修回日期: 2009-12-05
接受日期: 2009-12-07
在线出版日期: 2010-01-08
目的: 观察白芍总甙(TGP)对实验性结肠炎干预的治疗效果, 探讨TGP对实验性结肠炎的抗炎作用.
方法: 40只SD大鼠以三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌肠诱导结肠炎模型, 均分为结肠炎模型组、正常对照组(0.9% NaCl溶液灌肠)、TGP组(100 mg/kg)和5-ASA药物对照组(100 mg/kg). 连续灌胃14 d后行结肠大体损伤指数(CMDI)和组织学损伤指数(TDI)评分, ELISA检测血清IL-6、IL-17及IL-23水平, 免疫组织化学SP法检测结肠组织TGF-β1与Foxp3的表达.
结果: 与结肠炎模型组相比, 正常组CMDI、TDI, 血清IL-6, IL-17及IL-23含量明显低, 结肠组织TGF-β1和Foxp3含量明显高. 5-ASA与TGP能显著降低CMDI和TDI(2.78分±2.11分, 3.56分±1.94分 vs 6.88分±0.84分, 均P<0.05; 2.22分±0.83分, 2.44分±1.51分 vs 5.63分±0.74分, 均P<0.05), 降低血清IL-6, IL-17和IL-23含量(5-ASA: t = 5.998, 2.438, 2.670, 均P<0.05; TGP: t = 5.203, 3.013, 2.962, 均P<0.05), 升高结肠组织中TGF-β1和Foxp3(5-ASA: t = 6.026, 3.022, 均P<0.05; TGP: t = 6.198, 2.734, 均P<0.05). TGP组与5-ASA组无明显统计学差异.
结论: TGP可能通过上调TGF-β1和Foxp3水平, 促进Treg细胞的表达, 抑制Th17细胞群的活化, 下调IL-6, IL-17和IL-23的表达, 减轻TNBS诱导的大鼠实验性结肠炎的症状和结肠炎性损伤.
引文著录: 王佐, 吴正祥, 杨九华, 杨枫, 吴强. 白芍总甙对大鼠实验性结肠炎Th17细胞相关因子的作用. 世界华人消化杂志 2010; 18(1): 84-88
Revised: December 5, 2009
Accepted: December 7, 2009
Published online: January 8, 2010
AIM: To investigate the effects of total glucosides of paeony (TGP) on experimental colitis in rats and explore potential mechanisms involved.
METHODS: Colitis was induced in 40 rats by rectal administration of trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) dissolved in ethanol. The model rats were divided into three groups (n = 10): model control group (undergoing no treatment), TGP treatment group (treated with 100 mg/kg TGP), and olsalazine treatment group (treated with 100 mg/kg olsalazine). A normal control group was composed of 10 normal rats receiving 0.9% NaCl solution. After 2-week intervention, the colonic macroscopic damage index (CMDI) and tissue damage index (TDI) were evaluated, the serum levels of interleukin-6 (IL-6), IL-17 and IL-23 were determined by enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA), and the colonic expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and forkhead box P3 (Foxp3) was determined by immunohistochemistry.
RESULTS: Compared with the model control group, the CMDI and TDI decreased significantly (2.78 ± 2.11 and 3.56 ± 1.94 vs 6.88 ± 0.84, and 2.22 ± 0.83 and 2.44 ± 1.51 vs 5.63 ± 0.74, respectively; all P < 0.05), the serum levels of IL-6, IL-17 and IL-23 also declined significantly (5-ASA: t = 5.998, 2.438 and 2.670, respectively, all P < 0.05; TGP: t = 5.203, 3.013 and 2.962, respectively, all P < 0.05), and the colonic expression levels of TGF-β1 and Foxp3 increased significantly (5-ASA: t = 6.026 and 3.022, respectively, both P < 0.05; TGP: t = 6.198 and 2.734, respectively, both P < 0.05) in the TGP treatment group and the olsalazine treatment group. No significant differences were found in the above parameters between the TGP treatment group and the olsalazine treatment group.
CONCLUSION: TGP can attenuate the symptoms and colonic inflammatory damage in TNBS-induced experimental colitis in rats possibly via a mechanism associated with inhibition of Th17 cell activation, downregulation of IL-6, IL-17 and IL-23, and upregulation of TGF-β1 and Foxp3.
