修回日期: 2009-11-30
接受日期: 2009-12-07
在线出版日期: 2010-01-18
目的: 探讨真核翻译起始因子-5A2(eukaryotic initiation factor 5A2, EIF-5A2)在肝癌内的表达及其与VEGF表达、血管密度和临床病理指标的关系.
方法: 用免疫组织化学方法检测49例HCC组织及6例正常肝组织中EIF-5A2、VEGF和CD34的表达, 计数微血管密度(MVD), 并结合临床病理特征进行比较分析.
结果: 49例HCC组织中EIF-5A2、VEGF、CD34阳性表达率分别为87.7%、89.7%及100.0%, 正常肝组织EIF-5A2、CD34表达呈阴性, VEGF表达为阴性或弱阳性. 肝癌组织中EIF-5A2蛋白表达与VEGF表达及MVD间均呈正相关(r = 0.416, 0.321, 均P<0.05); 不同肿瘤灶数量的HCC组织EIF-5A2、VEGF蛋白表达及MVD差别无显著性, 不同直径HCC的EIF-5A2、VEGF蛋白表达差别亦无显著性, 而不同直径的HCC的MVD差别有显著性(P<0.05). 有癌栓形成组与无癌栓组相比EIF-5A2、VEGF蛋白表达及MVD差别均有显著性(均P<0.05). 肿瘤包膜完整组与无胞膜/包膜不完整组两组间EIF-5A2 、VEGF蛋白表达及MVD差别均有显著性(均P<0.05).
结论: 肝癌组织中有较高的EIF-5A2阳性表达; EIF-5A2表达与VEGF表达及MVD呈正相关, 与HCC组织血管侵犯和转移倾向有关.
引文著录: 赖旭东, 陈晓辉, 许贺标, 刘玉荣, 马宁芳. EIF-5A2在肝细胞癌中的表达及其与VEGF、MVD的关系. 世界华人消化杂志 2010; 18(2): 137-142
Revised: November 30, 2009
Accepted: December 7, 2009
Published online: January 18, 2010
AIM: To investigate the correlations of eukaryotic initiation factor-5A2 (EIF-5A2) expression with vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, microvessel density (MVD) and clinicopathological parameters in hepatocellular carcinoma (HCC).
METHODS: Immunohistochemistry was used to determine the expression of EIF-5A2, VEGF and CD34 in 49 HCC tissues and 6 normal liver tissues. The MVD was calculated by counting CD34-labeled vessels. The correlations of EIF-5A2 expression with VEGF expression, MVD and clinicopathological parameters in HCC were then analyzed.
RESULTS: The positive rates of EIF-5A2, VEGF and CD34 expression in 49 HCC tissues were 87.7%, 89.7% and 100%, respectively. In contrast, EIF-5A2 and CD34 expression was not detected and VEGF was weakly detected in normal liver tissues. EIF-5A2 expression was positively correlated with VEGF expression and MVD (r = 0.416 and 0.321, respectively; both P < 0.05) in HCC. There were no significant differences in EIF-5A2 expression, VEGF expression and MVD between HCC tissues containing a single tumor focus and multiple tumor foci. No differences were found in the expression of EIF-5A2 and VEGF among HCCs of different diameters though a significant difference was noted in MVD. The levels of EIF-5A2 and VEGF expression and MVD were significantly higher in HCC patients with portal vein tumor thrombosis than in those without portal vein tumor thrombosis (all P < 0.05). Significant differences were also noted in EIF-5A2 and VEGF expression and MVD between HCC with an integral capsule and that without an integral capsule (all P < 0.05).
CONCLUSION: EIF-5A2 is highly expressed in HCC tissues. EIF-5A2 expression is positively correlated with VEGF expression and MVD in HCC. The overexpression of EIF-5A2 may play an important role in portal vein encroachment and metastasis of HCC.
