大鼠重症急性胰腺炎三磷酸肌醇变化与钙代谢的关系

摘要

目的: 观察重症急性胰腺炎(SAP)时三磷酸肌醇(IP3)变化及其与钙代谢的关系, 以探讨SAP的发病机制. 

方法: 20只SD大鼠随机分为2组: 重症急性胰腺炎模型组(SAP组)和对照组(C组), 每组10只. SAP组以30 g/L牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射建立SAP模型, C组为假手术并注射生理盐水(NS). 两组术后立即、6 h行阴茎背静脉注射NS. 术后18 h处死动物. 观察各组胰腺细胞内IP3和钙(Ca²⁺)、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血清钙(血钙)和淀粉酶(AMY)及胰腺的病理改变.  

结果: SAP组胰腺细胞内IP3、Ca²⁺和TNF-α显著高于C组(252.99±35.72 μg/L vs 57.28±48.66 μg/L, 10.63±2.38 vs 2.50±1.04, 281.66±106.83 ng/L vs 42.27±16.75 ng/L, 均P<0.05), 而SAP组的血钙明显低于C组(2.51±0.11 mmol/L vs 3.04±0.15 mmol/L, P<0.05). 胰腺细胞内IP3与Ca²⁺和TNF-α间呈明显正相关(r = 0.987, 0.937, P<0.05), 上述三者与血钙呈明显负相关(r = -0.997, -0.980, -0.915, 均P<0.05). SAP组AMY和胰腺病理评分分别显著高于C组(5336.1±1937.83 U/L vs 783.5±200.07 U/L, 11.1±0.88 vs 6.4±1.07, 均P<0.05).

结论: SAP存在胰腺细胞内IP3明显升高, IP3是引起细胞内外钙和TNF-α变化的重要原因之一.

关键词: 重症急性胰腺炎; 三磷酸肌醇; 细胞内钙; 血清钙; 肿瘤坏死因子α; 大鼠

Relation of inositol 1, 4, 5- trisphosphate with calcium metabolism in rats with severe acute pancreatitis

Cheng-Xian Shi, Hang Wang

Cheng-Xian Shi, Department of Liver Biliary Pancreatic Surgery, Guizhou Provincial Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China

Hang Wang, Department of Surgery, the Sixth People's Hospital of Chongqing, Chongqing 400000, China

Correspondence to: Cheng-Xian Shi, Department of Liver Biliary Pancreatic Surgery, Guizhou Provincial Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China. chengxianl@yahoo.com.cn

Received: November 22, 2008
Revised: January 21, 2009
Accepted: February 9, 2009
Published online: February 28, 2009

Abstract

AIM: To investigate the relation of inositol 1, 4, 5- trisphosphate (IP3) with calcium metabolism in rats with severe acute pancreatitis (SAP).

METHODS: Twenty Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups: severe acute pancreatitis group (SAP group, n = 10) and control group (group C, n = 10). The SAP model was induced by retrograde injection of 3% sodium taurocholate to the biliary-pancreas duct, while the group C underwent sham operation. After operation, normal sodium (NS) was injected by vena in both groups. Serum amylase (AMY), calcium and tumor necrosis factor α (TNF-α) were examined. Intracellular IP3 and intracellular calcium ion (Ca²⁺) and histological change of pancreas were measured.

RESULTS: The IP3 and Ca²⁺ of pancreas and serum TNF-α in group SAP were significantly higher than those in group C (252.99 ± 35.72 μg/L vs 57.28 ± 48.66 μg/L, 10.63 ± 2.38 vs 2.50 ± 1.04, 281.66 ± 106.83 ng/L vs 42.27 ± 16.75 ng/L, all P < 0.05). Serum calcium was significantly lower in SAP group than in group C (2.51 ± 0.11 mmol/L vs 3.04 ± 0.15 mmol/L, P < 0.05). The IP3 of pancreatic gland was positively correlated with Ca²⁺ and TNF-α (r = 0.987, 0.937, both P < 0.05). The IP3 and Ca2+ of pancreas and serum TNF-α were negatively correlated with the serum calcium in SAP group (r = -0.997, -0.980, -0.915, all P < 0.05). The AMY and pathological scores of pancreatic gland were significantly higher in SAP group than in group C (5336.1 ± 1937.83 U/L vs 783.5 ± 200.07 U/L, 11.1 ± 0.88 vs 6.4 ± 1.07, both P < 0.05).

