修回日期: 2009-11-17
接受日期: 2009-11-30
在线出版日期: 2009-12-18
目的: 探讨全血RUNX3启动子甲基化对胃癌早期诊断的意义.
方法: 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法, 检测80例胃癌患者的癌组织及其对应的癌旁组织及全血中RUNX3启动子甲基化情况.
结果: 胃癌组织标本中RUNX3基因启动子甲基化率为45%, 癌旁组织中甲基化率为0%, 全血中甲基化率为40%. 胃癌组织、全血中RUNX3基因启动子甲基化, 差异无统计学意义(P>0.05). 全血标本中RUNX3启动子甲基化表达情况与分化程度、是否有淋巴结转移密切相关, 与年龄、性别、肿瘤部位浸润深度无关.
结论: 全血RUNX3启动子区甲基化对胃癌早期诊断有重要指导意义, 与胃癌的发生、发展密切相关.
引文著录: 王春玲, 姜相君. 全血RUNX3启动子甲基化对胃癌早期诊断的意义. 世界华人消化杂志 2009; 17(35): 3653-3656
Revised: November 17, 2009
Accepted: November 30, 2009
Published online: December 18, 2009
AIM: To investigate the significance of human runt-related transcription factor 3 (RUNX3) promoter methylation in DNA prepared from whole blood for early diagnosis of gastric carcinoma.
METHODS: Methylation-specific PCR (MSP) was used to detect the methylation status of RUNX3 promoter in DNA prepared from carcinoma tissue, adjacent tissue and whole blood samples taken from 80 gastric cancer patients.
RESULTS: The detection rates of RUNX3 promoter methylation in DNA prepared from gastric carcinoma tissue, adjacent tissue and whole blood samples were 45%, 0% and 40%, respectively. No significant difference was noted in the detection rate of RUNX3 promoter methylation between gastric carcinoma tissue and whole blood samples (P > 0. 05). The RUNX3 promoter methylation status in gastric carcinoma was correlated with tumor differentiation and lymph node metastasis, but not with age, gender and tumor site.
CONCLUSION: RUNX3 promoter methylation status in DNA prepared from whole blood is closely associated with the oncogenesis and metastasis of gastric carcinoma and has important significance for early diagnosis of gastric carcinoma.
- Citation: Wang CL, Jiang XJ. Significance of RUNX3 promoter methylation in DNA prepared from whole blood for early diagnosis of gastric carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2009; 17(35): 3653-3656
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v17/i35/3653.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v17.i35.3653
胃癌约占胃恶性肿瘤的95%以上, 在癌症死亡率中居第2位[1], 严重威胁人类健康. 众多研究发现, 在胃癌发生的分子机制中, 遗传和表遗传机制均起着重要的作用. DNA甲基化是研究最多也最深入的一种表遗传学表达机制. RUNX3作为一个新发现的抑癌基因, 作为转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)信号作用的靶点对胃癌细胞的生长有明显的抑制作用[2], 而DNA异常甲基化则是RUNX3基因在胃癌中失活的重要途径. 我们采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR, MSP)方法检测胃癌患者癌组织、其对应癌旁组织及全血RUNX3启动子甲基化的情况, 探讨全血RUNX3启动对子甲基化对胃癌早期诊断的意义.
2008-11/2009-08青岛市立医院普外科胃癌手术切除标本80例, 包括胃癌组织及其对应的癌旁组织. 患者年龄为35-79(中位年龄56)岁, 男44例, 女36例. 术前取患者外周血5 mL, 经EDTA抗凝. 胃癌组织取自肿块中央非坏死部分, 癌旁组织取自距离肿块5 cm以上的正常胃黏膜组织. 患者术前未经辅助放疗、化疗及免疫治疗. 所有标本均经病理证实. 正常对照标本取自无消化系统疾病及任意肿瘤的正常青年人外周血, EDTA抗凝. 所有标本于-70 ℃冰箱保存. EZ DNA Methylation-Gold kitTM试剂盒购自北京天漠技术开发有限公司, 甲基化转移酶SssⅠ为美国New England公司产品, 引物委托大连宝生物公司合成. PCR Taq Mix酶及Marker购自东盛生物科技有限公司.
采用酚-氯仿抽提, 冰乙醇沉淀方法回收提纯DNA, -20 ℃保存. 紫外分光光度计测其纯度. 按照EZ DNA Methylation-Gold kitTM试剂盒说明进行DNA甲基化修饰. DNA甲基化、非甲基化引物参照文献[2]合成, 扩增片段212 bp. 5M: 5'-TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG-3', 3M: 5'-AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC-3'; 非5U: 5'-TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG-3', 3U: 5'-AAAACAACCAACACAAACACCTCC-3'. PCR反应体系为25 µL, 包括Taq Mix酶12.5 µL, 上、下游引物各1 µL, 模板(以上修饰的DNA)2 µL, 双蒸水8.5 µL. 循环参数为: 甲基化反应条件: 95 ℃预变性3 min, 95 ℃变性30 s, 64.5 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共35个循环, 最后延伸5 min; 非甲基化反应条件: 95 ℃预变性3 min, 95 ℃变性30 s, 63 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共35个循环, 最后延伸5 min. 2%的琼脂糖凝胶电泳, EB染色, 紫外光灯检测结果(M为甲基化引物, U为非甲基化引物). 每批标本均同时扩增甲基化酶SssⅠ修饰和未修饰的提取的正常青年人外周血DNA作为甲基化阳性和非甲基化阳性对照. 阴性对照为双蒸水. 分别只有M引物和U引物得到预期大小的扩增片段, 阴性对照未得到任何产物, 提示实验技术及所用引物和试剂正确, 实验结果可信.
