修回日期: 2010-08-30
接受日期: 2010-09-07
在线出版日期: 2010-10-08
目的: 在分子水平上探讨3种中医治法对胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞凋亡的不同作用机制.
方法: 将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组和造模组, 采用以化学损伤为主的综合法复制大鼠胃癌前病变模型, 确定造模成功后, 将造模组大鼠随机分为模型对照组、健脾益气组、活血化瘀组和养阴荣络组, 分别给予3组中药治疗6 wk. 光镜下观察大鼠胃黏膜组织学改变; 采用TUNEL法检测大鼠细胞凋亡情况, 计算凋亡指数(AI); 采用免疫组织化学法检测大鼠胃黏膜细胞内凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达情况.
结果: 与正常对照组相比, 模型组大鼠胃黏膜细胞的AI显著降低(均P<0.05), 抑凋亡蛋白Bcl-2显著升高(均P<0.05), 而促凋亡蛋白Bax显著降低(均P<0.05); 与模型对照组相比, 3用药组可显著升高胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞中AI(18.93%±0.49%, 25.93%±1.27%, 14.83%±0.62% vs 5.93%±1.02%, 均P<0.05), 降低Bcl-2的表达量, 增加Bax的表达量(均P<0.05).
结论: 3种治法均能改善模型大鼠胃黏膜炎症, 同时可诱导模型大鼠胃黏膜细胞发生凋亡, 其作用以活血化瘀方最佳, 相关蛋白Bcl-2、Bax可能是3种治法诱导细胞发生凋亡的重要调控因子.
引文著录: 蒋时红, 刘旺根, 张文娴, 刘燕. 中医治法对胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞凋亡的影响. 世界华人消化杂志 2010; 18(28): 3012-3015
Revised: August 30, 2010
Accepted: September 7, 2010
Published online: October 8, 2010
AIM: To investigate the impact of three Chinese medicine therapies on gastric mucosal cell apoptosis in rats with gastric precancerous lesions and to explore potential mechanisms involved.
METHODS: Sixty Wistar rats were randomly divided into normal control group and model control group. Gastric precancerous lesions were induced in rats by chemical injury to the stomach. The model control group was further divided into four subgroups: model control subgroup and three subgroups receiving different Chinese medicine therapies (by strengthening the spleen and replenishing Qi, promoting blood circulation and removing blood stasis, and nourishing Yin and dredging the channels and collaterals, respectively). The changes in gastric mucosa were observed under a light microscope. Apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay to calculate apoptotic index (AI). The expression of Bcl-2 and Bax proteins in gastric mucosa was detected by immunohistochemistry.
RESULTS: Compared with the normal control group, the AI of gastric mucosal cells AI was significantly reduced (18.93% ± 0.49%, 25.93% ± 1.27%, 14.83% ± 0.62% vs 5.93% ± 1.02%, all P < 0.05), the rate of gastric mucosal cells positive for Bcl-2 was significantly increased (all P < 0.05), and the rate of gastric mucosal cells positive for Bax was significantly decreased (all P < 0.05) in the model control subgroup and the three treatment subgroups. Compared with the model control subgroup, the AI was significantly increased, the rate of gastric mucosal cells positive for Bcl-2 was significantly reduced, and the rate of gastric mucosal cells positive for Bax was significantly elevated in the three treatment subgroups (P < 0.05). The most significant effect was noted in the subgroup treated by promoting blood circulation and removing blood stasis, followed by those treated by nourishing Yin and dredging the channels and collaterals, and strengthening the spleen and replenishing Qi.
CONCLUSION: The three Chinese medicine therapies can improve gastric mucosal inflammation and induce apoptosis possibly by reducing Bcl-2 expression and increasing Bax expression. Therapy by promoting blood circulation and removing blood stasis has the most significant effect in promoting the apoptosis of gastric mucosal cells.
