临床研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-04-08; 18(10): 1004-1009
在线出版日期: 2010-04-08. doi: 10.11569/wcjd.v18.i10.1004
Kiss-1在食管鳞状细胞癌组织中的表达及临床病理意义
赵志华, 陈妍琼, 高冬玲, 张岚, 张蕾
赵志华, 高冬玲, 张岚, 郑州大学第一附属医院病理科 河南省肿瘤病理重点实验室 河南省郑州市 450052
陈妍琼, 张蕾, 郑州大学第一附属医院肿瘤科 河南省郑州市 450052
赵志华, 在读博士, 主治医师, 主要从事肿瘤病理研究.
基金项目: 河南省高校杰出科研人才创新工程基金资助项目, No. 2007 KYCX005.
作者贡献分布: 此课题由张蕾指导; 赵志华与陈妍琼设计; 研究过程由赵志华、陈妍琼、高冬玲及张岚操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由张蕾提供; 数据分析由赵志华完成; 本论文写作由赵志华与陈妍琼完成.
通讯作者: 张蕾, 副教授, 450052, 河南省郑州市, 郑州大学第一附属医院肿瘤科. zhanglei68616@yahoo.com.cn
电话: 0371-66658175 传真: 0371-66658175
收稿日期: 2009-12-26
修回日期: 2010-02-20
接受日期: 2010-03-02
在线出版日期: 2010-04-08

目的: 观察Kiss-1蛋白及mRNA在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床病理意义.

方法: 采用免疫组织化学SP法、原位杂交和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术, 联合检测了62例食管鳞状细胞癌、31例癌旁不典型增生及62例正常食管组织中Kiss-1蛋白和mRNA的表达, 并探讨其临床病理意义.

结果: 在食管鳞状细胞癌组织、癌旁不典型增生及正常食管组织中, Kiss-1蛋白的阳性表达率分别为56.5%、67.7%、90.3%(P<0.05); 用原位杂交检测Kiss-1 mRNA阳性表达率分别为51.6%、74.2%、95.2%(P<0.05); 用RT-PCR技术检测Kiss-1 mRNA阳性表达率分别为54.8%、71.0%、88.7%(P<0.05); 食管鳞状细胞癌组织中Kiss-1蛋白及mRNA的低表达与淋巴结转移密切相关(P<0.05), 而与患者的性别、年龄、肿瘤的组织学分级无关(P>0.05); Kiss-1蛋白的低表达与浸润深度有关(P<0.05); 在食管鳞状细胞癌组织中, Kiss-1蛋白及mRNA的表达呈正相关(P<0.05), 用原位杂交及RT-PCR技术对Kiss-1 mRNA表达情况的检测结果也呈正相关(P<0.05).

结论: Kiss-1基因的表达降低或缺失和食管鳞状细胞癌的发生发展及转移有关, 有望成为食管鳞状细胞癌早期诊断和预后判断的重要指标之一.

关键词: 食管肿瘤; 鳞状细胞癌; Kiss-1
引文著录: 赵志华, 陈妍琼, 高冬玲, 张岚, 张蕾. Kiss-1在食管鳞状细胞癌组织中的表达及临床病理意义. 世界华人消化杂志 2010; 18(10): 1004-1009
Clinicopathological significance of Kiss-1 expression in esophageal squamous cell carcinoma
Zhi-Hua Zhao, Yan-Qiong Chen, Dong-Ling Gao, Lan Zhang, Lei Zhang
Zhi-Hua Zhao, Dong-Ling Gao, Lan Zhang, Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Henan Key Laboratory for Tumor Pathology, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Yan-Qiong Chen, Lei Zhang, Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by: the Henan Provincial Innovation Research Foundation for Talents in Colleges and Universities, No. 2007KYCX005.
Correspondence to: Associate Professor Lei Zhang, Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China. zhanglei68616@yahoo.com.cn
Received: December 26, 2009
Revised: February 20, 2010
Accepted: March 2, 2010
Published online: April 8, 2010

AIM: To investigate the expression of Kiss-1 mRNA and protein in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and to analyze its clinicopathological significance.