- Citation: Lai XD, Chen XH, Xu HB, Liu YR, Ma NF. Correlations of EIF-5A2 protein expression with VEGF expression and microvessel density in hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 18(2): 137-142
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v18/i2/137.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v18.i2.137
真核翻译起始因子-5A2(eukaryotic initiation factor-5A2, EIF-5A2)是在人卵巢癌UACC-1598细胞内发现的新癌基因[1], 为真核生物翻译起始因子-5A(eukaryotic initiation factor 5A, EIF-5A)家族中的一员, 其表达产物与EIF-5A有82%同源性. EIF-5A蛋白在生物合成后, 其分子上的赖氨酸即被N'-赖氨酸合酶(deoxyhypusine synthase, DHPS)催化修饰形成8-羧基2, 7, 10-三氨基癸酸(hypusine), 进而使EIF-5A活化以维持细胞的正常增殖, 抑制DHPS活性将延缓正常细胞或各种肿瘤细胞的细胞周期[2,3]. EIF-5A mRNA及蛋白广泛表达于人体正常组织或肿瘤细胞, 而同样受DHPS作用的EIF-5A2仅在正常睾丸和脑细胞中有弱表达, 但某些肿瘤细胞内如卵巢癌和结肠癌等, EIF-5A2却有很强的表达, 且与临床分期密切相关[4,5], 提示EIF-5A2极可能为一个转移相关基因. 原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种强的血管依赖性肿瘤, 具有生长快、转移早和高死亡率的特点, 血管生成是其恶性化的第一步, 因此以血管生成信号传导通路为靶向的抗血管治疗是颇具潜力的、抗HCC浸润、转移和术后复发的治疗方法[6], 但在血管生成过程中, 许多信号分子调控机制目前还不清楚. 有研究报道抑制EIF-5A2的激活因子DHPS将影响血管内皮细胞的增殖及血管发生, 提示EIF-5A2表达可能与血管生成有关[7]. 本研究采用免疫组织化学的方法检测肝癌组织内EIF-5A2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等表达并计数HCC的微血管密度(microvascular density, MVD), 旨在探讨EIF-5A2表达与VEGF表达、MVD及HCC主要临床病理特征的关系.
选取广州附属肿瘤医院病理科2008年HCC切除标本49例, 男43例, 女6例, 年龄28- 74(平均48.6)岁. 所有标本病理诊断均为HCC, 肝癌病理分级按Edmondson方法分级Ⅰ-Ⅱ级38例, Ⅲ级11例. 49例肝癌标本中, 肿瘤直径<5 cm有17例, 肿瘤直径>5 cm者32例, 36例有门脉血管转移. 另取6例正常肝移植供体活检肝组织切片作正常对照. 鼠抗人EIF-5A2单克隆抗体由香港大学临床肿瘤学系关新元教授惠赠, 兔抗人VEGF多克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体及兔/鼠两步法检测试剂盒(UltraVision Detection System, HRP/DAB)均为NeoMarkers产品.
1.2.1 切片制备: 所有标本组织均经过常规100 g/L的甲醛溶液固定, 石蜡包埋. 载玻片经泡酸、高温灭菌、多聚赖氨酸涂片处理. 连续切片, 片厚4 μm, 分别行HE染色作复诊、组织病理学分级以及EIF-5A2、VEGF及CD34免疫组织化学染色.
1.2.2 EIF-5A2和VEGF结果判定标准: 采用双盲评分法. 在排除非特异性染色的前提下, 以黄色、棕黄色、棕褐色为阳性, 计分方法A: 按切片中细胞染色的深浅评分, 0分-无着色; 1分-细胞染色呈浅黄色; 2分-细胞染色呈棕黄色; 3分-细胞染色呈棕褐色. B: 按切片中的阳性细胞比例评分, 每例随机观察5个视野, 每个视野100个细胞, 计数500个细胞中染色阳性的细胞数, 0分-显色细胞数≤5%; 1分-显色细胞数占5%-25%; 2分-显色细胞数占25%-50%; 3分-显色细胞数占50%-75%; 4分-75%以上的细胞显色. 每例标本染色积分 = A×B, 若乘积≤1为阴性, >1为阳性.
1.2.3 CD34结果及MVD判定标准: 根据Weidner[8]计数方法, 每一染成棕黄色的、可与周围肿瘤细胞或组织区分开来的内皮细胞或内皮细胞簇, 均作为1个单一的微血管. 管腔面积大于8个红细胞直径或带有较厚肌层的微血管均不计数. 肿瘤内细胞稀少区域的微血管不进行计数. 结果判定在双盲法下进行. 于低倍镜(×40和×100)下选取5个微血管最多的视野即热点区(Hotspot), 再于高倍(×400)视野下计数微血管的数目, 求得5个视野的均值作为MVD. 硬化、炎症及坏死区的微血管不计入计数结果. 若管腔大且长的特殊类型血管, 采用Taniganwa等报道的改良法计算[9], 即每40 μm长度的此类血管计数为一个MVD值.
统计学处理 所有数据均经统计软件SPSS12.0进行统计分析, EIF-5A2表达与VEGF的表达及MVD相关性采用单因素Spearman相关分析, EIF-5A2、VEGF表达和MVD与肝癌临床病理因素的分析采用t检验. 以α = 0.05作为检验水准. EIF-5A2、VEGF表达分值、MVD值以mean±SD表示.