- Citation: Jiang SH, Liu WG, Zhang WX, Liu Y. Impact of three Chinese medicine therapies on gastric mucosal cell apoptosis in rats with gastric precancerous lesions. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 18(28): 3012-3015
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v18/i28/3012.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v18.i28.3012
胃癌前病变是目前中医药针对胃癌二级预防的研究热点[1]. 胃癌前病变(precancerous lesion gastric casncer, PLGC)是指在慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)的基础上伴有的肠化生和不典型增生, 是一病理学概念[2]. 本研究通过建立PLGC大鼠模型, 观察健脾益气法、活血化瘀法和养阴荣络法对PLGC大鼠胃黏膜细胞形态学及细胞凋亡的影响, 并探讨其机制, 以期为临床防治PLGC和新药的开发提供一定的理论依据.
清洁级♂Wistar大鼠60只, 体质量120 g±10 g, 由河南省实验动物中心提供, 实验动物许可证编号: SCXK(豫)2007-0016. 常规饲养在河南中医学院动物实验中心, 室温27 ℃±3 ℃, 湿度为60%±10%. 健脾益气方: 由党参25 g、黄芪18 g、白术15 g、茯苓15 g、丹参15 g、山楂15 g、陈皮6 g、炙甘草6 g组成; 活血化瘀方: 由五灵脂10 g、蒲黄8 g、三七末(冲)3 g、延胡索15 g、乳香6 g、郁金15 g、枳壳15 g组成; 养阴荣络方: 由沙参10 g、麦冬15 g、白芍15 g、生地30 g、太子参20 g、甘草6 g、当归15 g组成. 各方药均购自河南中医学院第三附属医院, 经2次水煎, 合并滤液, 加热浓缩后生药浓度分别为: 健脾益气方1.04 g/mL、活血化瘀方0.65 g/mL、养阴荣络方1.00 g/mL. 分装3个小瓶, 4 ℃保存, 给药前复温, 并保证用药期间每周配药1次. N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG), Fluka公司, 批号为425641122201; 二步法免疫组织化学检测试剂盒, 美国GBI公司, 批号: PV-9000; DAB染色试剂盒, 北京中杉金桥公司, 批号: ZLI-9032; 缺口末端标记(TdT mediated dUTP nick ending labelling, TUNEL)试剂盒, 德国Roche公司, 批号: 11684817910; Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)抗大鼠单克隆抗体, 美国Santa Cruz公司, 批号: sc-7382; Bax(Bcl-2 associated x protein, Bax)抗大鼠单克隆抗体, 美国Santa Cruz公司, 批号: sc-7480.
1.2.1 造模及给药: 采用参考文献[3]使用的综合法并加以改进. 每日自由饮用167 mg/L MNNG溶液. 同时下午灌胃0.017 mol/L浓度的MNNG溶液, 每只每天灌液1 mL; 造模期间每进食2 d, 再禁食1 d, 并在禁食当天下午用40%酒精按每只2 mL灌胃攻击; 每周用止血钳夹尾刺激(以不破皮流血为度), 使之保持激怒、争斗状态, 持续30 min. 连续8 wk, 8 wk末时随机检杀造模大鼠8只, 通过光镜下观察确认造模成功, 再将造模大鼠随机分为模型对照组、健脾益气组、活血化瘀组和养阴荣络组, 根据《人和动物间按体表面积折算的等效计量比值表》[4]得出大鼠给药的等效剂量(等效剂量 = 成人1 d剂量×0.018×5), 即健脾益气方为10.35 g/kg, 活血化瘀方为6.48 g/kg, 养阴荣络方为9.99 g/kg, 各中药组分别给予不同浓度的3组中药水煎液, 每只每天灌液2 mL, 共治疗6 wk.
1.2.2 指标检测: 14 wk末处死动物, 剖腹取胃大弯部胃黏膜组织, 4%多聚甲醛固定, 石蜡包埋, 常规切片. -20 ℃保存, 待检. 检测时, 随机选取各组若干石蜡切片, HE染色, 光镜下观察大鼠胃黏膜病理改变情况. 凋亡指数(apoptosis index, AI)采用TUNEL技术, 操作步骤严格按照说明书步骤进行; 免疫组织化学采用常规SP法, 所有操作严格按照说明书步骤进行, 用PBS代替一抗做阴性对照, 用已知Bcl-2和Bax阳性染色的食管癌组织切片作为阳性对照.
