修回日期: 2010-06-17
接受日期: 2010-06-22
在线出版日期: 2010-07-18
目的: 观察针对丙型肝炎病毒(HCV)5'非编码区(NCR)内源性核糖体进入位点(IRES)的锁核酸核酶对HepG2.9706细胞中HCV RNA表达的抑制作用.
方法: 设计合成针对HCV 5'-NCR区IRES位点的DNAzyme、硫代修饰DNAzyme及LNAzyme. 实验设对照组与实验组. 对照组包括空白对照组、脂质体对照组、无关DNAzyme对照组、裸DNAzyme对照组. 实验组包括脂质体-DNAzyme组、脂质体-硫代修饰DNAzyme组、脂质体-LNAzyme组. 观察用药后1、3、5、7 d时, 对HepG2.9706细胞的HCV RNA及荧光素酶基因表达的抑制效应.
结果: 脂质体包裹的DNAzyme、硫代修饰DNAzyme及LNAzyme对HCV RNA表达均有抑制作用, 平均抑制率分别为28.10%、35.25%和44.58%. 对荧光素酶基因表达也有抑制作用, 平均抑制率分别为31.18%、40.69%和52.33%. 与对照组比较均有显著性差异(P<0.05). 对HepG2.9706细胞未见明显细胞毒性作用.
结论: LNAzyme对HepG2.9706细胞内HCV RNA的表达具有显著抑制作用, 且优于硫代修饰的DNAzyme, 是一类特异的高效抗HCV分子药物.
引文著录: 张梁, 邓益斌. LNAzyme抑制HCV 5'端非编码区内源性核糖体进入位点基因表达. 世界华人消化杂志 2010; 18(20): 2132-2136
Revised: June 17, 2010
Accepted: June 22, 2010
Published online: July 18, 2010
AIM: To investigate the inhibitory effects of LNAzyme targeting the hepatitis C virus (HCV) internal ribosome entry site (IRES) on HCV RNA expression in HepG2.9706 cells.
METHODS: The sequences encoding DNAzyme, thiolmodificated DNAzyme and LNAzyme directing against the HBV IRES (located in the 5' non-coding region) were designed and synthesized. The following experimental groups were set up: Lipofectamine-DNAzyme group, Lipofectamine-S-DNAzyme group, Lipofectamine-LNAzyme group, blank control group, empty Lipofectamine group, DNAzyme group, and random DNAzyme group. On days 1, 3, 5 and 7 after transfection, the expression of HCV RNA and luciferase gene in HepG2.9706 cells was detected.
RESULTS: Significant down-regulation of HCV RNA and luciferase gene expression was noted in the Lipofectamine-DNAzyme, Lipofectamine-S-DNAzyme and Lipofectamine-LNAzyme groups when compared with other groups (all P < 0.05). The reduced rates of HCV RNA expression in the above three groups were 28.10%, 35.25% and 44.58%, respectively. The reduced rates of luciferase gene expression were 31.18%, 40.69% and 52.33%, respectively. LNAzyme did not exert cytotoxicity in HepG2.9706 cells.
CONCLUSION: LNAzyme has a significant inhibitory effect on HCV RNA expression in HepG2.9706 cells. The inhibitory effect of LNAzyme on HCV RNA expression is stronger than that of thiolmodificated DNAzyme.
- Citation: Zhang L, Deng YB. LNAzyme targeting the HCV internal ribosome entry site inhibits HCV RNA expression in HepG2.9706 cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 18(20): 2132-2136
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v18/i20/2132.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v18.i20.2132
丙型肝炎是丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染引起的一种慢性化率极高的传染性病毒性肝炎, 常发展为肝硬化及肝细胞癌, 对人类健康造成重大危害[1]. 目前对该病毒尚缺乏特异有效的防治方法, 常规的干扰素疗法效果不甚理想且易反复, 因此, 探索专一、高效的新型抗HCV药物或疗法具有重要意义. HCV是黄病毒家族中的一员, 是一条长约9.6 kb的正链RNA, 包括一个开放读码框和两侧的5', 3'非编码区(non-coding region, NCR). 其中, 5'-NCR是HCV最保守的区域之一, 是病毒复制所必需的元件, 且含有内源性核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES), 在病毒复制和翻译调控中有重要作用, 是病毒基因组中唯一的翻译起始位点, 故是基因治疗的理想靶位.
