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世界华人消化杂志. 2009-12-28; 17(36): 3671-3674
在线出版日期: 2009-12-28. doi: 10.11569/wcjd.v17.i36.3671
Micro-RNAs在肝纤维化发生中的作用
张锦生
张锦生, 复旦大学上海医学院病理学系 上海市 200032
张锦生, 教授, 博士生导师, 主要从事肝病病理研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, N0. 30570824.
通讯作者: 张锦生, 教授, 200032, 上海市医学院路138号, 复旦大学上海医学院病理学系. jszhang44@shmu.edu.cn
电话: 021-54237049 传真: 021-54237596
收稿日期: 2009-10-23
修回日期: 2009-11-18
接受日期: 2009-11-23
在线出版日期: 2009-12-28

1993年Lee et al在秀丽新小杆线虫中发现编码形成可抑制LIN-14蛋白合成, 大小为22 nt的小分子RNA基因lin-4, 当时并未引起注意. 直到2000年, Reinhart et al又在此线虫中发现第二种类似的基因let-7, 此后不到一年间又相继发现了数百种类似的小分子RNA, 被称为micro-RNAs(miRNAs). 近年来, miRNAs的研究突飞猛进. miRNAs与肿瘤发生发展的关系及其潜在的诊断价值是目前研究的热点之一, 且在非肿瘤疾病中, miRNAs的研究方兴未艾. 现将与肝纤维化发生有关的miRNAs研究作一简介.

关键词: Micro-RNAs; 肝星状细胞; 肝纤维化
引文著录: 张锦生. Micro-RNAs在肝纤维化发生中的作用. 世界华人消化杂志 2009; 17(36): 3671-3674
Role of micro-RNAs in the pathogenesis of hepatic fibrosis
Jin-Sheng Zhang
Jin-Sheng Zhang, Department of Pathology, Shanghai Medical College of Fudan University, Shanghai 200032, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30570824.
Correspondence to: Professor Jin-Sheng Zhang, Department of Pathology, Shanghai Medical College of Fudan University, 138 Yixueyuan Road, Shanghai 200032, China. jszhang44@shmu.edu.cn
Received: October 23, 2009
Revised: November 18, 2009
Accepted: November 23, 2009
Published online: December 28, 2009

In 1993, Lee et al found that 22-nt small-molecule RNAs encoded by the lin-4 gene inhibited the synthesis of LIN-14 protein in Caenorhabditis elegans, which, however, did not attract wide attention. Until 2000, Reinhart et al reported a similar finding in the let-7 gene. In less than a year later, hundreds of types of similar small-molecule RNA-like RNAs, called microRNAs (miRNAs), were discovered. In recent years, the number of studies on miRNAs is growing by leaps and bounds. The relationship of miRNAs with tumor development and progression and its potential diagnostic value have become a hot research topic. In non-cancer diseases, the research on miRNAs is attracting more attention. Here, we will review the role of micro-RNAs in the pathogenesis of liver fibrosis.

Key Words: Micro-RNAs; Hepatic stellate cells; Hepatic fibrosis
0 引言

miRNAs普遍存在于真核细胞中, 进化上高度保守, 是一类约22 nt的内源性单链RNA分子, 作用于靶mRNA导致其降解或抑制其翻译, 在动物和植物中均对基因表达起重要的负调控作用. miRNAs基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中, 绝大部分定位于已知基因的间隔区(intergenic), 另有很小一部分位于pre-mRNA的内含子区, 其表达受生理反应和发育信号的动态调控[1]. 编码miRNAs的基因约占全部预测基因的1%-5%, 即在人类基因组中可能存在1000多种miRNAs基因. 据计算机分析软件预测, 每种miRNAs可调控多达200种靶基因, 意味着超过1/3的人类蛋白编码基因受到miRNAs调控[2]. 在生物体的不同发育时期, 不同组织器官中, miRNAs的种类和数量均不同, 其表达具有时空特异性. 通过对线虫、果蝇、鱼类、小鼠和人类细胞的研究, 发现miRNAs可通过调节信号分子(如: 细胞因子、生长因子、转录因子和促凋亡、抗凋亡蛋白等)表达, 对多种生物学过程发挥重要调控作用, 包括: 个体发育、细胞分化、增殖、代谢、凋亡和应激等. 在人类约50%已知的miRNAs基因定位于与肿瘤相关的染色体区, 提示其在肿瘤发生中具有重要作用[3]. 近年研究发现, 在很多人类恶性肿瘤, 包括慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、淋巴瘤、胃癌、食管癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和甲状腺癌等, miRNAs表达均发生显著变化, 与抑制或促进肿瘤的发生、发展有关. 另外, 分析miRNAs表达谱(miRNAs expression profile)有助于对肿瘤进行分类、诊断及判断预后[4-7]. 相对于肿瘤的miRNAs, 对非肿瘤性疾病miRNAs的研究还不多, 尤其是对miRNAs在肝纤维化发生中的作用和意义的研究方兴未艾. 全面了解肝纤维化发生过程miRNAs变化的规律性, 必然有助于深入揭示肝纤维化发生机制, 并提供新的有效的治疗靶点.

