临床研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-08-28; 18(24): 2538-2544
在线出版日期: 2010-08-28. doi: 10.11569/wcjd.v18.i24.2538
ATRA联合奈达铂对人肝癌细胞株Huh-7增殖与凋亡的影响
刘景, 徐晶, 丁剑午
刘景, 丁剑午, 南昌大学第二附属医院肿瘤科 江西省分子医学重点实验室 江西省南昌市 330006
徐晶, 永新县人民医院内科 江西省吉安市 343400
刘景, 2008年南昌大学研究生院在读硕士, 主要从事消化系肿瘤综合治疗的基础和临床研究.
作者贡献分布: 刘景与徐晶对此文所作贡献均等; 此课题由刘景、徐晶及丁剑午设计; 研究过程由刘景与丁剑午操作完成; 研究所用试剂及分析工具由刘景提供; 数据分析由徐晶完成; 本论文写作由刘景与徐晶完成.
通讯作者: 丁剑午, 副教授, 330006, 江西省南昌市民德路1号, 南昌大学第二附属医院肿瘤科, 江西省分子医学重点实验室. physicliujing@163.com
电话: 0791-6292193 传真: 0791-6292212
收稿日期: 2010-05-13
修回日期: 2010-07-10
接受日期: 2010-07-21
在线出版日期: 2010-08-28

目的: 探讨化疗药物全反式维甲酸(ATRA)与奈达铂(nedaplatin)单独及联合应用对人肝癌细胞株Huh-7增殖与凋亡的影响.

方法: 选取不同浓度的ATRA(1×10-4、1×10-5、1×10-6 mol/L)、奈达铂(1、2、5 mg/L)并选用ATRA 1×10-5 mol/L联合不同浓度奈达铂(1、2、5 mg/L)分别作用于肝癌细胞24、48、72 h; 另外, 通过预实验筛选有效终浓度的ATRA(1×10-5 mol/L)+奈达铂(1 mg/L)作为联合处理组作用于肝癌细胞24、48、72 h; 采用倒置显微镜观察细胞形态学改变, MTT法观察ATRA、奈达铂及两药联合对Huh-7细胞增殖的影响; 应用流式细胞仪分析其对细胞凋亡率的影响.

结果: 不同浓度的ATRA(1×10-4、1×10-5、1×10-6 mol/L)和奈达铂(1、2、5 mg/L)单独作用于Huh-7细胞均有明显的抑制作用, 该作用随时间的延长、浓度的增加而逐渐增强(P<0.01); 两药联合表现为协同作用, 与单药相比具有显著性差异(P<0.01). Huh-7细胞经ATRA 1×10-5 mol/L、NDP 1 mg/L及两药联合作用48 h后, 流式细胞仪检测凋亡凋亡率分别为28.49%±0.6%, 42.57%±1.03%, 55.35%±1.30%, 单药组与联合组比较具有显著性差异(均P<0.01). 提示ATRA(1×10-5 mol/L)+奈达铂(1 mg/L)联合作用时具协同效应.

结论: ATRA与奈达铂对人肝癌细胞株Huh-7均有抑制增殖和促进凋亡的作用, 且与单药比较, ATRA联合奈达铂能够明显提高肝癌细胞对化疗的敏感性.

关键词: 全反式维甲酸; 奈达铂; Huh-7细胞; 细胞增殖; 凋亡
引文著录: 刘景, 徐晶, 丁剑午. ATRA联合奈达铂对人肝癌细胞株Huh-7增殖与凋亡的影响. 世界华人消化杂志 2010; 18(24): 2538-2544
ATRA in combination with nedaplatin inhibits cell proliferation but promotes apoptosis in human hepatoma cell line Huh-7
Jing Liu, Jing Xu, Jian-Wu Ding
Jing Liu, Jian-Wu Ding, Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital to Nanchang University, Jiangxi Provincial Key Laboratory of Molecular Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Jing Xu, Department of Internal Medicine, the People's Hospital of Yongxin County, Ji'an 343400, Jiangxi Province, China
Correspondence to: Associate Professor Jian-Wu Ding, Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital to Nanchang University, Jiangxi Provincial Key Laboratory of Molecular Medicine, 1 Minde Road, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China. physicliujing@163.com
Received: May 13, 2010
Revised: July 10, 2010
Accepted: July 21, 2010
Published online: August 28, 2010

AIM: To observe the effects of all-trans retinoic acid (ATRA) and nedaplatin, alone or in combination, on cell proliferation and apoptosis in human hepatoma cell line Huh-7, and to determine whether the two drugs in combination have a synergistic effect in treating hepatocarcinoma.

