临床研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2009-02-08; 17(4): 368-372
在线出版日期: 2009-02-08. doi: 10.11569/wcjd.v17.i4.368
P53和Bcl-2家族蛋白在胰腺癌中的表达
吴幸, 崔海宁, 明松林, 王正文, 欧树安, 陈兴超, 余壮明
吴幸, 崔海宁, 明松林, 王正文, 欧树安, 陈兴超, 余壮明, 海南医学院附属医院普外科 海南省海口市 570102
吴幸, 副教授, 医学硕士, 主要从事外科生物材料研究.
作者贡献分布: 此课题由吴幸、崔海宁及明松林设计; 研究过程由吴幸与崔海宁操作完成; 数据分析由吴幸完成; 本论文写作由吴幸、崔海宁、明松林、王正文、欧树安、陈兴超及余壮明完成.
通讯作者: 吴幸, 570102, 海南省海口市龙华路, 海南医学院附属医院普外科. wohsien@yahoo.com.cn
收稿日期: 2008-11-12
修回日期: 2008-12-17
接受日期: 2008-12-22
在线出版日期: 2009-02-08

目的: 探讨胰腺癌组织(pancreatic carcinoma, PC)中P53和Bcl-2家族(Bcl-2, Bax, Bcl-xL, Bcl-xS)蛋白表达及与细胞凋亡的关系. 

方法: 免疫组化法检测35例PC中P53蛋白表达, 将PC分为P53阴性表达组(第1组, n = 18)和P53阳性表达组(第2组, n = 17); Western blot检测两组PC中P53, Bcl-2, Bax, Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表达, TUNEL法检测第1组中凋亡指数(AI). 

结果: Bcl-2蛋白在P53阳性PC表达上调, 而在P53阴性PC表达下调(P = 0.047); Bax和Bcl-xL蛋白在两组PC中表达都明显上调(P = 0.274, 0.334); Bcl-xS在P53阳性表达PC明显下调, 在P53阴性表达组明显上调(P = 0.01); 在P53阴性和阳性表达PC, AI分别为12.1±2.47和9.1±1.48(P = 0.023); Bcl-2家族各成员表达与AI无相关性, 而Bcl-2/Bax比率与AI有明显的相关性(P<0.01).

结论: Bcl-2是依赖P53调节的抗凋亡蛋白, Bcl-xS是依赖P53调节的促凋亡蛋白, 而P53主要通过调节Bcl-2/Bax比率发挥凋亡调节作用.

关键词: 胰腺肿瘤; P53; Bcl-2; Bax; Bcl-xL; Bcl-xS; 蛋白免疫印迹法; 原位缺口末端标记法
引文著录: 吴幸, 崔海宁, 明松林, 王正文, 欧树安, 陈兴超, 余壮明. P53和Bcl-2家族蛋白在胰腺癌中的表达. 世界华人消化杂志 2009; 17(4): 368-372
Expression of apoptosis-related Bcl-2-family and P53 in human adenocarcinoma of the pancreas
Xing Wu, Hai-Ning Cui, Song-Lin Ming, Zheng-Wen Wang, Shu-An Ou, Xing-Chao Chen, Zhuang-Ming Yu
Xing Wu, Hai-Ning Cui, Song-Lin Ming, Zheng-Wen Wang, Shu-An Ou, Xing-Chao Chen, Zhuang-Ming Yu, Department of General Surgery, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China
Correspondence to: Xing Wu, Department of General Surgery, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China. wohsien@yahoo.com.cn
Received: November 12, 2008
Revised: December 17, 2008
Accepted: December 22, 2008
Published online: February 8, 2009

AIM: To investigate the relationships between P53 and Bcl-2 family (Bcl-2, Bax, Bcl-xL, Bcl-xS) expression and apoptosis in human pancreatic carcinoma (PC).

METHODS: The immunohistochemical method was used to detect the expression of P53 protein in a total of 35 patients with PC. The patients were divided into two groups, group 1 with immunonegative P53 (18 cases) and group 2 with immunopositive (17 cases). The expressions of P53, Bcl-2, Bax, Bcl-xL, and Bcl-xS in both groups were detected by Western blot. The apoptosis index (AI) of group 1 was determined by terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated UTP end-labeling (TUNEL).