METHODS: Sixty-two ESCC specimens, 31 atypical hyperplastic epithelial specimens, and 62 normal esophageal epithelial specimens were used in the study. The expression of Kiss-1 mRNA in these specimens was detected by in situ hybridization and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The expression of Kiss-1 was detected by immunohistochemistry using the streptavidin-peroxidase method. The clinicopathological significance of Kiss-1 expression in ESCC was then analyzed.

RESULTS: The positive rates of Kiss-1 protein expression in ESCC, adjacent atypical hyperplastic epithelium and normal esophageal epithelium tissues were 56.5%, 67.7%, 90.3%, respectively (all P < 0.05). The positive rates of Kiss-1 mRNA expression in ESCC, adjacent atypical hyperplastic epithelium and normal esophageal epithelium tissues were 51.6%, 74.2% and 95.2%, respectively, as revealed by in situ hybridization (all P < 0.05), and 54.8%, 71.0% and 88.7%, respectively, by RT-PCR (all P < 0.05). The positive rates of Kiss-1 protein and mRNA expression in ESCC were closely associated with lymph node metastasis (both P < 0.05), but not with sex, age, histological grade and infiltration depth (all P > 0.05). A positive correlation was noted not only between the positive rates revealed by in situ hybridization and RT-PCR (P < 0.05), but also between those revealed by immunohistochemistry and RT-PCR or in situ hybridization (both P < 0.05).

CONCLUSION: The low expression of Kiss-1 is closely associated with the development, progression and metastasis of ESCC. Kiss-1 may be used as an important parameter for early diagnosis and prognosis of ESCC.

Key Words: Esophageal neoplasm; Squamous cell carcinoma; Kiss-1
0 引言

Kiss-1是由Lee等在人黑色素瘤中发现的一个新的肿瘤转移抑制基因[1]. 研究表明, Kiss-1在多种恶性肿瘤组织中的表达降低或缺失与肿瘤的侵袭转移密切相关[2-10]. 本研究采用免疫组织化学、原位杂交和RT-PCR技术联合检测了Kiss-1蛋白及mRNA在食管鳞状细胞癌组织中的表达, 并探讨其阳性表达在食管鳞状细胞癌发生发展中的临床病理意义, 以期寻找食管鳞状细胞癌早期诊断和预后判断的指标.

1 材料和方法
1.1 材料

62例食管癌手术切除标本于2006-02- 26/03-16取自食管癌高发区河南省安阳市肿瘤医院, 所有患者术前均无化疗、放疗及免疫治疗史. 其中男36例, 女26例, 年龄38-75(平均60.6±9.5)岁. 全部病理组织学证实均为鳞状细胞癌. 其中组织学分级Ⅰ级15例, Ⅱ级25例, Ⅲ级22例; 伴淋巴结转移者20例, 无淋巴结转移者42例. 7例(浅层组)肿瘤浸润黏膜层、黏膜下层或浅肌层, 55例(深层组)肿瘤浸润深肌层或外膜层. 标本在离体0.5 h内, 在癌灶、癌旁3 cm以内及远端正常食管黏膜组织分别取材, 将部分组织放在冻存管中置于-80 ℃冰箱中备用于RT-PCR的检测. 剩余组织经40 g/L甲醛固定, 常规脱水, 石蜡包埋切片, 分别用于HE、免疫组织化学和原位杂交染色. 62例癌旁组织经病理学证实, 将其中31例中-重度不典型增生组织作为本文的对照观察对象. 羊抗人Kiss-1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司, 免疫组织化学SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自由北京中杉金桥生物技术开发公司. TRIzol试剂购自Qiagen公司, 一步法RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司. 原位杂交预杂交液购自武汉博士德生物技术有限公司. 乙酰化BSA及BCIP/NBT均购自美国Sigma公司. 原位杂交5'端生物素标记、全硫代修饰探针、Kiss-1探针、引物和内参β-actin上下游引物序列均由北京奥科生物技术有限公司合成. Kiss-1探针序列为GCCTGGCAGTAGCAGCTGGCTTCCT; Kiss-1上游引物序列5'-AGAG GAAGCCAGCTGCTACTG-3', 下游引物序列为5'-GCCGAAGGAGTTCCAGTTGTA-3', 预期扩增片段大小为191 bp. 内参β-actin上游序列为5'-CATCCTGCGTCTGCACCT-3', 下游序列为5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3', 预期扩增片段大小为480 bp.