1 miRNAs的合成加工及作用机制

细胞核内编码miRNAs的基因在RNA聚合酶Ⅱ作用下转录生成含数百到数千个碱基对的原始miRNAs(primary microRNAs, pri-miRNAs), pri-miRNAs具有5'端7-甲基鸟苷酸帽子和3'端多聚腺苷酸尾巴[8]. pri-miRNAs在由核酸内切酶RNaseⅢ家族成员Drosha及属于双链RNA结合蛋白(the double-stranded RNA binding protein, dsRBD)的DGCR8组成的微处理复合物(microprocessor complex)作用下, 在核内加工成大小约60-70 nt, 具有发夹结构的单链miRNAs前体(precursor microRNAs, pre-miRNAs). Drosha的剪切位点位于每个pri-miRNAs发夹结构的基底部, 常相互错开两个核苷酸, 故pre-miRNAs 3'端有2个核苷酸突出. 剪切位点上游20 nt至下游25 nt间的发夹柄区序列具有关键作用, 其突变会显著削弱Drosha的剪切效率. Drosha对RNA的特异性剪切决定了成熟miRNAs的序列[9]. pre-miRNAs在Ran-GTP依赖的核质/胞质转运蛋白Exportin5的作用下, 从核内转移至胞质, 并被RNA诱导的基因沉默复合物(RNA induced silencing complex, RISC)识别[10]. RISC由RnaseⅢ家族成员Dicer、dsRBD-TRBP和核酸内切酶Argonaute2(Ago2)组成, RISC将pre-miRNAs加工为成熟miRNAs, 裂解靶mRNA, 全过程不需ATP. RISC装配、pre-miRNAs加工、和靶mRNA断裂是偶联的[11]. Dicer剪切pre-miRNAs形成-22 nt双链miRNAs, 此时成熟miRNAs与其互补序列miRNAs*结合成miRNAs:miRNAs*双螺旋. 双螺旋中, 2条链的3'端均有2个突出的核苷酸, 但不完全配对, miRNAs链近5'端有一个不与miRNAs*链相应位置配对的小突起, 这个小突起显著削弱了miRNAs链5'端的稳定性. 成熟miRNAs的产生总是优先选择5'端较不稳定的1条链, 因此miRNAs链被选中的机会大于miRNAs*链约100倍. 双链解开后miRNAs与Ago2结合留在活化的RISC中, 而miRNAs*链则迅速被降解[12]. miRNAs通过互补序列识别靶mRNA, 并与其3'端非翻译区(untranslated region, UTR)结合, 由Ago2剪切靶mRNA使其降解, 或抑制mRNA翻译, 诱导转录后基因沉默[11,13].