锁核酸核酶(LNAzyme)是在脱氧核酶(DNAzyme)的2个结合臂上引入1个或多个锁核酸单体构建而成的新型核酸酶[2]. 锁核酸(locked nucleic acid, LNA)是一种新型的带双环状结构的寡核苷酸衍生物, 结构中核酸的2'-O, 4'-C位通过不同的缩水作用形成的刚性结构, 具有稳定性好、分子杂交能力强、抗核酸酶降解能力强和无毒性等优势[3-10]. LNA的引入极大增加了LNAzyme与底物RNA的杂交亲和力, 增强了切割反应的酶促活力, 使LNAzyme较相应的DNAzyme切割效率明显提高. 我们前期的研究结果表明, 针对HBV S基因的反义LNA能有效抑制HBV的表达[11,12]. 因此, 本研究针对HCV 5'-NCR区IRES位点设计合成LNAzyme, 以HepG2.9706为对象, 观察LNAzyme对HCV复制与表达的抑制作用, 旨在为丙型肝炎治疗寻找专一性强、高效的新型分子药物.
HepG2.9706细胞是一种转染有质粒pHCV-neo的转基因HepG2细胞, 含荧光素酶基因[4], 由中国人民解放军广州军区空军医院刘光泽博士惠赠, 本室常规培养于含G418(380 ITI1)、100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基中, 37 ℃、50 mL/L CO2条件下5-6 d传代1次; DMEM培养基、G418等购自Gibco公司; 胎牛血清购自杭州四季清公司; LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司; TRIzol RNA提取试剂盒购于Gibco公司; 荧光定量PCR检测HCV RNA试剂盒购于深圳匹基公司; 化学发光试剂盒(Bright-GloTM荧光素酶分析系统)购自Promega公司; 采用VictorTM Wallac 1420多标记检测仪测定荧光强度.
1.2.1 DNAzyme与LNAzyme的设计与合成: 针对HCV 5'-NCR区IRES位点(245-265 nt)分别设计合成以下几段序列: (1)DNAzyme, 序列为: 5'-GACTGCTAGCGGCTAGCTACAACGACGAGTAGTGTC-3'; (2)硫代DNAzyme, 在DNAzyme基础上对5'端前5个碱基及3'端前5个碱基进行硫代修饰, 序列为5'-GACTGCTAGCGGCTAGCTACAACGACGAGTAGTGTC-3'; (3)LNAzyme, 在DNAzyme的2个结合臂上分别引入2个LNA单体, 序列为5'-GACTGCTAGCGGCTAGCTACAACGACGAGTAGTGTC-3'; (4)无关DNAzyme对照序列, 即5'-TCCAGAGGAAGGGCTAGCTACAACGATTGCATACAGC-3'. 其中, GGCTAGCTACAACGA为DNAzyme的催化活性序列, 其两侧为特异性核苷酸识别结合靶序列; 下划线碱基为硫代或LNA修饰. 以上各序列经BLAST排除与人同源后由美国Genelink公司合成修饰并纯化.
1.2.2 脂质体包裹LNAzyme的制备: 脂质体与反义LNAzyme按1:10比例充分混匀(1 μg LNAzyme+10 μL脂质体), 室温下静置1 h后, 即形成稳定的脂质体-LNAzyme混合物.
1.2.3 实验分组与脂质体转染: 本实验设对照组和实验组. 对照组包括空白对照组、脂质体对照组、无关DNAzyme对照组、裸DNAzyme对照组. 实验组包括脂质体-DNAzyme组(lipo-DNAzyme)、脂质体-硫代修饰DNAzyme组(lipo-S-DNAzyme)、脂质体-LNAzyme组(lipo-LNAzyme). 将HepG22.9706细胞按1×105细胞/mL接种于96孔培养板, 每孔100 μL, 共设定7个组, 每组各设6个复孔, 待细胞贴壁后吸取培养上清液(-20 ℃保存), 分别在各组每孔中一次性加入含LNAzyme或DNAzyme量为10 μmol/L的DMEM混合液1 mL, 分别于1、3、5、7 d收集各孔培养上清液500 μL, 保存于-20 ℃待测.
1.2.4 培养上清液HCV RNA含量检测: 采用荧光定量PCR法. 具体操作如下: (1)RNA提取: 取培养上清液100 μL, 直接加TRIzol试剂1 mL, 轻摇, 室温静置5 min; 加氯仿0.2 mL, 振荡15 s, 室温静置3 min, 4 ℃, 12 000 r/min离心15 min; 取上清液, 加0.5 mL异丙醇, 室温静置10 min, 4 ℃, 12 000 r/min离心15 min; 弃上清液, 加入75%焦碳酸二乙酯乙醇溶液1 mL, 4 ℃, 7 500 r/min离心15 min; 弃上清液, 室温干燥5 min, 溶于焦碳酸二乙酯无菌水中. (2)逆转录: 逆转录液24.5 μL和逆转录酶0.5 μL, 轻混匀, 离心5 s, 37 ℃保温60 min; 95 ℃变性5 min, 离心5 s, 冰上保存备用. (3)PCR扩增: 反应体系为逆转录产物2.5 μL, PCR反应液22.3 μL, Taq酶0.2 μL; 反应条件为37 ℃ 3 min, 92 ℃ 1 min, 60 ℃ 30 s, 40个循环. 由计算机软件自动分析所收集的荧光信号并计算出定量结果, 采用计算对数平均值的方法计算cDNA平均拷贝数.
