循环肿瘤细胞研究进展

摘要

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞, 是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因. 近年来, 随着检测技术的不断改进, CTCs检测作为一种新型的非侵入性诊断工具, 在早期发现患者术后复发与远处转移、评估疗效与预后等方面的应用价值已成为临床研究的热点. 本文简要综述近年CTCs检测的研究进展及其临床应用状况.

关键词: 循环肿瘤细胞; 恶性肿瘤; 转移

Advances in research on circulating tumor cells

Qing-Jie Zhou, Jian-Min Yang

Qing-Jie Zhou, Jian-Min Yang, Department of Gastroenterology, Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310014, Zhejiang Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 305070816.

Correspondence to: Professor Jian-Min Yang, Department of Gastroenterology, Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310014, Zhejiang Province, China. jianminyang@hotmail.com

Received: January 8, 2010
Revised: March 26, 2010
Accepted: March 29, 2010
Published online: April 18, 2010

Abstract

Circulating tumor cells (CTCs) are defined as cells that have detached, spontaneously or as a result of clinical operations, from a primary tumor or its metastatic lesions and circulate in the peripheral blood. They are considered as the primary reason for postoperative recurrence and distant metastasis of malignant tumors. In recent years, non-invasive detection of circulating tumor cells has become a new type of diagnostic tool to evaluate postoperative recurrence, distant metastasis, and prognosis. This article reviews recent advances in research on circulating tumor cells.

Key Words: Circulating tumor cell; Malignant tumor; Metastasis

0 引言

分子生物学及临床研究显示, 肿瘤的侵袭和微转移很可能在肿瘤发生的早期就已出现[1], 而目前临床肿瘤的发现和诊断仍高度依赖于影像学及血清肿瘤标志物的检查, 难以早期发现肿瘤的转移或复发, 也难以及时反映疗效. 因此, 早期发现微转移不仅对肿瘤复发和预后的判断有重要意义, 而且对指导临床治疗也有很大价值. 大量研究显示, 循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)的检测有助于早期发现肿瘤的微转移、监测术后复发、评估疗效及预后, 以及选择合适的个体化治疗[2].

1 CTCs概述

早在1869年, Ashworth发现血液中的一种血细胞同尸检发现的肿瘤细胞相似, 首次提出CTCs的概念[3]. 目前CTCs定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞. 进入循环未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓, 并在一定条件下发展为转移灶[4]. 近年来, 随着人们对肿瘤转移机制研究的深入, 以及检测技术的不断改进, CTCs的检测已取得了一些突破性的进展, 部分检测方法在稳定性、敏感性及特异性等方面均已较理想, CTCs的临床应用研究也已取得明显进展.

2 CTCs的富集

由于CTCs在外周血中的数量极少, 通常需在约1亿个白细胞和500亿个红细胞中寻找仅有的数个肿瘤细胞[1], 因此为了提高CTCs的检出率, 通常需在检测前行CTCs富集. 目前CTCs的富集方法按其原理主要分为免疫磁性分离法和基于形态学的富集法.

2.1 免疫磁性分离法(immunomagnetic separation, IMS)

IMS的原理是基于肿瘤细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合, 继而在外加磁场中通过相应抗原抗体复合物与磁珠相连被吸附而滞留在磁场中, 无该种表面抗原的其他细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性, 不在磁场中停留, 从而使肿瘤细胞得以分离. 磁珠可分为阳性分选磁珠和阴性分选磁珠2种, 其中阳性分选磁珠的富集效率与一般的分离方法相比可提高(1-10)×10³倍[4]. 目前基于免疫磁性原理富集或同时检测CTCs的技术主要有CellSearch系统、CTCs-Chip、免疫磁性细胞分选仪(MACS)、RARE、AdnaTest癌细胞检测系统等[5]. IMS可对外周血中的肿瘤细胞进行(1-20)×10⁴倍的富集, 与常规检测技术(如免疫细胞化学法, 流式细胞术, RT-PCR等)相结合, 可大大提高外周血样本中肿瘤细胞的浓度而提高检出率[6]. Zigeuner等[6]对于免疫磁性分离法中的阳性及阴性分离法以及单纯免疫细胞化学法进行了定量分析比较, 在每2×10⁷单个核细胞加入一定量的肿瘤细胞时, 后者的检出率仅为23%, 而利用免疫磁珠技术的检出率可达93.3%, 同时分离纯化后的肿瘤细胞活性高达85%以上. 因此认为, 免疫磁性分离富集可明显增加免疫细胞化学法检测外周血肿瘤细胞的检出率. 但由于目前仍缺乏高特异的肿瘤相关抗原, IMS在分离过程中仍可能因为CTCs的丢失而出现假阴性或假阳性结果.