METHODS: After Huh-7 cells were incubated with different concentrations of ATRA (10-4, 10-5 and 10-6 mol/L) and nedaplatin (1, 2 and 5 mg/L), alone or in combination, for 24, 48 and 72 h, cell morphology changes were observed using an inverted microscope; cell proliferation was evaluated by MTT assay; and apoptosis was evaluated by flow cytometry.

RESULTS: Both ATRA and nedaplatin could markedly inhibit cell proliferation in a time- and concentration-dependent manner (all P < 0.01). ATRA and nedaplatin in combination had a significant synergistic effect on cell proliferation compared with ATRA or nedaplatin alone (both P < 0.01). Both ATRA and nedaplatin promoted the apoptosis of Huh-7 cells. The apoptosis rate was significantly lower in Huh-7 cells treated with ATRA and nedaplatin alone for 48 h than in those treated with the two drugs in combination (28.49% ± 0.6%, 42.57% ± 1.03% vs 55.35% ± 1.30%, both P < 0.01), suggesting a synergistic effect of combined nedaplatin and ATRA on the apoptosis of Huh-7 cells.

CONCLUSION: Both ATRA and nedaplatin can inhibit cell proliferation and promote apoptosis in human hepatoma cell line Huh-7. ATRA combined with nedaplatin has a significant synergistic effect on the proliferation and apoptosis of Huh-7 cells.

Key Words: All-trans retinoic acid; Nedaplatin; Huh-7 cell; Cell proliferation; Apoptosis
0 引言

肝癌是目前最常见的恶性肿瘤之一, 手术、放疗、化疗、介入是其治疗的主要措施. 但肝癌常规化疗效果差, 而且容易产生对原化疗药物明显的耐药性. 为此, 寻求协同、增敏等肝癌有效的综合治疗方案成为人们一直研究的热点. 大量的研究表明[1-3], 全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是治疗急性早幼粒细胞白血病的一种最有效的药物之一. 同时, ATRA在其他领域也发挥了很好的抗肿瘤效果, 如神经母细胞瘤、皮肤癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、口腔癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等[4-18]. 而奈达铂(nedaplatin, NDP)作为肝癌一线化疗药物顺铂的新的衍生物, 他较顺铂具有更宽的剂量域, 显示出更优越的抗肿瘤效果, 且不良反应较少. 本研究将以ATRA联合奈达铂作用于人肝癌细胞株Huh-7, 探讨两药对Huh-7细胞增殖和凋亡的影响.

1 材料和方法
1.1 材料

人肝癌细胞株Huh-7由南昌大学第二附属医院分子生物中心提供. ATRA购自美国Sigma公司, 使用浓度为1×10-4、1×10-5、1×10-6 mol/L; 注射用NDP购自南京东捷药业公司, 使用浓度分别为1、2、5 mg/L, MTT试剂购自美国Sigma公司, DMEM培养液及胎牛血清购自Hyclon公司, Annexin-V-PI凋亡试剂盒购自南京凯基公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物配制: Huh-7细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液, 在50 mL/L CO2, 37 ℃条件下的孵箱中培养, 细胞长满至瓶底80%左右时传代. ATRA用无水乙醇溶解配制成1×10-2 mol/L(100 mg ATRA溶于33.3 mL无水乙醇), NDP用生理盐水溶解配制成100 mg/L(10 mg NDP溶于100 mL生理盐水)的备用液, 需要时用培养液稀释至所需浓度.

1.2.2 分组: 根据预实验结果设ATRA单药浓度为1×10-4、1×10-5、1×10-6 mol/L 3组. 经MTT分析, 单药ATRA 1×10-5 mol/L对细胞有明显的抑制作用, 且在各时间点与ATRA 1×10-4 mol/L比较无明显统计学差异(均P>0.05), 因此选用ATRA 1×10-5 mol/L作为联合用药的处理浓度. 而NDP参照其药物动力学参数, 其在人体内达血药浓度峰值(总铂浓度、游离铂浓度)分别为6.72、6.5 mg/L, 选择其血浆峰浓度的0.1-1倍内设单药浓度为1、2、5 mg/L 3组. 最后筛选出细胞凋亡率明显且坏死率相对较低的NDP 1 mg/L+ATRA 1×10-5 mol/L作为联合用药组的有效终浓度. 将只加培养液组设为对照组. 设24、48、72 h 3个时间点.