- Citation: Wang Z, Wu ZX, Yang JH, Yang F, Wu Q. Total glucosides of paeony mitigate trinitrobenzene sulfonic acid-induced experimental colitis in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 18(1): 84-88
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v18/i1/84.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v18.i1.84
炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一类病因未明的肠道非特异性炎症, 具有慢性和消耗性的特征, 该病与肠道黏膜免疫系统密切相关. 感染、饮食等环境因素作用于具有遗传易感性的人群, 使肠道黏膜免疫调节失衡, 肠道免疫反应亢进引起黏膜损伤. 以往认为, 克罗恩病(Crohn's disease, CD)是Th1细胞介导的疾病, 而溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是Th2细胞介导的炎症. 近年随着白介素-17(interleukin 17, IL-17)、白介素-23(interleukin 23, IL-23)等细胞因子及Th17细胞亚群在IBD中作用的阐述, 在IBD的发生发展中, IL-17/IL-23轴起了重要作用[1]. 白芍总甙(total glucosides of paeony, TGP)是从中药芍药中提取的有效成分, 具有免疫调节和抑制炎症功能[2]. TGP已成功地应用于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病的治疗, 显示出良好的治疗效果. 其在IBD中的应用还是新的尝试. 本实验在建立2, 4, 6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acide, TNBS)诱导的大鼠实验性结肠炎基础上, 用TGP和5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic, 5-ASA)干预, 检测结肠组织中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和叉头样转录因子-3(forkhead box P3, Foxp3)的含量, 外周血中促炎因子IL-23、IL-17及IL-6的含量, 以期了解TNBS诱导的实验性肠炎中, 与Th17细胞亚群分化和功能维持相关的IL-6、TGF-β1、IL-23及IL-17等细胞因子, 及抑制Th17细胞功能的Treg细胞关键转录因子Foxp3含量的变化, 阐述前述药物在IBD治疗中的机制.
SPF级, ♂, SD大鼠40只(安徽医科大学动物实验中心), 体质量180-220 g; TGP胶囊(商品名: 帕夫林胶囊, 规格: 每粒300 mg, 宁波立华制药有限公司研制生产, 生产批号: 081101); 5-ASA(奥沙拉嗪颗粒, 商品名: 帕斯坦, 浙江众益药业有限公司, 规格: 每粒0.25 g, 批号: 080811); TNBS, Sigma公司; Foxp3抗体和TGF-β1抗体, 北京博奥森生物技术有限公司; DAB显色剂, 北京中山生物技术有限公司; 大鼠IL-6、IL-17和IL-23 ELISA试剂盒, 上海西唐生物科技有限公司.
1.2.1 实验设计与分组: 大鼠随机均分为正常对照组, 模型组, TGP组及5-ASA组. 采用TNBS/乙醇法构建结肠炎大鼠模型, 大鼠适应性饲养1 wk, 禁食不禁水24 h, 100 g/L水合氯醛3 mL/kg ip, 麻醉后, 倒悬位, 将直径约2 mm聚乙烯管缓慢插入直肠约8 cm, 造模组灌入TNBS原液100 mg/kg+500 mL/L乙醇, 0.25 mL[3]; 正常组灌入同体积生理盐水. 造模24 h后开始ig, 5-ASA和TGP溶解于生理盐水, 浓度为10 g/L, 正常组与模型组给予生理盐水2 mL每只ig, C组100 mg/(kg•d) 5-ASA ig, T组100 mg/(kg•d) TGP ig, 每天1次, 连续给药14 d.
1.2.2 标本采集: 大鼠禁食不禁水24 h, 腹腔注射100 g/L水合氯醛3 mL/kg, 麻醉后, 剖腹暴露腹主动脉, 负压管采取血液, 2000 r/min, 离心5 min后, 取血清, -75 ℃保存, 待检. 游离结肠组织, 沿肠系膜纵轴剖开, 冰生理盐水清洗, 取病变最明显处组织2 cm放于40 g/L多聚甲醛液中固定, 石蜡包埋备用.
1.2.3 检验方法: ELISA法检测大鼠血清IL-6、IL-17及IL-23的含量, 按使用说明书进行. 采用免疫组织化学SP法检测大鼠结肠组织中TGF-β1与Foxp3的表达, 按说明书操作. PBS代替一抗, 作为阴性对照.