2.2 基于形态学的富集法

密度梯度离心法是目前实验室常用的一种基于形态学特点富集肿瘤细胞的方法, 可从外周血中分离单个核细胞(包括CTCs), 设备要求不高, 方法较为简单, 但该方法缺乏特异性, 易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失[7]. 目前在此基础上建立起来的OncoQuick分离法, 用一种专用的50 mL试管, 内置多孔屏障, 其下为密度梯度分离液, 使用时将标本置于屏障之上, 从而避免在离心之前与分离液混合而污染. Rosenberg等[7]通过比较OncoQuick分离法与传统的Ficoll分离法发现, OncoQuick分离法对肿瘤细胞的平均回收率更高(87% vs 84%), 富集效果更好. 但在分离过程中仍可能丢失少量肿瘤细胞.

此外, 2000年由Vona等[8]提出的基于肿瘤细胞大小的分离法(isolation by size of epithelial tumor cells, ISET), 主要根据肿瘤细胞与正常细胞的大小不同来分离肿瘤细胞. 这种通过物理方法分离的细胞形态保存完整, 表面的各种抗原或分子标记均无破坏, 不影响细胞的特性, 为后续的检测提供了良好的条件, 且该方法设备技术要求不高, 过程易于掌握. 有学者用多种不同孔径的膜进行对比研究, 结果认为用8 μm大小孔径的膜分离外周血肿瘤细胞效果最佳[9]. 但这也意味着ISET只能分离直径大于8 μm的肿瘤细胞, 而目前还没报道证实所有的肿瘤细胞都大于8 μm, 使其分离的灵敏性受到质疑[6].

3 CTCs的检测

目前CTCs的检测方法众多, 根据检测原理可分两大类: 细胞计数法(cytometric methods)和核酸检测法(nucleic-acid based methods). 前者主要包括各种免疫细胞化学技术、流式细胞术等; 后者主要包括聚合酶链反应、逆转录聚合酶链反应及其各种改进的技术等.

3.1 免疫细胞化学法(immunocytochemistry, ICC)

ICC是指以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和细胞化学的呈色反应, 对相应抗原进行定位、定性和定量测定的技术. 其检测的肿瘤标志物主要分3类: (1)上皮细胞角蛋白(CK), 如CK19、CK20; (2)上皮细胞膜特异性抗原, 如黏蛋白类, 包括EMA、HMFG、HEA-125等; (3)肿瘤相关糖蛋白(TAG). ICC检测的主要优点是可进行细胞大小和形态学的分析, 缺点是敏感性低, 只能从(1-10)×10⁵个正常细胞中发现1个肿瘤细胞, 且应用免疫细胞化学法检测循环血中肿瘤细胞时, 每个载玻片上所能检测的细胞样本量仅为5×10⁵个细胞[10], 难以从外周血中大量的单核细胞中检测出极少量的肿瘤细胞, 因此单纯应用免疫细胞化学法敏感性低, 难以满足临床诊断需要. 为了能大范围检测外周血中稀少的肿瘤细胞, 近年来又相继研发出光纤阵列扫描术(fiber array scanning technology, FAST)[11], 激光扫描细胞计量仪(laser scanning cytometry, LSC)[12]等, 能够在传统的显微镜技术基础上高速扫描并快速、准确的定位免疫荧光标记的肿瘤细胞, 使检测的敏感性和实效性显著提高.

3.2 流式细胞术(flow cytometry, FCM)

FCM是一项集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体技术为一体的新型技术. 其优点是可以定量计数肿瘤细胞数量, 检测数据较精确, 还可对细胞进行多参数分析. 何成全等[13]应用流式细胞术检测66例胃癌患者外周血中CK19、CK20的表达. 结果66例胃癌患者CK19、CK20、CK19+CK20阳性表达率分别为53.1%(35/66)、56.1%(37/66)、46.9%(31/66), 检测的阳性率与患者的TNM分期及转移程度相关, 且检测胃癌远处转移的敏感度高达90.0%. 认为应用FCM检测CK19、CK20的表达对胃癌微转移的诊断具有一定临床意义. 但由于FCM检测靶细胞的敏感度仅为1/1-10万, 而外周血中肿瘤细胞的数量常少于1/100万, 因此应用FCM检测肿瘤细胞的价值在很大程度上依赖于可分析的细胞数量[14]. 此外标本固定贮存及研究人员间的差异等因素的干扰, 以及价格昂贵、耗时较长等都限制了该技术的广泛应用.