1.2.3 结果判定: (1)胃黏膜组织学改变的诊断标准: 参照实验性胃腺癌的分类和诊断标准[5]. (2)TUNEL凋亡细胞计数方法: 阳性凋亡细胞表现为核呈棕黄色, 每片随机选取5个非坏死区域高倍视野, 计数阳性细胞的个数, 以同一视野内阳性细胞占总细胞的百分比表示AI: AI = (n阳性细胞/n总细胞)×100%. (3)免疫组织化学: 以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞, 选择任意5个400倍视野, 计数至少100个细胞中的阳性细胞数, <5%为阴性(-), 6%-25%为阳性(+), 26%-50%为中度阳性(++), >50%为高度阳性(+++)[6].
统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计分析, 定量资料采用mean±SD进行统计描述, 定性资料采用率或构成比进行统计描述.
正常对照组大鼠胃黏膜呈粉红色, 黏膜皱襞表面光滑, 走向规则. 光镜下显示胃黏膜上皮细胞排列整齐, 腺体形态规则, 固有层未见炎细胞浸润, 黏膜肌层完整; 模型对照组大鼠胃黏膜呈灰白色, 黏膜层变薄, 黏膜皱襞变平或走向紊乱. 光镜下观察, 胃黏膜呈多灶性萎缩, 腺体排列紊乱, 部分腺体呈囊状扩张, 上皮细胞形态大小不一, 核浆比例增大, 黏膜肌层向黏膜层延伸, 间质水肿、充血、炎细胞浸润. 在存活的8例中, 可见部分区域黏膜出现肠上皮化生, 化生的肠上皮细胞核大、深染, 核呈空泡状, 可见杯状细胞; 3用药组可见胃黏膜呈粉红色, 光泽度差. 光镜下观察胃黏膜变薄、皱襞紊乱, 偶见炎细胞浸润. 治疗后各组大鼠胃黏膜炎症改变的情况见表1.
与正常对照组相比, 模型对照组AI的表达量显著降低; 与模型对照组相比, 3用药组AI明显升高(P<0.05). 活血化瘀组AI明显高于健脾益气组和养阴荣络组(P<0.05), 但健脾益气组与养阴荣络组比较无统计学意义(P>0.05, 表2).
正常对照组Bcl-2的表达仅在胃黏膜基底部有少量表达, 表达量<5%视为阴性; 模型对照组的Bcl-2的表达增加; 与模型对照组相比, 3用药组Bcl-2蛋白的表达量均明显减低(P<0.05). 活血化瘀组明显低于健脾益气组和养阴荣络组(P<0.05), 但健脾益气组与养阴荣络组比较无统计学意义(P>0.05, 表3).
与正常对照组相比, 模型对照组Bax蛋白的表达量显著降低; 与模型对照组相比, 3用药组Bax蛋白的表达量明显升高(P<0.05). 活血化瘀组和健脾益气组作用均优于养阴荣络组(P<0.05), 但活血化瘀组和健脾益气组两组比较无统计学意义(P>0.05, 表3).
近年来, 国内对于PLGC开展了大量的研究工作[7,8], 根据本病的主要临床表现, 将其列入"胃脘痛""痞满""嘈杂"等范畴, 病因多是由饮食不节、脾胃功能失调所致, 本虚标实为本病的基本病机, 本虚以脾胃虚弱为主, 标实则有气滞、血瘀等. 因虚夹邪, 由实致虚是其主要病机转化规律. 针对这一病机, 临床治疗主要偏重于健脾益气、活血化瘀、养阴荣络等方法.
本研究模拟临床常见病因, 采用综合法成功复制了PLGC大鼠模型, 分别用上述3种治法的代表方剂治疗6 wk后, 与模型对照组大鼠相比, 3用药组大鼠胃黏膜的大体形态及光镜结构均有显著改善, 降低大鼠肠化生和异性增生的发生率, 提高了大鼠存活率, 达到治疗胃癌前病变和阻止其进一步演变的目的, 揭示了现代中医同病异治的特殊功效.