49例肝癌组织中EIF-5A2表达阳性43例(87.7%, 表1), 阳性表达呈浅黄色或棕黄色, 定位于肝癌细胞胞质, 癌体周边细胞EIF-5A2的表达明显强于癌体中央细胞(图1A, D), 并可见其浸润穿越周围的结缔组织, 呈侵袭性生长; VEGF阳性表达44例(89.7%, 表1), 阳性表达呈棕黄色或棕褐色, 定位于细胞质(图1B, E), 与EIF-5A2表达有相同趋势; 49例组肝癌组织均有CD34表达(100%, 表1), 阳性表达呈棕褐色, 定位于肿瘤区内皮细胞胞质, 可见散在CD34阳性内皮细胞或内皮细胞簇, 部分微血管有管腔, 形态不规则, 低分化肝癌组织内的微血管密度大于分化程度高的肝癌组织(图1C, F). 正常对照肝组织EIF-5A2呈阴性表达, VEGF呈阴性或弱阳性表达. Spearman相关分析显示EIF-5A2与VEGF、EIF-5A2与MVD及VEGF与MVD间均存在正相关(表2).
| 组织类型 | n | 阳性率(%) | ||
| EIF-5A2 | VEGF | CD34 | ||
| 肝癌组织 | 49 | 87.7 | 89.7 | 100.0 |
| 正常肝组织 | 6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| EIF-5A2 | VEGF | MVD | |
| EIF-5A2 | |||
| r值 | 1.000 | 0.416 | 0.321 |
| P值 | - | <0.05 | <0.05 |
| VEGF | |||
| r值 | 0.416 | 1.000 | 0.385 |
| P值 | <0.05 | - | <0.05 |
| MVD | |||
| r值 | 0.321 | 0.385 | 1.000 |
| P值 | <0.05 | <0.05 | - |
不同肿瘤数量的HCC组织EIF-5A2、VEGF蛋白表达及MVD差别无显著性(P>0.05), 不同直径HCC的EIF-5A2、VEGF蛋白表达差别无显著性(P>0.05), 而不同直径HCC的MVD差别有显著性(P<0.05). 有癌栓形成组与无癌栓组相比EIF-5A2、VEGF蛋白表达及MVD差别均有显著性(P<0.05). 49例HCC中, 肿瘤包膜完整组与无胞膜/包膜不完整组两组间EIF-5A2、VEGF蛋白表达及MVD差别均有显著性(P<0.05). 根据Edmonds病理分级, 49例HCC中, Ⅰ-Ⅱ级与Ⅲ级两组间EIF-5A2、VEGF蛋白表达及MVD差别均无显著性(P>0.05). AFP值≤50 μg/L与>50 μg/L两组间EIF-5A2、VEGF蛋白表达及MVD差别均无显著性(P>0.05, 表3).
| 病理参数 | n | EIF-5A2表达 | VEGF表达 | MVD |
| 肿瘤数量 | ||||
| 单个 | 27 | 7.66±1.30 | 8.15±1.16 | 52.04±3.54 |
| 多个 | 22 | 7.32±2.45 | 7.96±1.05 | 54.25±4.12 |
| 肿瘤大小(cm) | ||||
| ≤5 | 17 | 7.25±2.12 | 7.89±1.05 | 46.56±4.22 |
| >5 | 32 | 6.94±1.22 | 7.94±1.66 | 53.18±3.24a |
| 癌栓 | ||||
| 有 | 36 | 7.24±1.25a | 8.45±0.84a | 56.45±3.81a |
| 无 | 13 | 6.15±2.01 | 7.50±1.20 | 48.50±3.63 |
| 包膜 | ||||
| 有 | 35 | 6.82±1.64 | 7.48±1.45 | 49.64±3.87 |
| 无/不完整 | 14 | 7.79±1.85a | 8.39±1.13a | 59.50±4.06a |
| 病理分级 | ||||
| Ⅰ-Ⅱ | 38 | 7.55±1.60 | 7.85±1.26 | 52.26±2.89 |
| Ⅲ-Ⅳ | 11 | 7.84±1.94 | 8.02±0.95 | 54.67±3.36 |
| AFP (μg/L) | ||||
| ≤50 | 14 | 7.28±2.10 | 8.05±0.85 | 51.67±3.46 |
| >50 | 35 | 7.45±1.78 | 8.23±1.85 | 52.14±4.22 |