3.3 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)

PCR检测肿瘤患者外周血中的CTCs主要是通过检测癌基因、抑癌基因的突变或染色体质量排产生的异常DNA. 1977年, Leon等[15]用放射免疫测定法首次在肿瘤患者外周血中检测到了游离DNA. 随后研究显示, 神经母细胞瘤患者外周血中线粒体DNA[16]及N-MYC(神经母细胞瘤MYC基因衍生的一个致癌基因)DNA[17,18]的扩增均明显多于健康志愿者. 然而, 除了少数实体肿瘤的染色体易位(如尤文氏肉瘤的t(11; 22)(q24; q12)易位)或基因突变(如胃肠道肿瘤的RAS基因), 绝大部分实体肿瘤的DNA变化没有明显的特异性, 且很少适合用CTCs检测[2], 因此该方法虽然敏感性高[能从(1-10)×10⁶个正常细胞中检测出1个肿瘤细胞], 但易于出现假阳性, 且适用范围有限. 此外, 由于外周血中的CTCs和核酸的半衰期不稳定, 检测到的游离DNA可能仅仅是核酸而非真正的肿瘤细胞, 因此应用PCR技术通过DNA标记指标检测CTCs的特异性不高, 在临床实践中尚不能达到理想的效果.

3.4 逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)

RT-PCR检测CTCs是在PCR的基础上扩增由肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片段, 从而识别组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后RNA水平的异常. 由于这些特异性mRNA通常不表达于正常外周血细胞, 且半衰期较短, 在细胞死亡后会迅速被RNA酶降解, 因此在外周血中检测到的这些特异性mRNA可以间接提示CTCs的存在[19]. RT-PCR的灵敏度很高, 目前已可在107-108个外周血单核细胞中检测出单个肿瘤细胞[20]. 然而, RT-PCR及其各种改进的技术都是以某个肿瘤标志物的mRNA为标志物, 因此易受到样本污染, 靶基因在正常细胞中的表达及伪基因的扩增等影响而出现假阳性. Kowalewska等[21]采用RT-PCR方法以5种肿瘤抗原(SCCA, EGFR, hMAM, SBEM, CA9)mRNA标记检测正常志愿者外周血显示全阴性, 而在单纯炎症患者中却可出现4项(SCCA, EGFR, hMAM, SBEM)阳性, 表明炎症反应也可引起肿瘤抗原mRNA的升高. 另有研究显示[22], 慢性炎症性疾病患者的外周淋巴结和50%的骨髓样本中都可检测到CK19与CEA mRNA的表达, 因此癌症患者伴随的炎症反应可能会增加RT-PCR法检测CTCs时的假阳性率, 从而影响检测的特异性. 此外, 游离的RNA和杂交DNA也可能导致假阳性结果的出现[23]. 为提高检测的特异性和敏感性,近几年又开发出实时定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR和巢氏RT-PCR等新方法[24,25], 与常规的RT-PCR方法相比, 具有引物和探针的双重特异性, 扩增效率高、反应污染少、Ct值稳定等优势[26]. RT-PCR及其各种改进的技术目前在CTCs的检测中应用最广泛, 且被认为是目前检测CTCs最有效的方法, 已被成功地用于检测多种实体肿瘤的CTCs, 如恶性黑色素瘤[27]、软组织腺泡状肉瘤[28]、前列腺癌[29]、乳腺癌[30]、胃癌[31]及结直肠癌[32]等.