RESULTS: Bcl-2 was remarkably up-regulated in group 2 but down-regulated in group 1 (P = 0.047). Expressions of both Bax and Bcl-xL proteins were up-regulated in those two groups (P = 0.274, 0.334). Bcl-xS was remarkably down-regulated in group 2 but up-regulated in group1 (P = 0.01). The AI of both groups were 12.1 ± 2.47 and 9.1 ± 1.48, respectively (P = 0.023), no correlations were found between AI and expression of Bcl-2 family members, but marked correlations were noted between AI and the Bcl-2/bax ratios (P < 0.01).

CONCLUSION: Bcl-2 family is a group of anti-apoptotic proteins, and Bcl-xS is a pro-apoptotic protein. Both of them are dependent on the regulation of P53 which modulates apoptosis mainly through modifying Bcl-2/Bax ratios.

Key Words: Pancreatic carcinoma; P53; Bcl-2; Bax; Bcl-xL; Bcl-xS; Western blot; Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated UTP end-labeling
0 引言

胰腺癌是预后最差的消化系恶性肿瘤, 5年生存率不足1%-5%[1]. 凋亡受阻是胰腺肿瘤(pancreatic carcinoma, PC)发生发展的重要因素, 而组成Bcl-2家族相关蛋白在PC的凋亡调节过程中占主要地位[2-4]. Bcl-2家族包括凋亡抑制因子(Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1, A1)和凋亡促进因子(Bax, Bak, Bcl-xS, Bad, Bid, Bik, Hrk), 两者的比率决定细胞是否能接受凋亡信号[5]. 在一定程度上, 细胞凋亡或是凋亡抑制是通过两方面基因的调节实现的[6-7]. P53是调节Bcl-2家族的主要蛋白, 而且P53对Bcl-2家族不同蛋白有着不同的调节方式, 由此影响着胰腺癌的生物学行为[6,8-9]. 如, 野生型p53能激活Bcl-2家族的bax促凋亡基因, 抑制bcl-2抑凋亡基因. 但是, p53和bcl-2家族基因的关系目前还不清楚. 本试验旨在系统定量的研究Bcl-2家族成员蛋白表达与P53的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

收集1998-05/2007-05海南医学院普外科手术切除的PC组织35例(临床资料完整), 切除组织分为两部分: 一部分进行常规病理和免疫组织化学检测, 另一部分立即放入-70℃液氮中保存备用. 所有患者均为第1次手术, 术前未经任何放、化疗.

1.2 方法

1.2.1 P53免疫组化检测: 4 μm石蜡切片贴在涂有切片黏合剂的载玻片上, 58℃烤24 h, 常规脱蜡至水, 二甲苯Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 无水乙醇, 950、850、750 mL/L乙醇, 各2 min, 水洗2 min; 30 g/L H2O2作用20 min以消除内源性过氧化物酶的活性. 蒸馏水洗涤, 将切片置于10 mmol/L pH6.0柠檬酸缓冲液中, 120℃微波抗原修复10 min, 室温自然冷却20 min, BPS洗涤3次, 加入阻断血清在正常血清室温下封闭30 min(阻断非特意性结合位点), 擦干组织周围多余水分, 加适当稀释一抗P53(1∶100即用型), 4℃过夜; 加入2抗, 室温30 min, PBS洗3 min×3, DBA染色8 min, 自来水洗3 min, 复染(苏木素衬染30 s, 水洗, 盐酸乙醇蓝化2S, 水洗, 微波蓝化), 常规树脂封片; 用已知阳性标本作阳性对照, 用PBS代替一抗, 结果应为阴性, 阳性为细胞核染色棕黄色或棕褐色, 并呈颗粒状, 背景呈紫蓝色. 阳性反应的强度分为阴性(≤20%), 阳性(>20%)[10].

1.2.2 Western blot检测P53, Bcl-2, Bax, Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表达: 将组织切块切成小片, 加入冰冷的裂解液200 μL, 细胞裂解30 min后, 14 000 r/min 4℃离心20 min, BCA进行蛋白定量. 每孔加入30 μg蛋白, 120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电转至硝酸纤维素膜, 4℃下脱脂奶封闭后过夜. 将膜在4℃. TBST中晃洗中振洗5 min, 2次, 分别加入不同的一抗和G3PDH, 密封, 温室2 h, 4℃ 3 h, 温室2 h. 含3 mL/L Tween-20的BPS洗涤3次, 加入二抗, 密封, 室温1.5 h, 用PBST液将PVDF膜洗3次, 每次5 min. 在暗室内压胶片曝光, 观察结果并照相. 用Bio-Rad/GS 700凝胶图像处理系统进行分析. 肿瘤组织不同蛋白表达水平用目的条带灰度与内参G3PDH条带的灰度比值定量表示.