1.2.4 指标评分: (1)结肠大体形态损伤指数(colon macroscopic damage index, CMDI)[4]观察结肠充血水肿、溃疡等变化. 无损伤, 0分; 局部充血无溃疡, 1分; 线性溃疡无显著炎症, 2分; 在一个位置线性溃疡并有炎症, 3分; 有2个或以上位置有溃疡和/或炎症, 4分; 延结肠长轴有2个或以上位置有溃疡和炎症, 5分; 长度大于1 cm, 6-8分, 溃疡超过2 cm, 6-10分; (2)组织学损伤指数(tissues damage index, TDI)[5]石蜡切片HE染色, 观察溃疡、炎性细胞浸润等变化; (3)免疫组织化学评分: 用显微照相机将免疫组织化学玻片在同样的工作条件下一次拍摄所有照片, 保存为TIFF格式, 用Image-pro plus(IPP)6.0图像分析软件, 采用积分吸光度(integrated absorbance, IA)对所拍照片阳性部位进行图像分析, 收集图像数据.
统计学处理 数据以mean±SD表示, 运用SPSS17.0统计分析软件, 采用单因素方差分析及t检验, 以P<0.05为有统计学意义.
(1)正常组黏膜皱襞纹理清晰, 无糜烂和溃疡等表现. 与正常组比较, 模型组(t = 16.116, P<0.01)肠管增粗, 肠壁增厚, 与外周组织粘连, 黏膜充血水肿明显, 糜烂及溃疡形成. 与模型组比较, 5-ASA组和TGP组均有不同程度的改善(t = 5.136, 4.466, 均P<0.01), 肠管增粗与肠壁增厚较模型组明显改善, 与外周组织粘连少, 黏膜充血水肿减轻, 糜烂及溃疡形成不明显. 5-ASA组与TGP组表现无显著差异性(t = 0.814, P = 0.428); (2)镜下见正常组结肠黏膜上皮完整, 细胞形态正常, 固有层腺体排列规则, 含丰富的杯状细胞, 黏膜分泌正常, 固有层有少量淋巴细胞表达, 黏膜下层、肌层、浆膜层结构清晰. 模型组黏膜上皮坏死脱落, 黏膜及黏膜下层有大量中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞及嗜酸性粒细胞浸润, 腺体破坏且结构紊乱, 杯状细胞少, 隐窝脓肿形成, 可见范围较广的溃疡, 并深入到固有层, 与正常组比较有显著差异性(t = 16.990, P<0.01). 5-ASA组和TGP组均有不同程度的改善, 黏膜及黏膜下炎症细胞浸润少, 腺体结构改善, 充血水肿减轻, 增生的边缘上皮细胞覆盖溃疡面, 肉芽组织纤维化改变, 与模型组相比较, 表现差异显著性(t = 8.832, 5.393, 均P<0.01). 5-ASA组与TGP组无差异显著性(t = 0.387, P = 0.704, 表1).
与正常组比较, 模型组大鼠血清IL-6、IL-17及IL-23的含量均显著增高(t = 11.29、4.048、3.418, 均P<0.05); 与模型组比较, 5-ASA组与TGP组大鼠上述指标含量含量均明显降低(t = 5.998, 2.438, 2.670; t = 5.203, 3.013, 2.962, 均P<0.05), 两组比较无显著性差异(t = 0.446, 1.451, 1.741, P = 0.662, 0.166, 0.101, 表2).
正常组结肠组织TGF-β1与Foxp3表达明显, 见于结肠黏膜固有层细胞、黏膜下层, TGF-β1以炎性细胞胞质表达为主, Foxp3表达在淋巴细胞的细胞核. 与正常组比较, 模型组结肠组织TGF-β1与Foxp3阳性表达显著降低(t = 6.436, 3.235, 均P<0.05). 5-ASA组与TGP组TGF-β1与Foxp3的表达显著高于模型组(t = 6.026, 3.022; 6.198, 2.734, 均P<0.05), 5-ASA组与TGP组TGF-β1、Foxp3的表达无显著差异性(t = 1.119, 0.883; P = 0.279, 0.390, 表3).
模型组结肠组织中TGF-β1和Foxp3均于血清IL-6、IL-17及IL-23呈负相关(r = -0.936, -0.985, -0.944; -0.871, -0.944, -0.852, 均P<0.05); TGP组结肠组织中TGF-β1和Foxp3与血清IL-6、IL-17和IL-23呈负相关(r = -0.839, -0.869, -0.835; -0.870, -0.884, -0.911, 均P<0.05); 5-ASA组结肠组织中TGF-β1和Foxp3与血清IL-6、IL-17和IL-23呈负相关(r = -0.854, -0.724, -0.954; -0.931, -0.873, -0.740, 均P<0.05).