4 富集与检测技术结合

为了提高检测的敏感性和特异性, 近年来的文献中多使用富集与检测技术相结合的自动化检测系统, 目前使用最多的就是CellSearch检测系统. CellSearch系统是目前唯一一项通过美国FDA批准用于临床的CTCs检测技术, 已被应用于预测转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌患者的无进展存活率和总存活率. 其原理是采用一种可同铁微粒相结合的抗体, 称为铁磁流体, 这种铁磁流体同CTCs(主要是表面的EpCAM)有极强的特异性结合能力, 结合后再应用强力磁体将这些CTCs从血液样本中提取出并进行生物或化学染色, 从而可以准确识别CTCs. 应用CellSearch系统, 只需应用7.5 mL的血液样本, 即可从400多亿的血细胞中检测到单一的一个CTCs, 结果相当准确. Balic等[33]分别用CellSearch系统和Oncoquick法检测以CKs, EpCAM和DAPI标记的CTCs, 两种方法在15例正常健康志愿者外周血样本中的特异性均达到100%, 而在一组61例异构癌患者的外周血样本中, CellSearch系统检测出CTCs>1的样本明显多于Oncoquick(33 vs 14), 中位CTCs数也较多. CellSearch系统是一项半自动化检测系统, 能自动俘获从实体肿瘤上脱落后进入患者血液中的肿瘤细胞, 对转移癌的诊断有很高的特异度, 能鉴别所有类型的肿瘤细胞, 在不同实验室间也有很好的可重复性[34]. 但由于缺乏肿瘤特异性抗原, 敏感度相对较低, 会出现漏诊, 且检验费用较高, 使其在临床上的广泛应用受到一定限制. 此外, 新近出现的CTCs-Chip也是一项集富集与检测为一体的先进技术, 检测灵敏度非常高, 即使只有极少量的肿瘤细胞, 也只需一个步骤即可将其从全血中分离, 检验可随时进行, 结果不会受肿瘤细胞间断释放的影响, 便于对患者进行实时监测, 且不影响细胞活性, 有利于进一步进行分子生物学和遗传学分析[35].

5 CTCs的临床应用

研究发现, 进入循环系统的CTCs绝大多数在机体免疫识别及杀伤等作用下发生凋亡, 只有极少数能存活下来, 并在一定条件下发展为转移灶. 因此, 在外周血中检测到CTCs并不意味着一定存在转移灶. 尽管如此, CTCs在早期发现转移性结直肠癌, 乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤的微转移、监测术后复发与转移、评估疗效与预后、选择合适的个体化治疗等方面的作用已得到大量研究的证实. Sastre等[36]使用CellSearch系统检测94例大肠癌患者的外周血CTCs, 将CTCs≥2个/7.5 mL外周血定义为阳性, 结果显示阳性率为36.2%(34/94), CTCs阳性率与原发肿瘤部位、CEA、LDH升高的水平及肿瘤分化程度无关, 但与结肠癌的临床分期相关(Ⅱ期20.7%, Ⅲ期24.1%, Ⅳ期60.7%, P = 0.005), 且CTCs在结肠癌的早期阶段即可检测到, 表明CTCs检测有助于早期发现结肠癌及可能出现的微转移. Uen等[32]应用RT-PCR方法以多肿瘤抗原(CK19、CK20、CEA)mRNA标记检测438例结肠癌根治术后患者的外周血CTCs, 结果采用多变量比例风险回归分析, 显示淋巴结转移、血管浸润和术后CTCs的持续阳性可作为患者术后复发的独立预后因子, 术后CTCs的持续阳性与患者术后较差的无复发生存率密切相关, 且检测CTCs水平有助于确定是否对其采用术后辅助治疗. Ignatiadis等[37]采用RT-PCR法检测444例Ⅰ-Ⅲ期乳腺癌患者治疗前后的外周血CTCs, 结果显示治疗前CK19 mRNA的阳性率为40.8%, 平均随访56.4 mo并对其中437例接受辅助化疗的患者进行CK19 mRNA监测, 发现治疗前CK19 mRNA阳性患者的DFS和OS较CK19 mRNA阴性的患者短(P<0.001), 且这种差异在雌激素受体阴性的患者中更为显著; CK19 mRNA阳性与患者更广泛的淋巴结浸润, 更高的临床复发率和死亡率密切相关, 治疗后CK19 mRNA仍阳性的患者DFS和OS明显较短[38]; 此外, 治疗前乳腺球蛋白A和HER-2 mRNA阳性的患者预后也较阴性的患者差[39]. 这些结果均表明RT-PCR法检测CTCs在早期乳腺癌的预后判断与疗效评估中具有重要的潜在应用价值. Cristofanilli等[40]进行的一项多中心、前瞻性研究使用CellSearch系统检测177例转移性乳腺癌患者治疗前后外周血CTCs, 结果显示, 在开始治疗前每7.5 mL外周血CTCs≥5个的转移性乳腺癌患者预后明显较CTCs<5个的患者差, 其中位无进展生存期(PFS)(分别为2.7 mo和7 mo)和总生存期(OS)(分别为10.1 mo和>18 mo)均明显短于后者. 表明CTCs计数可作为转移性乳腺癌患者预后的独立预测指标, 并对早期评估抗肿瘤治疗的疗效具有潜在价值[41]. Ennis等[42]、de Bono等[43]在对前列癌患者的研究中也得到了相似的结论. 此外, 虽然研究结果不尽相同, CTCs检测在胰腺癌[44]、胃癌[45,46]、膀胱癌[47,48]及肺癌[49,50]的临床应用中也取得了一定的进展. Bevilacqua等[51]报道了1例患者肺组织活检显示为低分化神经内分泌瘤, 但在外周血中却检测到EpCAM表达阳性的细胞, 然而EpCAM通常不表达于低分化神经内分泌瘤, 于是进行肝穿刺活检发现了肝内肺转移灶, 最后确诊为小细胞型肺癌, 这也进一步印证了外周血CTCs检测在早期诊断转移性肿瘤中的应用价值.