本研究结果显示人正常肝组织无EIF-5A2表达, 而HCC组织中有EIF-5A2表达, 癌周缘EIF-5A2表达明显强于癌体中央, 提示肿瘤侵袭的前沿细胞中EIF-5A2合成较多. 统计学分析结果显示门脉癌栓形成、包膜不完整的HCC组织EIF-5A2表达明显高于无门脉癌栓形成及有包膜的HCC组织, 表明EIF-5A2表达与HCC的发展及转移有关. 血管生成在肿瘤生长及转移过程中起关键作用, 其提供丰富的营养, 为肿瘤的浸润及转移创造条件. 肿瘤细胞释放的促血管生成因子可作用于内皮细胞, 促进新血管的生成, 其中VEGF是目前公认的直接参与新血管生成的因子, 能刺激血管内皮细胞增殖、降解血管外基质, 导致内皮细胞分裂、迁移, 形成大量新生血管, 满足肿瘤不断生长的需要[10]. HCC是富血管肿瘤, 其特点为易侵犯门脉系统、早期发生播散和转移[11,12]. 鉴于EIF-5A2在HCC中的表达特点, 本研究进一步探讨了HCC中血管生成因子VEGF表达及MVD与EIF-5A2表达的关系. 大量研究证实VEGF与HCC生长、转移和新生血管形成关系密切[13,14]. 正常情况下, VEGF广泛分布于人体许多组织中以维持正常血管密度和营养物质的供应, 但其表达水平低, 普通方法难以测出, 与之相比多数恶性肿瘤存在VEGF高表达[15], 这与本实验观察到的VEGF在HCC组织及正常肝组织中的表达情况一致. 本实验中HCC组织VEGF表达定位及强度趋势与EIF-5A2非常接近, 多数EIF-5A2高表达的HCC组织尤其是肿瘤周边的EIF-5A2高表达细胞其VEGF也同样高表达, 而EIF-5A2阴性或弱表达组织其VEGF表达也弱, 二者之间呈正相关, 提示EIF-5A2可能与VEGF调控有关. MVD是反映恶性肿瘤侵袭和转移等生物学行为的一个重要指标[9,10], 通常以抗CD34抗体标记肝癌新生血微血管内皮细胞来计算MVD[16]. 许多研究显示肝癌组织中的MVD与肿瘤的转移及复发相关[9]. 本研究采用CD34免疫组织化学染色计数肝癌的MVD, 结果显示高分化及低分化的HCC组织中MVD差异显著, 即分化越差, MVD计数越高, 说明HCC微血管生成与其本身生物学特征有关. 统计学分析结果显示MVD计数与EIF-5A2表达程度正相关, 即EIF-5A2高表达的瘤组织MVD计数高, 提示EIF-5A2表达与微血管形成密切相关. EIF是细胞蛋白合成过程中的一个上游调控因子, 细胞快速增长及分裂的启动有赖于蛋白合成酶系统活性的上调. 细胞内大量生长相关基因的mRNA表达受严格的翻译后调控, 任何翻译因子表达水平的微小变化都会打破平衡, 使各种蛋白表达量发生改变而引起细胞生物学行为的变化[17]. 作为EIF-5A家族成员, EIF-5A2蛋白表达上调可能会引起其他肿瘤相关因子如VEGF的表达增强, 继而产生相应的细胞生物学改变如癌细胞无限增殖、血管形成等. 此外本研究显示MVD计数与HCC包膜完整性及癌栓的生成有关, 此结果与以往的研究报道一致, 进一步说明EIF-5A2、VEGF及MVD之间的关系密切. 目前阻断肿瘤血管形成已成为临床肿瘤治疗研究的热点, 如何选择有效的治疗靶点阻断肿瘤新生血管形成是亟待解决的问题. 本研究结果显示EIF-5A2作为蛋白EIF, 在肝癌有特异性表达, 且与VEGF表达及MVD密切相关, 有望成为阻断HCC血管形成的有效靶点.
真核生物翻译起始因子-5A2(EIF-5A2)为人卵巢癌UACC-1598细胞3q26.2高扩增区段内新发现的癌基因, 属EIF-5A家族, 其在大部分正常组织内无表达, 而在肿瘤组织内特异性表达, 研究发现其高表达与卵巢癌的临床分期密切相关.
刘平, 教授, 南京医科大学第一附属医院肿瘤科
HCC生长快、转移早、死亡率高. 血管生成是HCC恶性化的第一步, 目前阻断HCC血管生成已成为临床治疗的热点, 因此以血管生成信号传导通路为靶向的抗血管治疗是颇具潜力的、抗HCC浸润、转移和术后复发的治疗方法.
有研究对多种腺癌的原发灶、转移灶差异表达基因进行比较, 发现有17种差异表达基因与转移有关, 其中包括在EIF-5A及EIF-5A2的赖氨酸修饰中起关键作用的DHPS.
本研究用免疫组织化学方法观察EIF-5A2在HCC的表达, 探讨了EIF-5A2表达与HCC内VEGF表达、MVD及其临床病理特征之间的关系. 为研究EIF-5A2在HCC中的作用机制提供了一定理论基础.
本研究证实, EIF-5A2表达与VEGF表达及MVD呈正相关, 与HCC组织血管侵犯和转移倾向有关. 为更深入研究EIF-5A2的作用机制, 寻找新的肿瘤预后诊断标记、设计有效的肿瘤治疗靶点提供理论依据.
本文研究了EIF-5A2在肝细胞癌中的表达及其与VEGF、MVD的关系, 方法较为单一, 有一定的科学性和可读性.
编辑:李军亮 电编:何基才
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