CONCLUSION: Pancreatic intracellular IP3, which increases with Ca²⁺ and TNF-α, serves as a main factor for inducing calcium changes in severe acute pancreatitis.

Key Words: Severe acute pancreatitis; Inositol 1, 4, 5-trisphosphate; Calcium ion; Serum calcium; Tumor necrosis factor-α; Rat

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是一种临床常见的急腹症. 约25%的AP会发展为重型急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)[1]. SAP发展迅速, 并发症多, 死亡率高[2]. 在SAP的早期和感染期, 由SAP及其感染诱发的细胞因子瀑布样释放导致的重要器官损伤是SAP死亡的主要原因[2-3]. 观察发现, SAP时存在钙超载, 钙超载可激活核因子-κB及相关的炎症因子, 引起胰腺坏死[4-5]. 1, 4, 5三磷酸肌醇(inositol 1, 4, 5-trisphosphate, IP3)是细胞内的第二信使, 对细胞内钙调控起着重要的作用[6]. 然而在SAP时IP3有何变化及与钙代谢的关系, 尚不清楚. 本研究通过建立SAP模型, 观察SAP时胰腺细胞内IP3的变化及其与钙代谢的关系, 以探讨SAP的发病机制.

1 材料和方法

1.1 材料

清洁级健康成年♂SD大鼠20只(购自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心), 体质量为200-250 g, 以标准大鼠颗粒喂养, 室温22℃, 相对湿度85%左右. 牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司. IP3 ELISA试剂盒购自北京尚柏生物有限公司. FLUO-3、AM Ester试剂盒购自北京博雷德生物有限公司. TNF-α ELISA试剂盒购自重庆晶美生物工程有限公司.

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理: 20只大鼠随机分为2组: SAP模型组(SAP组)和对照组(C组), 每组10只. 各组动物于实验前12 h禁食, 自由饮水. 采用乙醚持续吸入麻醉, 按常规无菌方法作上腹正中切口入腹, 参照Aho et al方法并改进复制SAP大鼠模型[7-8]. SAP组在开腹后, 用无创伤血管夹夹闭肝门部胆管, 在相当于胰胆管开口处对侧肠壁无血管区, 用4.5号针穿刺肠壁, 通过肠腔后逆行穿刺入胰胆管内1 cm, 以拇、食指压迫封闭胰胆管远端并固定穿刺针, 推注30 g/L牛磺胆酸钠1 mL/kg, 推注速度为0.2 mL/min, 压力约20 cm H₂O, 术中即可见胰腺从胰管周围开始充血、水肿. 保持压力并防止药液逆流10 min后退出穿刺针, 撤除肝门部血管夹, 以5-0丝线关闭穿刺孔. 复位肠管, 关腹. C组假手术并胰胆管内逆行推注生理盐水(NS)1 mL/kg. 术后两组于立刻、6 h行阴茎背静脉穿刺, 并推注NS 8 mL/kg. 术后所有动物禁食, 自由饮水. 两组动物于术后18 h乙醚麻醉后开腹, 自下腔静脉采血约4 mL, 3000 r/min离心15 min, 各取血清约0.5 mL装入2个EP管, 置于-80℃冰箱内保存待批量检测. 快速切取胰腺组织块, 最大不超过0.5 mm×0.5 mm×0.8 mm³, 其中胰腺组织去除筋膜、血管等结缔组织后, 分装入2个EP管置于-80℃冰箱内保存, 待测IP3等; 余胰腺组织块以10%甲醛溶液固定, 并放入4℃冰箱内保存待批量病理检查. 所有动物均麻醉后放血处死.

1.2.2 观察术后动物一般情况: 如精神状态、活动、反应、进食进饮, 腹腔内大体病理变化等.