6 结论

外周血CTCs检测作为一种具有高度可行性和可重复性的非侵入性新型诊断工具, 在对实体肿瘤微转移的早期诊断、疗效及预后评估中的作用是显而易见的. 可以预见, 随着检测技术的不断改进, 敏感性和特异性的不断提高, CTCs检测必将在临床肿瘤诊治中得到推广应用.

评论

背景资料

分子生物学及临床研究显示, 肿瘤的侵袭和微转移很可能在肿瘤发生的早期就已出现, 而循环肿瘤细胞(CTCs)是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因, 因此早期检测CTCs不仅对肿瘤复发和预后的判断有重要意义, 而且对指导临床治疗也有很大价值.

同行评议者

郭晓钟, 教授, 中国人民解放军沈阳军区总医院消化内科.

研发前沿

随着检测技术的不断改进, CTCs检测作为一种新型的非侵入性诊断工具, 在早期发现肿瘤术后复发与远处转移、评估疗效与预后等方面的应用价值已成为临床研究的热点.

相关报道

Uen等应用RT-PCR法检测438例结肠癌根治术后患者的外周血CTCs, 结果显示淋巴结转移、血管浸润和术后CTCs的持续阳性可作为患者术后复发的独立预后因子, 术后CTCs的持续阳性与患者术后较差的无复发生存率密切相关, 且检测CTCs水平有助于确定是否对其采用术后辅助治疗.

创新盘点

CellSearch检测系统作为一项集富集与检测技术于一体的自动化检测系统, 是目前唯一一项通过美国FDA批准用于临床的CTCs检测技术, 已被应用于预测转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌患者的无进展存活率和总存活率.

应用要点

外周血CTCs检测作为一种具有高度可行性和可重复性的非侵入性新型诊断工具, 在对实体肿瘤微转移的早期诊断、疗效及预后评估中的作用是显而易见的. 可以预见, 随着检测技术的不断改进, 敏感性和特异性的不断提高, CTCs检测必将在临床肿瘤诊治中得到推广应用.

同行评价

本文所引资料文献系统、全面, 论述条理清晰, 逻辑性较强, 对于循环肿瘤细胞的概念、检测手段、理论及临床应用价值给予了全面系统的阐述, 相信其在今后的研究工作中必有突破性进展, 从而为恶性肿瘤的早期诊断及术后复发的监测带来全新的变革.

备注

编辑: 李军亮 电编:何基才

参考文献

1.	Paterlini-Brechot P, Benali NL. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Lett. 2007;253:180-204.  [PubMed]  [DOI]

2.	Mocellin S, Keilholz U, Rossi CR, Nitti D. Circulating tumor cells: the 'leukemic phase' of solid cancers. Trends Mol Med. 2006;12:130-139.  [PubMed]  [DOI]

3.	Ghossein RA, Carusone L, Bhattacharya S. Review: polymerase chain reaction detection of micrometastases and circulating tumor cells: application to melanoma, prostate, and thyroid carcinomas. Diagn Mol Pathol. 1999;8:165-175.  [PubMed]  [DOI]

4.	Pachmann K, Clement JH, Schneider CP, Willen B, Camara O, Pachmann U, Höffken K. Standardized quantification of circulating peripheral tumor cells from lung and breast cancer. Clin Chem Lab Med. 2005;43:617-627.  [PubMed]  [DOI]

5.	Mostert B, Sleijfer S, Foekens JA, Gratama JW. Circulating tumor cells (CTCs): detection methods and their clinical relevance in breast cancer. Cancer Treat Rev. 2009;35:463-474.  [PubMed]  [DOI]

6.	Zigeuner RE, Riesenberg R, Pohla H, Hofstetter A, Oberneder R. Immunomagnetic cell enrichment detects more disseminated cancer cells than immunocytochemistry in vitro. J Urol. 2000;164:1834-1837.  [PubMed]  [DOI]

