苦参碱治疗组中, Bcl-2表达下降, Atg5和Beclin1 mRNA表达均显著地升高, 与单5-FU治疗组相比, 差异具有显著性. 因此, 我们推测苦参碱可能通过抑制NF-κB转录因子, 下调凋亡抑制基因Bcl-2和上调自噬基因Atg5和Beclin1的表达而促进肿瘤细胞凋亡.

总之, 凋亡调节与肝癌患者的化学治疗敏感性存在密切的关系. 在本实验中, 联合苦参碱治疗, 肝癌细胞株对5-FU的化学治疗敏感性增加, 凋亡率升高, 同时, 伴有凋亡抑制基因Bcl-2表达下降和自噬相关基因Atg5、Beclin1的表达增加. 说明苦参碱有助于提高5-FU对原发性肝癌的治疗效果, 值得我们进一步研究.

评论
背景资料

肿瘤细胞凋亡功能障碍与其化学治疗敏感性差存在密切的关系, 5-氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素等化学药物可诱导肝癌细胞中NF-κB转录因子激活, 而NF-κB转录因子激活可促进凋亡抑制因子(IAP)和B细胞淋巴瘤/白血病-2因子(Bcl-2)等的表达, NF-κB激活与肝癌细胞的凋亡耐受存在密切的关系.

同行评议者

丁惠国, 主任医师, 首都医科大学附属北京佑安医院肝病消化科

研发前沿

经临床证实苦参碱可抑制机体的炎症反应. 亦有研究表明苦参碱可诱导肝癌细胞发生自噬和凋亡, 但苦参碱抗炎、抗肿瘤生长的分子机制尚未完全阐明.

相关报道

有研究表明, NF-κB转录因子可调节凋亡拮抗基因Bcl-x和Bfl-l、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)、IAP等多种凋亡抑制因子的表达. NF-κB转录因子亦可参与肿瘤细胞自噬的调节.

应用要点

苦参碱可通过上调IκB、Atg5及Beclin1的表达和下调NF-κB p65、Bcl-2的表达, 促进肝癌细胞凋亡, 提高肝癌细胞的化疗敏感性.

同行评价

本文设计合理, 方法可靠, 具有一定的实用价值.

编辑: 李薇 电编:何基才

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