1.2 方法

1.2.1 Kiss-1蛋白及mRNA的水平检测: Kiss-1蛋白的表达采用免疫组织化学SP法进行检测; Kiss-1单克隆抗体按1:100稀释. 染色步骤严格按说明书进行, DAB显色, 苏木素复染. 采用试剂盒中已知阳性结果为阳性对照, 以PBS代替一抗作为阴性对照. 采用原位杂交和RT-PCR分别检测各组标本中Kiss-1 mRNA的水平. 具体方法步骤参照文献[11-13].

1.2.2 结果判定: Kiss-1蛋白阳性信号为棕黄色颗粒, 原位杂交Kiss-1 mRNA阳性信号呈蓝色颗粒, 二者均定位于细胞质中. 每例标本在高倍镜下随机选取5个高倍视野(每个视野观察细胞数不少于200个), 按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行综合判定. 免疫组织化学评分标准[13]: 按切片中阳性细胞着色深浅评分, 0分, 细胞无着色; 1分, 浅黄色; 2分, 棕黄色; 3分, 棕褐色. 按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评比, <30%为1分, 30%-70%为2分, ≥70%为3分. 2项评分的乘积为总积分, 0-1分判为阴性, ≥2分为阳性. 原位杂交阳性计算方法[13]: 阳性细胞数≤10%、10%-30%、31%-70%和>70%分别记为1、2、3和4分. 按阳性着色程度: 杂交信号强度可分为弱(+)、中(++)、强(+++)三级, 分别计为1、2、3分: 弱阳性(+), 细胞质内可见浅紫蓝色颗粒, 明显高于背景底色; 阳性(++), 细胞质内可见较深紫蓝色颗粒; 强阳性(+++), 细胞质内可见大量深紫蓝色颗粒. 上述两种记分相乘, <1分为阴性, ≥1分为阳性.

统计学处理 应用SPSS11.0统计学软件, 采用χ2检验. 检验水准α = 0.05.

2 结果
2.1 Kiss-1蛋白在不同食管组织中的表达及其与临床生物学行为关系

免疫组织化学结果显示Kiss-1蛋白阳性表达为棕黄色颗粒, 定位于细胞质中(图1). 在食管鳞状细胞癌组织、癌旁不典型增生及正常食管组织中, Kiss-1蛋白的阳性表达率分别为56.5%、67.7%、90.3%(P<0.05); Kiss-1蛋白的低表达与浸润深度、淋巴结转移密切相关(均P<0.05, 表1, 2).

表1 不同食管组织中Kiss-1蛋白及mRNA的表达.
分组nKiss-1蛋白阳性率(%)χ2值Kiss-1 Mrna
RT-PCR阳性率(%)χ2值原位杂交阳性率(%)χ2值
正常黏膜组织6290.388.795.2
癌旁组织3167.718.136a71.017.503a74.230.227a
癌组织6256.554.851.6
aP<0.05.
图1
图1 Kiss-1蛋白的表达(IHC×400). A: 正常食管黏膜上皮组织; B: 癌旁不典型增生组织; C: 鳞状细胞癌组织.
表2 食管鳞状细胞癌组织中Kiss-1蛋白及mRNA的表达与临床病理学参数的关系.
临床病理学参数nKiss-1蛋白阳性率(%)χ2值P值Kiss-1 Mrna
RT-PCR阳性率(%)χ2值P值原位杂交阳性率(%)χ2值P值
性别
男3652.80.4710.39250.00.8120.36844.41.7660.184
女2661.561.561.5
年龄(岁)
<602958.61.1040.60351.70.2130.64451.70.0000.987
≥603354.557.651.5
组织学分级
Ⅰ1566.746.760.0
Ⅱ2556.01.0110.60368.02.5750.27652.00.7580.685
Ⅲ2250.045.445.4
浸润深度
浅层7100.071.471.4
深层5550.9-0.01564.41.131 0.71849.11.2410.265
淋巴结转移
无4266.75.5260.01964.34.6920.03061.95.5220.019
有2035.035.030.0
2.2 原位杂交检测Kiss-1 mRNA在不同食管组织中的表达及其与临床生物学行为关系