2 miRNAs在肝星状细胞激活及凋亡中的作用

肝纤维化是各种原因(病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、中毒性肝病、自身免疫性肝病等)导致肝脏损害后的一种修复过程, 其结局是形成肝硬化, 成为消化内科常见的难治疾病[14-15]. 激活的肝星状细胞是产生以胶原蛋白为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要细胞, 肝星状细胞的激活是肝纤维化发生的早期关键事件. 影响该细胞激活的因素很多, 有细胞因子的旁分泌和自分泌作用、氧化应激、微环境ECM的改变等因素[15-17]. 另外, 与肝星状细胞分化有关的基因在激活中也起重要作用, 维甲酸(RA)是促进细胞分化和抑制细胞增殖的重要调控分子, 可与两类核受体结合, 分别是RAR(retinoic acid receptors α, β, γ)和RXR(retinoid X receptors α, β, γ). 维甲酸核内受体RXRα在核受体信号通路中具有核心作用, 既可形成同二聚体, 又是其他多种核受体发挥作用所必需形成的异二聚体中的配偶体. 过氧化物酶体增生因子激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)是核内固醇类激素受体PPARs家族的一个亚型, 可通过与RXRα结合形成异二聚体与特殊的PPAR反应元件(PPAR response element, PPRE)结合调控多种促进细胞分化和脂质代谢基因转录. 国外研究及本课题组前期的工作已证实RXRα和PPARγ基因表达下调及相伴随的RA信号转导削弱是肝星状细胞激活的重要内在分子机制. 通过质粒转染上调RXRα或PPARγ均可部分逆转激活肝星状细胞的表型[18]. 我们从调控这两种分子表达的miRNAs着手, 用Real-time RT-PCR观察了原代培养大鼠肝星状细胞在体外培养自然激活前后的与该两种分子相关的33种miRNAs表达变化, 发现miR-27a, miR-27b在肝星状细胞激活后明显上调, 除此上调的还有miR-30a, miR-30c, miR-30d. 进一步用anti-miR-27a, anti-miR-27b抑制miR-27a, miR-27b的上调时, 激活肝星状细胞细胞内已消失的脂滴又重新出现, RXRα蛋白表达上调而细胞增殖却受到明显抑制. 为了证明RXRα是miR-27a, miR-27b作用的靶分子, 我们把RXRα mRNA的3'UTR插于荧光素酶报告基因终止码下游, 然后将该报告基因载体与miR-27a, miR-27b的表达载体分别共转染293T细胞, 结果显示, miR-27a, miR-27b均可抑制荧光素酶的表达. 说明RXRα确是miR-27a, miR-27b作用的靶分子[19]. 这些结果证明miR-27a, miR-27b表达的上调参与肝星状细胞激活过程. Kwiecinski et al从数据库搜索到与胶原蛋白mRNA 3'UTR互补的miR-29a, miR-29b, 观察到激活的肝星状细胞或人和动物纤维化肝组织miR-29a, miR-29b表达下调, 进一步将含miR-29a, miR-29b的载体转染肝星状细胞, 胶原蛋白合成受到抑制. 提示miR-29a, miR-29b表达下调也参与肝星状细胞激活[20]. Venugopal et al分离胆管结扎大鼠肝纤维化模型肝中的肝星状细胞, 研究其miR的表达谱, 与从正常大鼠肝分离的肝星状细胞相比较, 表达上调的miR有2种, 下调的有5种, 进一步将下调的miR-150和miR-194分别转染人肝星状细胞系LX2中, 使两者过表达, 结果LX2的增殖受到抑制, 同时MMPs、TIMP-3、CD44、E-钙黏蛋白、整联蛋白等的表达均有改变. 提示这些miR表达的改变参与了胆管结扎大鼠肝纤维化模型中肝星状细胞的激活[21]. Guo et al用miR芯片观察到大鼠肝星状细胞在体外培养自然激活后, 有12种miR表达上调, 9种miR表达下调. 进一步用QRT-PCR核实, 上调的为miR-138, miR-140, miR-143, 下调的是miR-15b, miR-16, miR-122. 进一步研究发现, 下调的miR-15b、miR-16作用的靶分子是Bcl-2的mRNA, 实验结果也表明将miR-15b、miR-16表达载体转染激活的肝星状细胞可诱导凋亡. 说明miR-15b、miR-16参与调控肝星状细胞激活过程中的凋亡机制[22].

3 miRNAs在肝纤维化发生中的作用

相对于肝星状细胞的体外研究, 人或动物肝纤维化发生过程中, 对miRNAs的研究还很少, 国外仅见零星的会议论文摘要. Hall et al利用30个BXD(C57BL/6J X DBA/2J)亲本遗传背景不同组合的嵌合体的小鼠近交系谱系作为研究对象, 用CCl4诱导肝纤维化6 wk后, 观察肝纤维化和miR表达的变化, 结果发现不同嵌合体的近交系小鼠对CCl4的敏感性不同, 肝组织纤维化分期从F0至F3不等, 肝脏胶原蛋白含量也从每克肝组织181至506 μg不等. 同时miR-192和肝特异性miR-122表达的改变也随之不一. miR-192的改变从3.9至12.6倍不等, miR-122则从6.3至10.4倍不等. 提示小鼠对环境致纤维化因子的敏感性和肝脏miR的表达受遗传控制[23]. 同时还表明肝特异性miR-122在肝纤维化发生过程中变化显著, 值得深入研究其真正的作用. 国内马兆龙 et al用芯片筛选正常人肝组织、乙型肝炎后肝硬化肝组织、乙型肝炎相关肝癌组织各1例的miR表达谱, 结果显示肝硬化肝组织和肝癌组织miR上调2倍以上的有hsa-miR-602、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-210、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-30b、hsa-miR-572, 下调2倍以上的有hsa-miR-143、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-195、hsa-miR-27a、hsa-miR-99a、hsa-miR-519e、hsa-miR-130a、hsa-miR-597[24]. 表明从HBV肝炎到肝纤维化, 直至肝癌发生都伴有miR表达的变化.