7.	Rosenberg R, Gertler R, Friederichs J, Fuehrer K, Dahm M, Phelps R, Thorban S, Nekarda H, Siewert JR. Comparison of two density gradient centrifugation systems for the enrichment of disseminated tumor cells in blood. Cytometry. 2002;49:150-158.  [PubMed]  [DOI]

8.	Vona G, Sabile A, Louha M, Sitruk V, Romana S, Schütze K, Capron F, Franco D, Pazzagli M, Vekemans M. Isolation by size of epithelial tumor cells : a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am J Pathol. 2000;156:57-63.  [PubMed]  [DOI]

9.	Zabaglo L, Ormerod MG, Parton M, Ring A, Smith IE, Dowsett M. Cell filtration-laser scanning cytometry for the characterisation of circulating breast cancer cells. Cytometry A. 2003;55:102-108.  [PubMed]  [DOI]

10.	Molnar B, Sipos F, Galamb O, Tulassay Z. Molecular detection of circulating cancer cells. Role in diagnosis, prognosis and follow-up of colon cancer patients. Dig Dis. 2003;21:320-325.  [PubMed]  [DOI]

11.	Hsieh HB, Marrinucci D, Bethel K, Curry DN, Humphrey M, Krivacic RT, Kroener J, Kroener L, Ladanyi A, Lazarus N. High speed detection of circulating tumor cells. Biosens Bioelectron. 2006;21:1893-1899.  [PubMed]  [DOI]

12.	Tárnok A, Gerstner AO. Clinical applications of laser scanning cytometry. Cytometry. 2002;50:133-143.  [PubMed]  [DOI]

13.	何 成全, 詹 乾钢, 单 水阳, 胡 伯年, 叶 平江, 冯 刚, 许 焕建, 付 文安. 胃癌患者外周血中CK19, CK20表达的临床研究. 中国肿瘤临床. 2005;32:401-403.  [PubMed]  [DOI]

14.	Goodale D, Phay C, Postenka CO, Keeney M, Allan AL. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 2009;75:344-355.  [PubMed]  [DOI]

15.	Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 1977;37:646-650.  [PubMed]  [DOI]

16.	Chiu RW, Chan LY, Lam NY, Tsui NB, Ng EK, Rainer TH, Lo YM. Quantitative analysis of circulating mitochondrial DNA in plasma. Clin Chem. 2003;49:719-726.  [PubMed]  [DOI]

17.	Combaret V, Audoynaud C, Iacono I, Favrot MC, Schell M, Bergeron C, Puisieux A. Circulating MYCN DNA as a tumor-specific marker in neuroblastoma patients. Cancer Res. 2002;62:3646-3648.  [PubMed]  [DOI]

18.	Gotoh T, Hosoi H, Iehara T, Kuwahara Y, Osone S, Tsuchiya K, Ohira M, Nakagawara A, Kuroda H, Sugimoto T. Prediction of MYCN amplification in neuroblastoma using serum DNA and real-time quantitative polymerase chain reaction. J Clin Oncol. 2005;23:5205-5210.  [PubMed]  [DOI]

19.	Ji XQ, Sato H, Tanaka H, Konishi Y, Fujimoto T, Takahashi O, Tanaka T. Real-time quantitative RT-PCR detection of disseminated endometrial tumor cells in peripheral blood and lymph nodes using the LightCycler System. Gynecol Oncol. 2006;100:355-360.  [PubMed]  [DOI]

20.	Raj GV, Moreno JG, Gomella LG. Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors. Cancer. 1998;82:1419-1442.  [PubMed]  [DOI]

21.	Kowalewska M, Chechlińska M, Markowicz S, Kober P, Nowak R. The relevance of RT-PCR detection of disseminated tumour cells is hampered by the expression of markers regarded as tumour-specific in activated lymphocytes. Eur J Cancer. 2006;42:2671-2674.  [PubMed]  [DOI]

22.

Jung R, Krüger W, Hosch S, Holweg M, Kröger N, Gutensohn K, Wagener C, Neumaier M, Zander AR. Specificity of reverse transcriptase polymerase chain reaction assays designed for the detection of circulating cancer cells is influenced by cytokines in vivo and in vitro. Br J Cancer. 1998;78:1194-1198.  [PubMed]  [DOI]

23.	Iakovlev VV, Goswami RS, Vecchiarelli J, Arneson NC, Done SJ. Quantitative detection of circulating epithelial cells by Q-RT-PCR. Breast Cancer Res Treat. 2008;107:145-154.  [PubMed]  [DOI]

24.	Schüler F, Dölken G. Detection and monitoring of minimal residual disease by quantitative real-time PCR. Clin Chim Acta. 2006;363:147-156.  [PubMed]  [DOI]

25.	Bustin SA, Mueller R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 2005;109:365-379.  [PubMed]  [DOI]

26.	Kahn HJ, Yang LY, Blondal J, Lickley L, Holloway C, Hanna W, Narod S, McCready DR, Seth A, Marks A. RT-PCR amplification of CK19 mRNA in the blood of breast cancer patients: correlation with established prognostic parameters. Breast Cancer Res Treat. 2000;60:143-151.  [PubMed]  [DOI]

27.