1.2.5 培养细胞内荧光强度检测: 分别于基因转染后1、3、5、7 d终止培养, 将培养板平衡至室温, 向每孔中加入经室温平衡后的荧光素酶发光试剂100 μL, 轻轻摇匀2 min以使细胞完全裂解, 立即应用多标记检测仪的荧光测定功能检测1 s发光强度, 输出值以CPS表示.
1.2.6 LNAzyme对细胞的毒性检测: 采用MTT比色法检测LNAzyme对细胞代谢活性的影响.
统计学处理 所有数据均采用mean±SD表示, 应用SPSS13.0统计软件处理, 组间比较采用重复测量设计方差分析的LSD检验, P<0.05为差异具有统计学意义. 抑制率(%) = (用药前N-用药后N)/用药前N×100%或(对照组N-实验组N)/对照组N×100%. 参照文献[13]: 抑制率<15.0%为无效; 15.0%-30.0%为轻度有效; 30.0%-50.0%为中度有效; >50%为显著有效.
加入核酶药物后, 各实验组对HCV RNA的表达均显示出较强的抑制作用(均P<0.05), lipo-DNAzyme、lipo-S-DNAzyme和lipo-LNAzyme的平均抑制率分别为28.10%、35.25%和44.58%. 与用药前比较, HCV RNA的表达量也下降较明显, 用药后1、3、5、7 d的平均下降率分别为15.53%、19.52%、23.69%和29.91%(表1).
| 分组 | 用药前 | 用药后 | |||
| 1 d | 3 d | 5 d | 7 d | ||
| 空白对照 | 1.57±0.45 | 1.52±0.49 | 1.55±0.51 | 1.60±0.48 | 1.56±0.47 |
| 脂质体对照 | 1.62±0.43 | 1.58±0.44 | 1.61±0.47 | 1.55±0.45 | 1.60±0.42 |
| 无关DNAzyme对照 | 1.54±0.46 | 1.57±0.41 | 1.60±0.45 | 1.58±0.44 | 1.53±0.48 |
| 裸DNAzyme对照 | 1.61±0.42 | 1.56±0.44 | 1.54±0.46 | 1.51±0.42 | 1.52±0.45 |
| lipo-DNAzyme | 1.65±0.48a | 1.25±0.42a | 1.11±0.45a | 0.91±0.43a | 0.71±0.46a |
| lipo-S-DNAzyme | 1.62±0.44ac | 1.08±0.43ac | 0.93±0.48ac | 0.81±0.45ac | 0.63±0.41ac |
| lipo-LNAzyme | 1.66±0.47ace | 0.96±0.39ace | 0.73±0.46ace | 0.64±0.42ace | 0.35±0.44ace |
加入核酶药物后, 各实验组对细胞荧光素酶基因的表达均显示出较强的抑制作用(均P<0.05), lipo-DNAzyme、lipo-S-DNAzyme和lipo-LNAzyme的平均抑制率分别为31.18%、40.69和52.33%(表2).
| 分组 | 1 d | 3 d | 5 d | 7 d |
| 空白对照 | 4 971±297 | 4 958±290 | 4 966±281 | 4 973±279 |
| 脂质体对照 | 4 896±291 | 4 905±285 | 4 897±275 | 4 912±287 |
| 无关DNAzyme对照 | 4 925±289 | 4 898±279 | 4 901±281 | 4 891±278 |
| 裸DNAzyme对照 | 4 776±261 | 4 539±248 | 4 431±271 | 4 273±267 |
| lipo-DNAzyme | 4 272±241a | 3 568±257a | 3 022±269a | 2 405±244a |
| lipo-S-DNAzyme | 3 701±232ac | 3 042±265ac | 2 437±246ac | 2 254±258ac |
| lipo-LNAzyme | 3 458±151ace | 2 651±156ace | 2 054±178ace | 1 027±162ace |
用药7 d后, 采用MTT比色法测定各组A值, lipo-DNAzyme、lipo-S-DNAzyme和lipo-LNAzyme组的A值分别为1.16±0.04、1.16±0.04和1.14±0.04, 与空白对照组的1.20±0.04比较均无差异, 表明LNAzyme脂质体混合物对细胞代谢无影响.