4 结论

肝纤维化的发生是一个非常复杂的病理生物学过程, 涉及肝实质细胞损伤, 肝小叶结构不同程度的破坏; ECM产生细胞激活、增生并产生分泌以胶原蛋白为主的ECM, 当ECM产生超过其降解时, 肝纤维化即发生. ECM产生细胞主要来自肝脏原驻的肝星状细胞, 另外, 也可能来自骨髓间充质干细胞或肝细胞通过EMT转化而来的间质细胞. 肝纤维化发生最基本的细胞事件不外乎细胞分化、增生和凋亡. 而这些正是miRNAs所调节的. 因此研究肝纤维化发生时miRNAs的作用其前景不可估量. 目前, 肝纤维化过程中miRNAs的研究还很零碎、初步, 文献也不多. 因此, 大力加强这方面的研究应该提到议事日程上了. 今后的研究应从肝炎-肝硬化患者及肝纤维化动物模型两方面展开, 患者材料除了研究肝组织miRNAs变化外, 特别注意要用显微切割的方法, 分别研究肝细胞和窦旁细胞miRNAs的变化; 动物模型除了观察肝组织miRNAs综合变化外, 还应在纤维化不同时期分离肝细胞、肝星状细胞、库弗细胞、肝血窦内皮细胞分别进行研究. 只有这样, 才能搞清楚肝纤维化发生过程中肝脏miRNAs改变的网络, 找出起关键作用的miRNAs, 并进一步落实他们作用的靶分子, 并探索这些关键miRNAs改变的上游事件, 如miRNAs基因是否有扩增, 或其启动子是否有甲基化等等. 可以坚信, 一旦这些科学问题得到很好解决, 可为肝纤维化的防治提供新的线索, 从而推动肝纤维化、肝硬化的治疗和预防.

评论
背景资料

肝纤维化的发生是一个非常复杂的病理生物学过程, 其最基本的细胞事件不外乎细胞分化、增生和凋亡. 而这些正是miRNAs所调节的. 有研究表明, 分析miRNAs表达谱(miRNAs expression profile)有助于对肿瘤进行分类、诊断及判断预后. 相对于肿瘤的miRNAs, 对非肿瘤性疾病miRNAs的研究还不多, 尤其是对miRNAs在肝纤维化发生中的作用和意义的研究方兴未艾.

同行评议者

姚希贤, 教授, 河北医科大学附属第二医院消化内科

相关报道

Venugopal et al分离胆管结扎大鼠肝纤维化模型肝中的肝星状细胞, 研究其miR的表达谱, 与从正常大鼠肝分离的肝星状细胞相比较, 表达上调的miR有2种, 下调的有5种. Guo et al用miR芯片观察到大鼠肝星状细胞在体外培养自然激活后, 有12种miR表达上调, 9种miR表达下调.

应用要点

本文提示, 全面了解肝纤维化发生过程miRNAs变化的规律性, 必然有助于深入揭示肝纤维化发生机制, 并提供新的、有效的治疗靶点.

同行评价

当前对Micro-RNAs在肝纤维化发生中的作用研究尚少, 本文有一定参考价值.