Vendittelli F, Santonocito C, Paradisi A, Romitelli F, Concolino P, Silveri SL, Sisto T, Capizzi R, Catricalà C, Mulè A. A new standardized absolute quantitative RT-PCR method for detection of tyrosinase mRNAs in melanoma patients: technical and operative instructions. Clin Chim Acta. 2009;409:100-105.  [PubMed]  [DOI]

28.	Hoshino M, Ogose A, Kawashima H, Izumi T, Hotta T, Hatano H, Morita T, Otsuka H, Umezu H, Yanoma S. Molecular analyses of cell origin and detection of circulating tumor cells in the peripheral blood in alveolar soft part sarcoma. Cancer Genet Cytogenet. 2009;190:75-80.  [PubMed]  [DOI]

29.	Howard EW, Leung SC, Yuen HF, Chua CW, Lee DT, Chan KW, Wang X, Wong YC. Decreased adhesiveness, resistance to anoikis and suppression of GRP94 are integral to the survival of circulating tumor cells in prostate cancer. Clin Exp Metastasis. 2008;25:497-508.  [PubMed]  [DOI]

30.

Fehm T, Hoffmann O, Aktas B, Becker S, Solomayer EF, Wallwiener D, Kimmig R, Kasimir-Bauer S. Detection and characterization of circulating tumor cells in blood of primary breast cancer patients by RT-PCR and comparison to status of bone marrow disseminated cells. Breast Cancer Res. 2009;11:R59.  [PubMed]  [DOI]

31.	Uen YH, Lin SR, Wu CH, Hsieh JS, Lu CY, Yu FJ, Huang TJ, Wang JY. Clinical significance of MUC1 and c-Met RT-PCR detection of circulating tumor cells in patients with gastric carcinoma. Clin Chim Acta. 2006;367:55-61.  [PubMed]  [DOI]

32.	Uen YH, Lu CY, Tsai HL, Yu FJ, Huang MY, Cheng TL, Lin SR, Wang JY. Persistent presence of postoperative circulating tumor cells is a poor prognostic factor for patients with stage I-III colorectal cancer after curative resection. Ann Surg Oncol. 2008;15:2120-2128.  [PubMed]  [DOI]

33.	Balic M, Dandachi N, Hofmann G, Samonigg H, Loibner H, Obwaller A, van der Kooi A, Tibbe AG, Doyle GV, Terstappen LW. Comparison of two methods for enumerating circulating tumor cells in carcinoma patients. Cytometry B Clin Cytom. 2005;68:25-30.  [PubMed]  [DOI]

34.	Allard WJ, Matera J, Miller MC, Repollet M, Connelly MC, Rao C, Tibbe AG, Uhr JW, Terstappen LW. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin Cancer Res. 2004;10:6897-6904.  [PubMed]  [DOI]

35.	Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S, Bell DW, Irimia D, Ulkus L, Smith MR, Kwak EL, Digumarthy S, Muzikansky A. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 2007;450:1235-1239.  [PubMed]  [DOI]

36.	Sastre J, Maestro ML, Puente J, Veganzones S, Alfonso R, Rafael S, García-Saenz JA, Vidaurreta M, Martín M, Arroyo M. Circulating tumor cells in colorectal cancer: correlation with clinical and pathological variables. Ann Oncol. 2008;19:935-938.  [PubMed]  [DOI]

37.

Ignatiadis M, Xenidis N, Perraki M, Apostolaki S, Politaki E, Kafousi M, Stathopoulos EN, Stathopoulou A, Lianidou E, Chlouverakis G. Different prognostic value of cytokeratin-19 mRNA positive circulating tumor cells according to estrogen receptor and HER2 status in early-stage breast cancer. J Clin Oncol. 2007;25:5194-5202.  [PubMed]  [DOI]

38.	Xenidis N, Ignatiadis M, Apostolaki S, Perraki M, Kalbakis K, Agelaki S, Stathopoulos EN, Chlouverakis G, Lianidou E, Kakolyris S. Cytokeratin-19 mRNA-positive circulating tumor cells after adjuvant chemotherapy in patients with early breast cancer. J Clin Oncol. 2009;27:2177-2184.  [PubMed]  [DOI]

39.