1.2.3 倒置显微镜观察细胞形态变化: 倒置显微镜下观察各组细胞处理前后的形态变化.

1.2.4 MTT法观察药物对细胞增殖的影响: 将生长活力良好的Huh-7细胞以8 000个/孔接种于96孔板, 在37 ℃条件下, 含50 mL/L CO2的孵箱中培养24 h后按要求分别加入各实验组药物, 每组设4个复孔, 同时设空白对照组, 培养24、48、72 h后, 每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 mL, 继续培养4 h后, 弃掉培养液, 每孔加入DMSO 100 mL, 振荡10 min, 使充分溶解混匀. 用酶标仪在492 nm处测定吸光度(A)值. 按公式计算细胞增殖抑制率. 细胞增殖抑制率 = [(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值]×100%. 重复MTT法, 计算24、48、72 h后的细胞抑制率. 另外根据Web系数来判定联合用药后两药是否具有协同作用. 采用以下公式计算: 预估效应C = A1×A2, 其中A1、A2代表两种单药作用后的细胞存活率(%). 当C>实际存活率时, 代表两药作用协同. 当C = 实际存活率时, 代表两药作用相加. C<实际存活率时<A1、A2时, 代表两药作用次相加.

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率: 将生长活力良好的Huh-7细胞接种于96孔板, 在37 ℃条件下, 含50 mL/L CO2的孵箱中培养24 h后按要求分别加入各实验组药物, 同时设对照组, 继续培养48 h后用2.5 g/L的胰酶消化成单细胞悬液, 1 000 r/min离心5 min, 弃上清, 用PBS洗涤1次, 1 000 r/min再次离心5 min, 弃上清, 按Annexin-V-PI试剂盒步骤操作后上机检测. 记录激发波长488 nm处红色荧光, 记数细胞为1 000个, 检测凋亡率.

统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行配对t检验分析, 所有数据采用mean±SD表示, 相关性以Pearson相关分析, 检验水准a = 0.05, P<0.01为差异性显著.

2 结果
2.1 不同药物组处理Huh-7细胞的形态学变化

在倒置显微镜下观察, 正常细胞呈现弥漫均匀分布, 细胞边缘界线清楚, 凋亡细胞形态变圆, 大小不等, 体积缩小, 核碎裂或溶解. 本实验对照组活细胞生长良好, 而各处理组活细胞数目较对照组不同程度减少, 并可见较多的凋亡细胞, 而且ATRA+NDP联合用药组凋亡细胞明显较单药组增多(图1).

图1
图1 倒置显微镜下Huh-7细胞处理前后的形态学变化(×200). A: 对照组; B: NDP组(1 mg/L); C: ATRA组(1×10-5 mol/L); D: 联合用药组(ATRA 1×10-5 mol/L+NDP 1 mg/L).
2.2 ATRA、NDP及两药联合对Huh-7细胞增殖的影响

2.2.1 ATRA、NDP对Huh-7细胞生长抑制的效应: ATRA和NDP对Huh-7细胞均有明显的生长抑制作用, 且该作用呈时间、浓度依赖性, 即同一时间其抑制作用随药物浓度增加而增强, 同一浓度其抑制作用随作用时间延长而增强. 另外, ATRA 1×10-5 mol/L与NDP联合作用时, 其对Huh-7细胞的抑制作用较NDP单药相比有显著增加. 而相反, 随各组药物浓度增加、作用时间延长, 其活细胞A492下降明显. 各药物组作用后与对照组比较, 有显著统计学意义(均P<0.01, 表1).