目前, 胃癌前病变与细胞凋亡的关系日益受到重视. 研究表明[9-11], 在胃癌前病变演变为胃癌的过程中, 细胞凋亡受到抑制, 胃黏膜病变细胞凋亡减少, 生存期延长, 细胞大量堆积, 从而导致胃癌的发生. Bcl-2主要通过延长细胞寿命而导致异常细胞的积聚, 进而抑制凋亡的发生, Bax同源二聚体能促进细胞凋亡. 也就是说, 抑凋亡蛋白Bcl-2的高表达与促凋亡蛋白Bax的低表达, 可导致Bcl-2/Bax比值升高, 细胞凋亡的敏感性降低, 为肿瘤细胞的快速增长, 减慢细胞的丢失提供优势条件[12,13].
我们的实验结果与文献报道基本一致[14], 正常对照组胃黏膜上皮细胞存在细胞凋亡, 藉以清除衰老的细胞, 维持黏膜细胞的生理平稳. 模型对照组胃黏膜上皮细胞内细胞凋亡减少, 而3种治法均可使PLGC大鼠细胞中凋亡指数AI升高, 降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量, 升高促凋亡蛋白Bax的表达, 使Bcl-2/Bax比值降低, 从而诱导细胞发生凋亡. 其中以活血化瘀为组方原则的中药诱导PLGC大鼠细胞凋亡作用最佳. 通过本实验结果, 3种治法在影响细胞凋亡相关蛋白的表达方面存在一定的差异性, 证实了中医对胃癌前病变分型的客观性和科学性. 在临床应用中, 对实验室检查明确的患者选方上有直接指导作用, 同时, 通过这一实验结果, 为课题组下一步拟定治疗胃癌前病变协定处方提供更客观的依据.
胃癌是人类常见的恶性肿瘤, 由于其病因尚不十分清楚, 实施针对病因的一级预防比较困难, 因此, 防治胃癌前病变的二级预防显得至关重要. 中医药治疗胃癌前病变已开展多年, 以中医药为主的综合治疗, 运用独特的治疗方法, 从整体入手, 辨证施治, 对控制患者病情发展, 延长生存期显示出其独特的优越性.
唐文富, 副教授, 四川大学华西医院中西医结合科
目前中医药治疗PLGC大都停留在中药单体或单味药的研究, 对不同治法的比较研究开展的较少. 本研究运用现代研究技术, 对3种中医治法诱导细胞凋亡方面进行比较研究, 以期得到真实可靠的实验室依据, 从而更好地指导临床, 造福患者.
张玉禄等采用活血化瘀法对慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠早期细胞凋亡的影响进行研究发现活血化瘀法对大鼠早期细胞凋亡有明显抑制作用, 提示这可能是活血化瘀法改善或逆转CAG癌前病变的作用机制之一.
本研究选取临床上治疗胃癌前病变的3个常用治法, 针对诱导细胞凋亡方面进行比较研究, 为指导临床辨证施治及组方用药提供进一步的实验依据.
本研究证实了3种治法对本病均有明确的治疗作用. 提示在临症运用益气健脾法、养阴荣络法治疗本病时, 可根据病情加用活血化瘀类中药, 在诱导细胞凋亡方面具有一定的优势, 有可能获得更好的疗效. 通过这一实验结果, 对实验室检查明确的患者在选方用药上有直接的指导作用, 并且为课题组下一步拟定治疗胃癌前病变协定处方提供更客观的依据.
本文创新性较好, 有一定的临床参考价值.
编辑: 曹丽鸥 电编:何基才
| 2. | 徐 萍利, 雷 正荣. 中医药防治胃癌前病变的研究进展. 中外健康文摘·临床医师版. 2008;5:1-4. |
| 4. | 苗 明三. 实验动物和动物实验方法. 上海: 上海科学技术出版社 2005; 67. |
| 10. | 张 玉禄, 李 军祥, 崔 巍, 朱 陵群, 宋 崇顺, 任 映, 杨 金铎. 活血化瘀法对慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠早期细胞凋亡的影响. 北京中医药大学学报. 2008;31:316-318. |