Th17细胞是新发现的一种以分泌IL-17为特征的CD4+ T辅助细胞亚群[6]. IL-17是一种重要的炎症介质, 介导炎症细胞的局部浸润及组织损伤, 并能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程[7], 在适应性免疫和固有性免疫之间行使作用. IL-6、IL-23及TGF-β1在促进大鼠Th17细胞分化中起重要的作用. IL-6是重要的促炎因子, 多在炎症早期发挥促炎作用[8], 在急性与慢性炎症中均能检测到血清IL-6的水平升高[9]. TGF-β1和IL-6的共同存在是Th17细胞分化启动的必要条件[10]. 当环境中缺乏IL-6时, 单独存在的TGF-β1并不能诱导初始型T细胞向Th17细胞分化, 而是促其向调节性T细胞分化. IL-23是一种重要的促炎因子, 其不能诱导初始T细胞分化为Th17细胞, 但可以促进激活的记忆细胞产生IL-17, 使Th17细胞得以存活和维持功能. IBD患者肠黏膜呈现Th17细胞数量增加[11]. 在UC和CD患者炎症急性期的肠黏膜内有大量Th17细胞的存在. UC患者的Th17细胞主要集中在黏膜固有层, 而CD患者的Th17细胞分布则贯穿黏膜层, 黏膜下层以及肌层, 这与CD与UC的炎症特点是符合的. Th17细胞与疾病的严重程度密切相关: IL-17促进多种炎性细胞因子的分泌, 这些因子提高了局部炎症反应的强度, 从而加重了疾病的严重程度. 正常人类结肠中不能检测到IL-17表达, 而在CD患者的结肠中, 无论病情严重程度, 都能检测到其表达; 但在UC患者中, IL-17表达只有在中度到重度的患者才可检测的, 并且在结肠的表达水平UC患者显著的低于CD患者[12]. 矛盾的是, Annunziato等[13]报道CD患者中T细胞亚群产生的IL-17与IFN-γ在炎性肠道里表达而在外周血中未见表达. 已知细菌是引起IL-23升高最强的免疫原, IL-23是介导肠道慢性炎症的重要因子, 其介导的免疫反应只局限于受累器官, IL-23的升高常出现在末端回肠和结肠, 与全身性的炎症反应无关. IL-23这种局部的高表达可能由于细菌较近端小肠相比更易在此处定植有关[14]. 这可解释为什么在遗传上易感的宿主肠道中, 由细菌性抗原引起的过度肠道黏膜免疫反应可导致IBD[15]. 本研究成功复制出TNBS/乙醇诱导的结肠炎模型, 并发现血清中IL-6、IL-17与IL-23的含量在模型组明显升高, 这与Yen等[1]的发现一致, 而不同于Annunziato等的发现. 而在5-ASA组与TGP组中, 上述细胞因子明显降低. 模型组结肠组织中TGF-β1与Foxp3显著降低, 这与葛相栓等[16]报道一致; 而在5-ASA组与TGP组中明显升高. TGF-β1在结肠炎中的作用存在争议, Daniel等[17]发现, 在正常组和肠炎模型组中, TGF-β1的表达并无显著差异, 但在药物干预后, 其表达呈升高的趋势, 和本研究药物干预后一致, 但戎兰等[18]发现无论是在模型组、正常组还是药物组TGF-β1表达均无差异, 与本实验结果不符. 本研究发现, 与IL-6与IL-17相比, 血清中IL-23在各组的表达浓度均较低, 这是否与Hue等[19]IL-23介导的免疫反应只局限于受累器官, IL-23升高只出现在盲肠和结肠, 而与全身性的炎症反应无关的观点相符合, 仍需进一步探索. 总之, 本研究显示TGP对TNBS诱导的大鼠实验性结肠炎有保护作用. 可能的解释是: 一方面, TGP通过下调IL-6在炎症组织中的表达, 并上调TGF-β1与Foxp3的表达, 从而抑制了Th17细胞的产生和功能化: 已知低浓度的TGF-β1和IL-6协同能诱导Th17细胞的核转录因子RORγt产生, 促进初始T细胞向Th17细胞分化, 而高浓度的TGF-β1能够上调Foxp3的表达, Foxp3也可以通过下调IL-23和IL-17等细胞因子的表达抑制Th17细胞的分化, 故高浓度TGF-β1能促进Treg分化而并不增加Th17细胞分化[20]. 