1.2.3 检测胰腺组织IP3: 将胰腺组织用电子天平称质量后放入0.01 mol/L、pH7.2-7.4的PBS液(组织重量与PBS体积之比为1∶10), 在冰浴条件下用超声波分解器行超声匀浆, 匀浆液以3000 r/min离心15 min, 收集上清液并参照大鼠IP3 ELISA试剂盒使用说明书测定.

1.2.4 测定胰腺腺泡细胞内钙(Ca²⁺): 参照FLUO-3、AM Ester试剂盒说明书、邓丕兰 et al[9]的方法, 将FLUO-3、AM Ester加入90 mL DMSO, 均分装为12管(暂未使用的放-80℃冰箱内保存), 取一管加入无钙PBS液1.5 mL, 配制成5 mmol/L液备用. 加以少量无钙PBS液, 用机械法剪碎胰腺组织, 用孔径500 mm的尼龙滤膜过滤后, 以无钙PBS 1 mL清洗, 3000 r/min离心10 min, 收集沉积物再洗涤、离心1次, 再将第2次沉积物用适量无钙PBS液稀释调整为单个腺泡细胞数目109/L悬液(用台盼蓝染色检查成活细胞在95%以上), 与荧光剂反应后用流式细胞仪测定.

1.2.5 检测血清TNF-α: 参照大鼠TNF-α ELISA试剂盒使用说明书测定.

1.2.6 测定血清淀粉酶(AMY)和血清钙(血钙): 用全自动生化分析仪测定.

1.2.7 胰腺组织病理学检查: 取相同部位胰腺组织用100 g/L中性甲醛液固定, 石蜡包埋, 连续5 mm切片后行HE染色, 光镜下观察, 参照Kusske 标准[10]进行评分. 统计学处理 数据以mean±SD表示, 用SPSS15.0统计软件处理. 各组样本均数间比较采用t检验. 胰腺组织IP3与Ca²⁺、TNF-α及血钙水平之间进行直线相关分析. P<0.05表示有显著性差异.

2 结果

2.1 一般情况

C组动物复苏后一般情况良好, 活动, 反应敏捷, 可进饮, 无精神萎靡等现象. SAP组动物精神萎靡、蜷曲、不活动、不进饮.

2.2 大鼠胰腺内IP3、Ca²⁺和血清TNF-α的变化

SAP组的胰腺细胞内IP3、Ca²⁺和TNF-α显著高于C组(P<0.05, 表1).

表1 两组大鼠胰腺内IP3、Ca²⁺和TNF-α的变化 (mean±SD).

分组	IP3(μg/L)	Ca2+	TNF-α(ng/L)
SAP	252.99±35.72	10.63±2.38	281.66±106.83
C	57.28±48.66a	2.50±1.04a	42.27±16.75a

^aP<0.05 vs SAP组.

2.3 大鼠血清AMY和血钙的变化

SAP组血清的AMY显著高于C组(5336.1±1937.83 vs 783.5±200.07, P<0.05), 而血钙显著低于C组(2.51±0.11 vs 3.04±0.15, P<0.05).

2.4 大鼠胰腺细胞内IP3与Ca²⁺、TNF-α及血钙的关系

胰腺细胞内IP3与Ca²⁺和血清TNF-α间、Ca²⁺与TNF-α间呈明显正相关(r = 0.987、0.937, 0.976, P<0.05); 而上述三者与血钙呈显著负相关(P<0.05), IP3与血钙间r为-0.997, Ca²⁺和血钙间r为-0.980; TNF-α与血钙间r为-0.915(图1).

图1 两组大鼠胰腺细胞内IP3与Ca²⁺、TNF-α及血钙的关系.

2.5 腹腔和胰腺组织病理改变

C组大鼠的腹腔内无明显腹水, 胃肠无显著扩张, 胰腺及胰周围无明显改变. SAP组大鼠的腹腔内有大量血性腹水, 胃肠显著扩张, 胰腺大片出血、坏死, 大量中性粒细胞浸润和小叶出血, 胰腺表面、大网膜、肠系膜等可见大量皂化斑. 胰腺病理评分SAP组(11.1±0.88)显著高于C组(6.4±1.07, P<0.05).