结果显示阳性表达主要位于细胞质内, 呈蓝色颗粒(图2). 在食管癌组织、癌旁不典型增生及正常食管组织中, Kiss-1 mRNA阳性表达率分别为51.6%、74.2%、95.2%(P<0.05); Kiss-1 mRNA低表达与淋巴结转移密切相关(均P<0.05, 表1, 2).

图2
图2 Kiss-1 mRNA的表达(ISH×400). A: 正常食管黏膜上皮组织; B: 癌旁不典型增生组织; C: 鳞状细胞癌组织.
2.3 RT-PCR检测Kiss-1 mRNA在不同食管组织中的表达及其与临床生物学行为关系

扩增结果经凝胶电泳显示, Kiss-1 mRNA RT-PCR扩增产物与预计一致, 在191 bp处出现特异性的Kiss-1基因条带, 在480 bp处也有内参照β-actin条带(图3). 在正常食管组织、癌旁不典型增生及食管鳞状细胞癌组织中, Kiss-1 mRNA阳性表达率依次降低(P<0.05, 表1). 由表2可知食管鳞状细胞癌组织中Kiss-1 mRNA的低表达与淋巴结转移密切相关(P<0.05), 而与患者的性别、年龄、肿瘤的组织学分级无关(P>0.05).

图3
图3 正常食管黏膜和鳞状细胞癌组织中Kiss-1 mRNA表达的RT-PCR电泳图. M: DNA Marker; 1: 正常食管黏膜组织; 2: 食管癌旁不典型增生组织; 3: 食管鳞状细胞癌组织弱表达; 4: 食管鳞状细胞癌组织阴性表达组织.
2.4 Kiss-1蛋白、mRNA在食管鳞状细胞癌组织中表达的相关性分析

在食管鳞状细胞癌组织中, Kiss-1蛋白及mRNA的表达呈正相关, 分别用原位杂交及RT-PCR技术对Kiss-1 mRNA表达情况的检测结果也呈正相关(均P<0.05, 表3, 4).

表3 食管鳞状细胞癌组织中两种方法检测Kiss-1 mRNA表达的相关性.
原位杂交检测nRT-PCR检测
rsP值
+-
+322660.5480.000
-30822
表4 食管鳞状细胞癌组织中Kiss-1蛋白、mRNA表达的相关性.
Kiss-1 mRNA表达nKiss-1蛋白表达
rsP值
+-
原位杂交法
+322480.3860.002
-301119
RT-PCR法
+342770.5100.000
-28820
3 讨论