可以推测, TNBS诱导的结肠炎症早期, IL-6即可增多, 低浓度的TGF-β1在IL-6存在的背景下, 使初始T细胞向Th17细胞分化, 在肠道细菌的诱导下, IL-23产生增加, 并在这个过程中维持Th17细胞的功能, 使炎症慢性持续; 另一方面, TGP可能通过其他未知的途径直接抑制IL-6、IL-17及IL-23的促炎作用. 以上两方面中, 前者似占有更为重要的地位. 综合这两方面因素, 当TGP等药物干预后, TGF-β1的浓度升高, IL-6和IL-23的浓度降低, 在环境缺乏IL-6的背景下, 高浓度的TGF-β1促使初始T细胞向Treg细胞分化增加, 而向Th17细胞分化减少, 且IL-23的减少也使Th17细胞无法维持其功能, 导致IL-17分泌减少, 炎症减轻. 同时, Treg细胞可以抑制Th17细胞, IL-6、IL-23及IL-17的活性, 使炎症减轻. 本研究还提示, 在TGP和5-ASA对结肠炎的保护作用中, 尤其是对抗Th17细胞介导的炎症中, IL-6似乎是关键因素, 或炎症早期的其他促炎因子具有重要意义. 是否炎症早期的损伤程度与Th17细胞所致的慢性结肠炎转归相关? IL-6是否为IBD治疗中新的靶位、他与其他因子关系如何? 尚需进一步研究. 虽然TGF-β1在Th17/Treg细胞分化中占有重要的地位, 并能抑制Th17细胞的促炎作用, 但在Th17细胞介导IBD的过程中, 其角色并非恒定, 其所具有的意义, 仍需进一步探讨.
炎症性肠病(IBD)与肠道黏膜免疫系统密切相关. 感染、饮食等环境因素作用于具有遗传易感性的人群, 使肠道黏膜免疫调节失衡, 肠道免疫反应亢进引起黏膜损伤, 是一类病因未明的肠道非特异性炎症, 具有慢性和消耗性的特征. 以往认为, 克罗恩病(CD)是Th1细胞介导的疾病, 而溃疡性结肠炎(UC)是Th2细胞介导的炎症. 目前认为, Th17细胞亚群在IBD的发生发展中, IL-17/IL-23轴起了重要作用. 当前对炎症性肠病的治疗, 中西医均无特效的药物, 但研究证明单味中药对实验性结肠炎的病理生理过程有明显影响.
丁士刚, 主任医师, 北京大学第三医院消化科.
治疗炎症性肠病传统药物包括SASP、糖皮质激素和免疫抑制剂等, 虽然有效, 但存在风险大、效益低、不良反应多和患者依从性差等缺点. 生物制剂如英夫利昔单抗等治疗IBD有效. 但目前主要在临床试验阶段且价格昂贵, 难以推广应用.
葛志东等报道白芍总甙具有浓度和机能依赖性的双向免疫调节作用; Zheng等研究发现, TGP抑制IL-1、PGE2、TNF-α等炎性细胞因子释放; Xu等发现TGP呈浓度依赖性抑制佐剂性关节炎滑膜组织IL-1β介导的IL-6产生. 目前, TGP已成功地应用与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病的治疗, 显示出良好的治疗效果.
本研究在实验性结肠炎的基础上, 应用白芍总甙进行干预, 并与5-ASA作比较, 选取IL-23、IL-17及对Th17细胞亚群和Treg细胞亚群均有调节作用的IL-6、 TGF-β1作为观察指标, 并观察它们对Foxp3的影响, 从免疫学角度评价白芍总甙的疗效, 更具有科学性.
随着对中药在IBD抗炎保护作用的深入研究, 采用单味中药制剂治疗实验性结肠炎, 其抗炎和免疫抑制效果明确. 本研究希望为IBD的治疗提供新的方法和思路, 有可能开辟以中医为主、西医为辅的中西医结合治疗IBD的新途径.
Th17细胞: 一种新发现的以分泌IL-17为特征的CD4+ T辅助细胞亚群. 是一种重要的炎症介质, 介导炎症细胞的局部浸润及组织损伤, 并能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程, 在适应性免疫和固有性免疫之间行使作用.
论文设计合理, 数据可靠, 统计方法准确, 论文对炎症性肠病的致病机制及防治有一定的指导意义.
编辑:李军亮 电编:吴鹏朕
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