编辑:李军亮 电编:何基才

1.  Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116:281-297.  [PubMed]  [DOI]
2.  Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 2005;120:15-20.  [PubMed]  [DOI]
3.  Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, Hyslop T, Noch E, Yendamuri S, Shimizu M, Rattan S, Bullrich F, Negrini M. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:2999-3004.  [PubMed]  [DOI]
4.  Calin GA, Liu CG, Sevignani C, Ferracin M, Felli N, Dumitru CD, Shimizu M, Cimmino A, Zupo S, Dono M. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:11755-11760.  [PubMed]  [DOI]
5.  Calin GA, Ferracin M, Cimmino A, Di Leva G, Shimizu M, Wojcik SE, Iorio MV, Visone R, Sever NI, Fabbri M. A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2005;353:1793-1801.  [PubMed]  [DOI]
6.  Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, Veronese A, Spizzo R, Sabbioni S, Magri E, Pedriali M, Fabbri M, Campiglio M. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res. 2005;65:7065-7070.  [PubMed]  [DOI]
7.  Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, Sweet-Cordero A, Ebert BL, Mak RH, Ferrando AA. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005;435:834-838.  [PubMed]  [DOI]
8.  Lee Y, Jeon K, Lee JT, Kim S, Kim VN. MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. EMBO J. 2002;21:4663-4670.  [PubMed]  [DOI]
9.  Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J, Lee J, Provost P, Rådmark O, Kim S. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature. 2003;425:415-419.  [PubMed]  [DOI]
10.  Lund E, Güttinger S, Calado A, Dahlberg JE, Kutay U. Nuclear export of microRNA precursors. Science. 2004;303:95-98.  [PubMed]  [DOI]
11.  Gregory RI, Chendrimada TP, Cooch N, Shiekhattar R. Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell. 2005;123:631-640.  [PubMed]  [DOI]
12.  Khvorova A, Reynolds A, Jayasena SD. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell. 2003;115:209-216.  [PubMed]  [DOI]
13.  Lingel A, Simon B, Izaurralde E, Sattler M. Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain. Nature. 2003;426:465-469.  [PubMed]  [DOI]
14.  Friedman SL. Liver fibrosis -- from bench to bedside. J Hepatol. 2003;38 Suppl 1:S38-S53.  [PubMed]  [DOI]
15.  Friedman SL. Seminars in medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. The cellular basis of hepatic fibrosis. Mechanisms and treatment strategies. N Engl J Med. 1993;328:1828-1835.  [PubMed]  [DOI]
16.  Lee KS, Buck M, Houglum K, Chojkier M. Activation of hepatic stellate cells by TGF alpha and collagen type I is mediated by oxidative stress through c-myb expression. J Clin Invest. 1995;96:2461-2468.  [PubMed]  [DOI]
17.  Friedman SL, Roll FJ, Boyles J, Arenson DM, Bissell DM. Maintenance of differentiated phenotype of cultured rat hepatic lipocytes by basement membrane matrix. J Biol Chem. 1989;264:10756-10762.  [PubMed]  [DOI]
18.  张 锦生. 肝星状细胞激活的内在机制. 世界华人消化杂志. 2005;13:831-834.  [PubMed]  [DOI]
19.  Ji J, Zhang J, Huang G, Qian J, Wang X, Mei S. Over-expressed microRNA-27a and 27b influence fat accumulation and cell proliferation during rat hepatic stellate cell activation. FEBS Lett. 2009;583:759-766.  [PubMed]  [DOI]
20.  Kwiecinski M, Strack I, Noetel A, Schievenbusch S, Scheffler M, Elfimova N, Dienes HP, Odenthal M. MicroRNA-29: A novel antifibrogenic mediator in liver fibrogenesis. Hepatology. 2008;48:S110.  [PubMed]  [DOI]
21.  Venugopal SK, Jiang J, Kim TH, Torok N, Zern M. Differential expression of microRNAs in rat primary stellate cells during fibrosis and their role in the development of fibrosis. Hepatology. 2008;48:406A.  [PubMed]  [DOI]
22.  Guo CJ, Pan Q, Li DG, Sun H, Liu BW. miR-15b and miR-16 are implicated in activation of the rat hepatic stellate cell: An essential role for apoptosis. J Hepatol. 2009;50:766-778.  [PubMed]  [DOI]
23.  Hall RA, Biondi IA, Hochrath K, Weber SN, Lammert F. Changes of liver-specific microRNA expression during CCL4 induced chronic liver injury in recombinant inbred mice. Hepatology. 2008;48:913A.  [PubMed]  [DOI]
24.  马 兆龙, 杨 炼, 陈 立波, 黄 金明, 王 冬冬, 王 国斌. miRNA在HBV从感染经由肝硬化到肝癌进程中表达谱的变化. 世界华人消化杂志. 2009;17:2112-2116.  [PubMed]  [DOI]