1.2.3 细胞凋亡检测: 切片脱蜡脱水后加入20 mg/L蛋白激酶K室温孵育15 min, 37℃消化5 min, PBS洗涤1次. 双蒸水洗涤3次, 每次5 min. 加30 g/L H2O2 50 μL/片, 室温下浸泡5 min. 双蒸水洗片3次, 每次5 min. 加上Permeabilisation 50 μL/片, 室温3 min. 双蒸水洗片3次, 每次5 min. 切片加入TdT(0.6 μL)和dUTP(1.4 μL), 37℃湿盒中标记60 min. PBS洗片3次, 每次3 min. 加 Blocking Reagent 50 μL/片, 37℃, 30 min, 甩片. 加Avidin-HRP工作液50 μL/片, 37℃湿盒中标记60 min. PBS洗片3次, 每次3 min. DAB(现配)显色液50 μL/片, 显微镜下控制显色. PBS洗片终止显色. 苏木素复染, 常规封片. 显微镜下计数500个细胞, 以细胞内出现棕色颗粒着为凋亡阳性细胞, 计算计算凋亡指数(AI). AI = 凋亡细胞/总数细胞×100%[10].

统计学处理 统计学数据采用mean±SD表示, 资料采用χ2检验和t检验和Pearson相关性, P<0.05有统计学意义.

2 结果
2.1 蛋白表达

35例PC患者中, P53阴性表达18例(第1组), 阳性表达17例(第2组)(图1). Bcl-2蛋白在第2组中表达上调, 而在第1组中表达下调(P = 0.047), Bax蛋白在两组中表达都明显上调(P = 0.274); Bcl-2/Bax比率在第2组(14/17)明显高于第1组(4/18)(P = 0.018). Bcl-xL蛋白在两组中表达也明显上调(分别15/17和14/18)(P>0.05), 而Bcl-xS在第1组表达上调(13/18), 在第2组表达下调(3/17)(P<0.05). Bcl-xL/Bcl-xS在两组都表达上调(P>0.05)(图2, 表1).

表1 胰腺癌组织中Bcl-2, Bax, Bcl-xL, Bcl- xS蛋白表达与P53的关系.
分组Ratio≥1Ratio<1P值
Bcl-20.047
第1组512
第2组153
Bax0.274
第1组153
第2组152
Bcl-2/Bax0.012
第1组414
第2组143
Bcl-xL0.334
第1组153
第2组143
Bcl-xS0.021
第1组135
第2组314
Bcl-xL/Bcl-xS0.215
第1组144
第2组125
图1
图1 免疫组织化学法检测P53在胰腺癌组织中的表达. A: P53染色阴性(×100); B: P53染色阳性(×200).
图2
图2 Western blot检测P53, Bcl-2, Bax, Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表达.
2.2 细胞凋亡

在P53阴性和阳性表达组的PC中, AI分别为12.1±2.47和9.1±1.48, 差异有显著性(P = 0.023); 在Bcl-2, Bax, Bcl-xL和Bcl-xS高表达组(≥1), AI分别为10.36±2.26, 11.39±3.82, 11.18±3.21, 12.83±2.66, 在Bcl-2, Bax, Bcl-xL和Bcl-xS低表达组(<1), AI分别为11.54±2.54, 10.45±2.06, 10.45±1.36, 10.00±2.43, 差异分别无统计学意义(P>0.05); 而在Bcl-2/Bax比率≥1组, AI为9.19±1.87, Bcl-2/Bax比率<1组, AI为13.02±3.45, 差异有统计学意义(P = 0.012); Bcl-xL/Bcl-xS比率与AI无相关性(P>0.05, 图3, 表2).