3 讨论

研究表明, 乙酰胆硷、缩胆囊素等各种刺激因子与胰腺腺泡细胞膜上特异性受体结合, 可活化受体耦联的G蛋白(Gp), 激活磷脂酶C(PLC),进而特异性的催化细胞膜表面的磷脂酰肌醇4, 5-二磷酸(PIP2), 生成IP3. IP3生成后, 从膜上扩散至胞质中并与内质网上的受体(实际上是Ca²⁺通道)结合, 使IP3操纵的钙通道活化、大量开放, 大量Ca²⁺从钙库内迅速释放, 造成胞质内Ca²⁺浓度急剧升高[11]. 胞质内Ca²⁺又可作为细胞内第二信使, 激活钙库膜上的受体, 使钙库排钙, 出现"钙诱发的钙释放"(calcium induced calcium release, CICR)现象[12-13]. 即随着钙库钙的释放, 继而细胞膜上操纵Ca²⁺通道的开放, 引起充电式Ca²⁺内流, 促进细胞外Ca²⁺向细胞内转移[12,14-16]. 因此, IP3是细胞内钙信号相关的第2信使, 其与相应受体结合可以调控细胞内钙释放. AP时存在细胞内钙超载[4], 但是AP时胰腺细胞内IP3有何变化未见报道. 本研究发现, SAP时胰腺细胞内IP3明显高于对照组, 相应地细胞内钙亦显著高于对照组, 呈明显正相关(r = 0.987), 而血钙却明显降低, 表现为负相关(r = -0.997), 由此提示SAP时存在胰腺细胞内IP3的异常升高, 从而导致钙代谢异常, 即细胞内钙释放致细胞内钙上升, 细胞外钙向细胞内转移致细胞外钙下降; SAP时出现的钙超载其重要原因之一可能是细胞内IP3出现异常所致. 较多研究指出, AP发生后, 炎症早期单核巨噬细胞、中性粒细胞和炎症部位产生过量TNF-α, 一方面其可引起胰腺细胞坏死, 另一方面其迅速进入血液循环, 不仅自身激活, 而且促进其他细胞因子的产生, 引起细胞因子级联反应, 导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[17-18]. AP时存在细胞内钙超载[4], 临床使用钙拮抗剂异搏定治疗AP, 可使血清TNF-α明显降低[19], 提示钙超载与TNF-α有关. 本研究结果显示, SAP组血清TNF-α水平显著高于对照组, 并与细胞内IP3和Ca²⁺水平呈正相关(r分别为0.937和0.976), 相应地SAP组的胰腺病理评分也明显高于对照组, 说明TNF-α增高的重要原因之一与细胞内IP3诱发的细胞内钙超载相关.

评论

背景资料

重型急性胰腺炎(SAP)发展迅速, 并发症多, 死亡率高. 目前研究发现, SAP死亡的主要时期是早期和感染期, 主要原因是由SAP及其感染诱发的细胞因子瀑布样释放导致的重要器官损伤以至衰竭. 观察发现, SAP时存在钙超载, 钙超载可激活核因子-κB及相关的炎症因子, 引起胰腺坏死, 同时血钙明显下降.

同行评议者

沈柏用, 副教授, 上海交通大学医学院附属瑞金医院肝胆胰外科中心

研发前沿

1, 4, 5三磷酸肌醇(IP3)是细胞内的第二信使, 对细胞内钙调控起着重要的作用. 但是在SAP时IP3有何变化、IP3与细胞内钙升高(钙超载)及细胞外钙下降的关系, 尚不清楚.

创新盘点

本研究通过建立SAP模型, 观察SAP时胰腺细胞内IP3的变化及其与钙代谢的关系, 从细胞信息通路方面探讨SAP的发病机制.

同行评价

本研究选题符合该领域的研究热点, 设计科学、合理, 作者掌握了相关的实验基础理论和专门实验技术, 统计处理符合统计学方法, 结论可靠, 但讨论不够深入.

备注

编辑: 李军亮 电编:何基才

参考文献

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