Ignatiadis M, Kallergi G, Ntoulia M, Perraki M, Apostolaki S, Kafousi M, Chlouverakis G, Stathopoulos E, Lianidou E, Georgoulias V. Prognostic value of the molecular detection of circulating tumor cells using a multimarker reverse transcription-PCR assay for cytokeratin 19, mammaglobin A, and HER2 in early breast cancer. Clin Cancer Res. 2008;14:2593-2600.  [PubMed]  [DOI]

40.	Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, Miller MC, Reuben JM, Doyle GV, Allard WJ, Terstappen LW. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 2004;351:781-791.  [PubMed]  [DOI]

41.

Hayes DF, Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Miller MC, Matera J, Allard WJ, Doyle GV, Terstappen LW. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin Cancer Res. 2006;12:4218-4224.  [PubMed]  [DOI]

42.

Ennis RD, Katz AE, de Vries GM, Heitjan DF, O'Toole KM, Rubin M, Buttyan R, Benson MC, Schiff PB. Detection of circulating prostate carcinoma cells via an enhanced reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay in patients with early stage prostate carcinoma. Independence from other pretreatment characteristics. Cancer. 1997;79:2402-2408.  [PubMed]  [DOI]

43.	de Bono JS, Scher HI, Montgomery RB, Parker C, Miller MC, Tissing H, Doyle GV, Terstappen LW, Pienta KJ, Raghavan D. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 2008;14:6302-6309.  [PubMed]  [DOI]

44.	Kurihara T, Itoi T, Sofuni A, Itokawa F, Tsuchiya T, Tsuji S, Ishii K, Ikeuchi N, Tsuchida A, Kasuya K. Detection of circulating tumor cells in patients with pancreatic cancer: a preliminary result. J Hepatobiliary Pancreat Surg. 2008;15:189-195.  [PubMed]  [DOI]

45.	Mimori K, Fukagawa T, Kosaka Y, Kita Y, Ishikawa K, Etoh T, Iinuma H, Sasako M, Mori M. Hematogenous metastasis in gastric cancer requires isolated tumor cells and expression of vascular endothelial growth factor receptor-1. Clin Cancer Res. 2008;14:2609-2616.  [PubMed]  [DOI]

46.

Szatanek R, Drabik G, Baran J, Kolodziejczyk P, Kulig J, Stachura J, Zembala M. Detection of isolated tumour cells in the blood and bone marrow of patients with gastric cancer by combined sorting, isolation and determination of MAGE-1, -2 mRNA expression. Oncol Rep. 2008;19:1055-1060.  [PubMed]  [DOI]

47.	Beecken WD, Engl T, Engels K, Blumenberg C, Oppermann E, Camphausen K, Shing Y, Reinecke G, Jonas D, Blaheta R. Clinical relevance of maspin expression in bladder cancer. World J Urol. 2006;24:338-344.  [PubMed]  [DOI]

48.	Nezos A, Pissimisis N, Lembessis P, Sourla A, Dimopoulos P, Dimopoulos T, Tzelepis K, Koutsilieris M. Detection of circulating tumor cells in bladder cancer patients. Cancer Treat Rev. 2009;35:272-279.  [PubMed]  [DOI]

49.	Woenckhaus M, Bubendorf L, Dalquen P, Foerster J, Blaszyk H, Mirlacher M, Soler M, Dietmaier W, Sauter G, Hartmann A. Nuclear and cytoplasmic Maspin expression in primary non-small cell lung cancer. J Clin Pathol. 2007;60:483-486.  [PubMed]  [DOI]

50.	Wu C, Hao H, Li L, Zhou X, Guo Z, Zhang L, Zhang X, Zhong W, Guo H, Bremner RM. Preliminary investigation of the clinical significance of detecting circulating tumor cells enriched from lung cancer patients. J Thorac Oncol. 2009;4:30-36.  [PubMed]  [DOI]

51.	Bevilacqua S, Gallo M, Franco R, Rossi A, De Luca A, Rocco G, Botti G, Gridelli C, Normanno N. A "live" biopsy in a small-cell lung cancer patient by detection of circulating tumor cells. Lung Cancer. 2009;65:123-125.  [PubMed]  [DOI]