表1 各药物组对Huh-7细胞的生长抑制作用 (mean±SD, n = 5).
分组药物浓度作用时间
24 h48 h72 h
ATRA(mol/L)1×10-40.315±0.166b0.592±0.008b0.594±0.018b
1×10-50.322±0.017b0.609±0.016b0.628±0.020b
1×10-60.346±0.026b0.732±0.025b0.753±0.035b
NDP(mg/L)50.321±0.019b0.677±0.027b0.670±0.039b
20.331±0.021b0.701±0.018b0.716±0.012b
10.342±0.025b0.715±0.016b0.759±0.020b
ATRA(mol/L)+1×10-5+50.213±0.004b0.321±0.014b0.227±0.015b
NDP(mg/L)1×10-5+20.250±0.015b0.390±0.010b0.302±0.009b
1×10-5+10.275±0.011b0.446±0.017b0.377±0.025b
对照组00.380±0.0240.849±0.0210.969±0.042
bP<0.01 vs 对照组.

2.2.2 ATRA联合NDP对Huh-7细胞的抑制作用: 选择ATRA 1×10-5 mol/L与NDP 1 mg/L联合作用于Huh-7细胞, 计算24、48、72 h的细胞抑制率(表2). 结果显示: (1)ATRA和NDP联合组与两单药组的作用比较, 抑制率有明显提高(均P<0.01); (2)根据单药作用结果计算出联合用药后24、48、72 h的预估细胞存活率C值分别为76.42%、60.76%、50.33%, 三者均高于其实际细胞存活率72.35%、52.48%、38.71%, 表现为两药协同作用.

表2 不同时间点各药物组Huh-7细胞的增殖抑制率 (mean±SD, n = 5, %).
时间(h)抑制率
C值
ATRA(1×10-5 mol/L)组NDP(1 mg/L)组ATRA+NDP组
2415.279.8427.65b76.42
4828.2815.7847.52b60.76
7235.4921.9861.29b50.33
bP<0.01 vs 单药组.
2.3 流式细胞术检测各药物组对Huh-7细胞凋亡率变化

Huh-7细胞经ATRA 1×10-5 mol/L、NDP 1 mg/L及两药联合作用48 h后, 用流式细胞仪进行凋亡率检测, 结果显示: 对照组为0.82%±0.15%, NDP 1 mg/L组为28.49%±0.6%, ATRA 1×10-5 mol/L组为42.57%±1.03%, ATRA 1×10-5 mol/L+NDP 1 mg/L联合作用组为55.35%±1.30%. 与单药比较差异有显著统计学意义(均P<0.01, 图2).

图2
图2 NDP、ATRA、ATRA+NDP对Huh-7细胞凋亡的作用. A: 对照组; B: 1 mg/L NDP组; C: 1×10-5 mol/L ATRA组; D: ATRA+NDP组.
3 讨论

众所周知, 维甲酸类药物是一种良好的诱导分化剂, 他能够完全缓解急性早幼粒细胞白血病的症状, 并已成功应用于临床白血病的治疗[1]. 除此以外, 维甲酸还能参与并调节细胞的其他活动, 包括细胞增殖、代谢、繁殖、形态并且可诱导细胞凋亡[19]. 在肝癌研究领域, Hsu等[20]使用终浓度为10 mmol/L的维甲酸处理人肝癌Hep3B细胞, 24 h即可见癌细胞凋亡迹象, 48-72 h用免疫荧光显微镜及DNA碎片分析显示明显的细胞凋亡, 其表现为核的固缩和碎裂, 并出现180-200 bp的DNA碎片梯度. Nakanishi等[21]也使用50 mmol/L的ATRA作用于肝癌HepG2细胞, 48 h后开始呈现细胞生长抑制现象, 凋亡明显. 因此, 从细胞形态学和分子生物学水平都进一步验证了维甲酸类药物可以诱导肝癌细胞凋亡. 同样, 在其他肿瘤实验研究中, Srivastava等[22]应用维甲酸与cAMP类似物8-Cl-cAMP分别作用于人卵巢癌细胞OVCAR-3和OVCAR-8, 实验发现两药物均能引起细胞生长抑制, 并产生细胞凋亡, 且维甲酸与8-Cl-cAMP联合诱导细胞凋亡的作用较单药作用增强. Das等[23]研究发现, 维甲酸能通过诱导分化及下调端粒酶的活性和原癌基因N-Myc表达而提高其对人恶性神经母细胞瘤SH-SY5Y的促凋亡作用. 还有, Zhang等[24]将10 mmol/L的ATRA作用于黑色素瘤细胞后, 经流式细胞仪检测发现肿瘤细胞凋亡明显. Dutta等[8]通过应用RT-PCR、Western blot等方法研究发现, ATRA作用于乳腺癌MCF-7细胞后, 能有效抑制基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)在肿瘤中的高表达. 而最近的研究, Jiménez-Lara等[25]发现维甲酸的抗肿瘤作用, 可通过介导NF-kappaB的途径实现抑制乳腺癌细胞的增殖, 促进其凋亡. 除此之外, 在联合用药方面, Kucukzeybek等[26]发现ATRA和多西紫杉醇在前列腺癌DU-145细胞中有协同促凋亡作用, 主要因为联合用药后能大幅下调生存素BIRC5、髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1, MCL-1)蛋白和淋巴毒素b受体(lymphotoxin b receptor, LTbR)基因的表达, 而这三者都是细胞凋亡和细胞周期调控中的关键角色. 基于维甲酸以上的多种功能, 又有研究者认为[27]维甲酸类化合物发挥其基因调控的作用是通过与两种不同的核受体相结合, 即RAR和RXR, 二者各自包括3种亚型a, b, g, 属于类固醇和甲状腺家族的一部分, 他们能与癌细胞中特异的DNA片段结合, 而达到抗肿瘤的效果.