表2 Bcl-2, Bax, Bcl-xL, Bcl- xS蛋白表达与AI的关系.
分组nAIP值
Bcl-2/G3PDH0.056
Ratio≥12010.36±2.26
Ratio<11511.54±2.54
Bax/G3PDH0.364
Ratio≥13011.39±3.82
Ratio<1510.45±2.06
Bcl-xL/G3PDH0.173
Ratio≥12911.18±3.21
Ratio<1610.45±1.36
Bcl-xS/G3PDH0.069
Ratio≥11612.83±2.66
Ratio<11910.00±2.43
Bcl-2/Bax0.012
Ratio≥1189.19±1.87
Ratio<11713.02±3.45
Bcl-xL/Bcl-xS0.082
Ratio≥12611.72±2.58
Ratio<1912.51±3.19
图3
图3 胰腺癌组织中的细胞凋亡(TUNEL). A: P53表达阴性组(×400); B: P53表达阳性组(×200).
3 讨论

野生型p53(Wt-p53)是转录调节因子, 其在细胞DNA合成、DNA修复和凋亡调节过程中起重要作用[11]. 由于Wt-P53蛋白的半衰期短并且含量低微, 因此, 通过免疫染色方法难以检测得到[7]. 当p53突变后, 突变p53可与细胞中的某些蛋白结合而积聚在细胞中, 在这种情况下可通过免疫组化方法检测到高水平的突变p53表达[7].

细胞凋亡是由基因调控的主动而有序的自我消亡过程, 大多数情况下, 细胞生死是通过p53依赖或非依赖两条途径进行调节的, 而高效的细胞凋亡必须通过p53途径[12-13]. 在本实验中, PC组织中P53阳性表达率为48.6%, AI在P53阴性组明显高于P53阳性组, 说明PC中细胞凋亡是P53依赖性, 这与文献的研究结果相一致[14-16].

P53的凋亡调节作用是通过上调Bax和下调Bcl-2或Bcl-xL等实现的, 通过他们的相互作用调节着细胞线粒体的通透性, 从而影响着下游的促凋亡基因的功能[6-7,17-20].

我们的研究结果表明, Bcl-2在P53阳性表达的PC中过度表达, 而在P53阴性表达的PC中明显低表达, 说明Bcl-2是P53依赖性调节, 即P53高表达者对Bcl-2的抑制作用减弱或消失, 而P53丧失者对Bcl-2的抑制作用加强. Bax在P53阴性和阳性组都表达上调, 但差别无统计学意义, 说明Bax是不依赖P53进行调节的. Bcl-xL在P53阳性和阴性表达的肿瘤组织中也都存在明显上调(P>0.05), 而Bcl-xS在P53阳性表达的肿瘤组织中下调, 在P53阴性表达肿瘤组织中明显上调(P<0.05), 提示Bcl-xS是P53依赖性调节. 研究Bcl-xL/Bcl-xS和Bcl-2/Bax比率发现, 后者在P53阳性和阴性表达组的差异有显著性(P<0.05), 说明Bcl-2/Bax比率是依赖P53进行调节的. 但凋亡检测表明: Bax和Bcl-xL表达与AI无相关性, 尽管Bcl-2低表达组和Bcl-xS高表达组的AI高于Bcl-2高表达组和Bcl-xS低表达组, 差异无显著性. Bcl-xL/Bcl-xS比率在不同AI之间的差异也无统计学意义, 但AI在Bcl-2/Bax高比率组明显低于低比率组(P<0.01), 所以Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素[21-27]. 因此, 细胞凋亡不是由单一的凋亡相关蛋白决定的, 而是由许多蛋白共同作用的结果[28-29].

总之, Bcl-2和Bcl-xS是受P53依赖性调节的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白, P53主要通过调节Bcl-2/Bax比率发挥凋亡调节作用的.

评论
背景资料

Bcl-2家族相关蛋白的抗凋亡和促凋亡成员协同作用, 在胰腺癌的凋亡调控中起着举足轻重的作用; P53是调节Bcl-2家族的主要蛋白, 但p53和bcl-2家族基因的关系目前还不清楚.

同行评议者

李国威, 教授, 西安交通大学医学院第二附属医院普通外科

研发前沿

凋亡受阻是胰腺癌发病的重要因素, 而P53及Bcl-2家族蛋白在胰腺癌凋亡过程中的相关性有待深入研究.

相关报道

大多数作者研究了Bcl-2家族某些蛋白与胰腺癌之间的关系, 但系统定量的研究Bcl-2家族成员蛋白表达与P53的关系少见.

应用要点

本文探讨了P53和Bcl-2家族成员蛋白之间表达的关系以及与细胞凋亡的关系, 为以凋亡为靶点的基因治疗提供理论依据.

同行评价

本研究目的明确, 设计技术路线合理, 新颖性较好, 研究结构有一定理论参考价值.

编辑:李军亮 电编:何基才

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