反义技术是近年来基因治疗研究的热点之一, 有望成为分子水平治疗各种疾病新的突破口. DNAzyme是继核酶(Ribozyme)之后人们对酶认识的又一次重大飞跃. 与核酶相比, DNAzyme具有抗降解性强、结构简单、催化效率高等优点. 对底物的切割作用方面, DNAzyme比核酶有更显著的位点专一性和序列特异性. LNAzyme是DNAzyme的一种衍生物, 是一种经过锁核酸(locked nucleic acid, LNA)修饰的DNAzyme, 即在DNAzyme的两条结合臂上嵌入一个或多个LNA单体. 由于LNA具有其他寡核苷酸无可比拟的优势, LNA的引入大大增强了DNAzyme与底物的杂交亲和力, 增强了切割反应的酶促活力, 也增强了DNAzyme的抗核酸酶降解能力, 因此, LNAzyme的出现使以寡核苷酸为基础的反义核酸治疗又上了一个新台阶.
HepG2.9706细胞是将一种转基因细胞, 是将pHCV-Luc所含HCV-5'NCR-C RNA基因与luc的融合基因片段克隆于含neo基因(G418抗性基因)的pCl-neo载体上, 获得了既能在真核细胞内表达荧光素酶活性, 又具有G418抗性的质粒pHCV-neo[14]. HepG2.9706细胞的主要特点是检测简单省时, 通过检测荧光素酶基因表达活性和(或)HCV RNA表达活性, 即可初步了解HCV 5'-NCR RNA基因起始区受封闭的程度.
本研究结果显示, 针对HCV保守区域5'-NCR IRES位点设计合成寡聚DNAzyme, 并以阳离子脂质体为载药体系, 在HepG2.9706细胞内均能有效抑制HCV RNA的表达(均P<0.05), 其中, LNAzyme的抑制作用最强, 平均抑制率可达44.58%, 而且, 随用药时间延长, 抑制率呈增高趋势, 用药7 d后, 平均抑制率达29.91%. 荧光素酶基因表达抑制试验结果也显示, LNAzyme对荧光素酶基因表达的抑制作用也较其他DNAzyme强(P<0.05), 平均抑制率可达52.33%. 此外, MTT比色结果表明, LNAzyme脂质体混合物对细胞代谢基本无影响(P>0.05).
虽然本研究结果显示LNAzyme对HCV RNA和荧光素酶基因的表达均有较高的抑制率(与其他核酶比较, 均P<0.05), 但从理论上讲, 此抑制率仍不够理想, 这可能与多方面因素有关, 特别是底物的二级结构和更高级结构及LNAzyme本身的二级结构. 这些二级结构可掩盖一些酶切位点, 甚至不同程度地影响到酶的活性. 关于这些影响因素, 还有待于进一步研究. 尽管如此, LNAzyme仍有望成为感染性疾病、恶性肿瘤等疾病基因治疗的新型反义核酸药物.
反义核酸技术, 包括反义寡核苷酸技术、核酶技术等, 已被证明是研究、治疗病毒感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤等多种疾病的行之有效的手段之一, 可通过针对在疾病发生、发展过程中发挥重要作用的生长因子、受体、关键酶、原癌基因、抑癌基因或凋亡相关基因, 通过导入的外源DNA或RNA短序列, 特异性地进行结合、封闭或调节其功能及产物表达, 从而达到治疗目的.
邹小明, 教授, 哈尔滨医科大学附属第二医院普外二科
反义核酸技术作为分子生物学的新型抗基因技术, 目前不仅广泛应用于生理学、病理学、药理学等学科的基础研究, 而且已成为药物发展的新兴策略. 在反义核酸技术基础上发展起来的反基因技术, 即三螺旋构象寡核苷酸技术(TFO)是目前研究的热点. 日前亟待解决的问题一是没有一种满意的肝靶向性核酸药物载体, 另外就是缺乏特异性抗病毒药物.
锁核酸(LNA)是一种新兴环状核苷酸衍生物, 具有分子杂交能力强、抗核酸酶降解能力等特性, 本实验基于前期研究基础上, 在脱氧核酶分子的双臂上各引入2个LNA分子, 从而增加了LNAzyme与底物RNA的杂交亲和力, 同时, 增强了切割反应的酶促活力.
本文选题新颖, 设计合理, 结果可靠, 有较好的学术价值.
编辑:曹丽鸥 电编:何基才
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