而同样是作为目前广泛应用的第二代铂类抗癌药物-NDP, 其抗癌谱广, 尤其对于头颈部肿瘤疗效显著[28,29]. NDP的抗癌机制主要是与DNA结合从而抑制DNA的复制达到抗瘤作用. 且NDP与顺铂比较, 其治疗指数高, 不良反应小, 安全性好, 尤其是NDP消化系反应和肝、肾及神经毒性非常小[30].

在本研究中我们发现ATRA和NDP对人肝癌细胞株Huh-7均有抑制细胞生长、促进凋亡的作用, 经MTT法、流式细胞仪测定凋亡率可见, 在一定浓度范围内随浓度增加其抑制作用增强, 并且无论ATRA与NDP单用或联合作用, 随时间的延长同一药物浓度组对细胞的抑制作用逐渐增大. 此外, ATRA及NDP联合应用时两药表现为协同作用, 即两种药物对人肝癌细胞株Huh-7的联合作用效果优于单独用药.

由此可见, 本研究联合应用ATRA与NDP作用于人肝癌细胞株Huh-7的实验结果为治疗肝癌提供了新的、初步的实验依据, 同时也为进一步寻找肝癌的综合化学治疗拓宽了思路. 但是ATRA联合NDP能否用于临床治疗肝癌的推广, 其深入的作用机制仍然不很清楚, 因此, 还有待从分子靶向水平及综合不良反应的处理等诸多方面进行更进一步的研究.

评论
背景资料

原发性肝癌恶性程度高, 患者发现时大多已是晚期, 治疗棘手. 而经过多年的临床证实, ATRA对多种肿瘤治疗有效. 因此, 将ATRA联合其他化疗药物应用于癌症的综合治疗已成为当前研究的热点之一.

同行评议者

刘宝瑞, 教授, 南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心

研发前沿

肝癌是目前最常见的恶性肿瘤之一, 手术、放疗、化疗、介入是其治疗的主要措施. 但肝癌常规化疗效果差, 而且容易产生对原化疗药物明显的耐药性. 为此, 寻求协同、增敏等肝癌有效的综合治疗方案成为人们一直研究的热点.

相关报道

Das等研究发现, 维甲酸能通过诱导分化及下调端粒酶的活性和原癌基因N-Myc表达而提高其对人恶性神经母细胞瘤SH-SY5Y的促凋亡作用.

创新盘点

本研究是国内首次将ATRA联合NDP应用于肝癌的研究, 其结果为治疗肝癌提供新的、初步的实验依据, 同时也为进一步寻找肝癌的综合化学治疗拓宽了思路.

应用要点

本研究联合ATRA与NDP作用于人肝癌细胞株Huh-7的实验结果可能成为肝癌综合化疗的一个新选择, 同时也有望在进一步的肝癌分子靶向研究中取得新的突破.

同行评价

本文选题新颖, 具有一定的临床实用价值.

编辑:李军亮 电编:何基才

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