肿瘤的侵袭转移是一个众多因素参与的复杂过程, 其中癌基因的激活和抑癌基因的失活在病程的发展和演进过程中起着重要作用. Kiss-l基因是近年来发现的一个新的肿瘤转移抑制基因, 他定位于人染色体1q32, 由4个外显子组成. 其编码产物主要是G糖蛋白受体54(hGPR54或AXOR12)的天然配体[14-19], 他可以抑制细胞的趋化性, 增强成簇黏附激酶的表达和活性. Lee等[20]研究发现Kiss-l基因的表达水平虽然不影响成瘤性但能抑制95%的肿瘤转移, 说明其具有显著的肿瘤转移抑制效应. 随后Shirasaki等的研究报道给予了补充证实[21-23]. 一系列深入研究发现Kiss-l基因及其受体的表达异常还与胃癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌等[24-28]多种肿瘤侵袭转移密切相关, 但其抑制肿瘤转移的具体的分子作用机制尚不完全清楚. 如何通过调控Kiss-l基因及其受体的表达, 进而阻止肿瘤转移值得我们进一步的研究. 而有关Kiss-l基因与人食管鳞状细胞癌的发生及其侵袭和转移的关系报道较少[29]. 采用免疫组织化学, 原位杂交及RT-PCR技术联合检测食管鳞状细胞癌组织中Kiss-1蛋白及mRNA表达的研究, 迄今尚未见文献报道.

本研究结果显示食管鳞状细胞癌组织中Kiss-1蛋白及mRNA的阳性表达均低于正常食管黏膜和癌旁不典型增生组织, 提示Kiss-1在癌组织的低表达可能在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中起一定作用. 肿瘤细胞的浸润和侵袭能力是造成其转移扩散的主要原因, 本研究结果还显示, Kiss-1蛋白及mRNA的阳性表达在无淋巴结转移组明显高于淋巴结转移组, 表明Kiss-1蛋白及mRNA的表达减低或缺失可能与食管鳞状细胞癌的淋巴结转移有关; 但与食管鳞状细胞癌的组织学分级及患者的年龄性别等因素无关, Kiss-1蛋白的低表达与食管鳞状细胞癌的浸润深度有关, 这与Ikeguchi等[30]、Li等[31]的实验结果一致, 李小丽等[32]报道Kiss-1蛋白表达随浸润深度的加深而减少, 但统计学无显著差异, 此可能与标本数量有关. 免疫组织化学检测Kiss-1蛋白、原位杂交和RT-PCR检测Kiss-1 mRNA的表达呈正相关关系, 提示这三种检测方法具有一致性. 这些结果均表明Kiss-1蛋白及mRNA的表达减低或者缺失可能促进了食管鳞状细胞癌细胞脱离原发灶, 发生转移. 进一步分析实验结果, 我们发现Kiss-1 mRNA在食管癌中表达率较Kiss-1蛋白表达略低, 这可能与实验过程中的mRNA被部分降解有关, 而Kiss-1 mRNA与蛋白表达一致性提示应用免疫组织化学法检测食管鳞状细胞癌组织中Kiss-1蛋白表达水平可能可以间接反映出Kiss-1 的mRNA水平.

总之, Kiss-l基因的表达减低或者缺失与食管鳞状细胞癌的发生发展及浸润转移有关, Kiss-l有望成为食管鳞状细胞癌早期诊断和预后判断的辅助指标.

评论
背景资料

Kiss-1是由Lee等在人黑色素瘤中发现的一个新的肿瘤转移抑制基因. 研究表明, Kiss-1在多种恶性肿瘤组织中的表达降低或缺失与肿瘤的侵袭转移密切相关, 本研究对其在不同食管组织中蛋白和mRNA表达水平的检测有助于研究Kiss-1基因与食管鳞状细胞癌发生、发展中的关系.

同行评议者

沈克平, 主任医师, 上海龙华医院肿瘤五科

相关报道

国内外学者采用RT-PCR、原位杂交及免疫组织化学等技术分别检测了Kiss-1基因在胃癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等肿瘤中的表达, 发现其与多种肿瘤发生、发展有关.

创新盘点

本研究首次采用RT-PCR、原位杂交及免疫组织化学技术检测不同食管组织Kiss-1基因的表达情况及其转录终产物的阳性信号定位, 探讨Kiss-1基因在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用.

应用要点

Kiss-l基因的表达减低或者缺失与食管鳞状细胞癌的发生发展及浸润转移有关, Kiss-l有望成为食管鳞状细胞癌早期诊断和预后判断的辅助指标.

同行评价

本研究设计合理, 结果可靠, 但创新性一般.

编辑:李军亮 电编:何基才

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