统计学处理 采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理, 两样本率的比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义.
RUNX3在胃癌组织中的甲基化率为45%(36/80), 对应癌旁组织中的甲基化率为0%(0/80), 全血中的甲基化率为40%. 胃癌组织及全血中的甲基化表达, 两者差异无统计学意义(P>0.05, 表1).
| 组织 | 甲基化表达 | 非甲基化表达 | χ2值 | P值 |
| 癌组织 | 36 | 44 | 14.48 | >0.05 |
| 全血 | 32 | 48 |
胃癌组织、全血中RUNX3启动子甲基化表达与患者性别、年龄、肿瘤部位之间差异无统计学意义(P>0.05, 表2). 有淋巴转移组的RUNX3启动子甲基化表达高于无转移组(P<0.05, 表2). 分化程度高的实验组RUNX3启动子甲基化表低于分化程度低的实验组(P<0.05, 表2).
| 临床因素 | n | 癌组织 | 全血 | |||||
| 甲基化(n) | χ2值 | P值 | 甲基化(n) | χ2值 | P值 | |||
| 性别 | ||||||||
| 男 | 44 | 24 | 3.60 | >0.05 | 22 | 0.57 | >0.05 | |
| 女 | 36 | 12 | 10 | |||||
| 年龄(岁) | ||||||||
| >50 | 58 | 24 | 1.10 | >0.05 | 24 | 0.09 | >0.05 | |
| ≤50 | 22 | 12 | 8 | |||||
| 淋巴结转移 | ||||||||
| 有 | 54 | 26 | 10.20 | <0.05 | 27 | 6.92 | <0.05 | |
| 无 | 26 | 10 | 5 | |||||
| 浸润深度 | ||||||||
| T1-T2 | 31 | 11 | 1.85 | >0.05 | 8 | 4.25 | >0.05 | |
| T3-T4 | 49 | 25 | 24 | |||||
| 肿瘤部位 | ||||||||
| 胃窦 | 48 | 24 | 1.24 | >0.05 | 23 | 3.24 | >0.05 | |
| 胃体 | 16 | 6 | 5 | |||||
| 贲门 | 16 | 6 | 4 | |||||
| 分化程度 | ||||||||
| 高中 | 38 | 10 | 10.10 | <0.05 | 7 | 6.40 | <0.05 | |
| 低 | 42 | 26 | 25 | |||||
在电泳图中, 同一标本胃癌组织检测到甲基化和非甲基化两种结果, 可能与取材有关; 对应癌旁组织未检测到甲基化, 全血中检测到甲基化(图1).
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶DNMTS(DNA methyltransferases)的介导下, 二核苷酸中胞嘧啶(C)的第5位C原子上的H被S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基取代, 使之变成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, m5C)的化学修饰过程. DNA基因组异常甲基化在肿瘤发生、发展中起重要作用.
RUNX3基因是Levanon et al于1994年发现的, 最初被命名为急性髓性白血病2基因[3], 以后又被称作多瘤病毒强化因子结合蛋白2基因、核心结合因子α3基因[4-5]. RUNX3基因家族是一类具有RUNX保守域的转录因子家族, 在哺乳动物中该家族包括基因runx1、runx2和ruxn3[6]. runx1是人类白血病常见的突变基因, 是闭锁颅骨发育异常的有关基因[6-7]. 已发现RUNX3在神经发生过程中发挥关键性作用. 2002年日本学者Li et al首例发现RUNX3有调节胃上皮细胞的增生与凋亡平衡的作用. 人类RUNX3位于染色体1p36.1, 是runx家族中最小也是迄今对其研究最少的基因, 全长67 kb, 含有6个外显子和p1和p2 2个启动子, 2个启动子富含GC, p2启动子GC含量达到64%, 易发生甲基化变化.
Li et al[2]采用PCR-SSCP方法检测119例胃癌组织中RUNX3的基因编码区域, 结果发现仅1例(1/119)胃癌组织存在RUNX3突变. Li et al发现联合应用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮唑2-脱氧胞苷、组蛋白去乙酰酶抑制剂曲古抑菌素可以使RUNX3失表达的胃癌细胞系恢复表达活性, 进一步证实了是RUNX3基因启动子区甲基化导致了RUNX3基因的失表达, 而不是基因本身的突变和基因杂合性缺失所致. 表明RUNX3基因在胃癌中很少发生突变, RUNX3基因启动子区异常甲基化是主要失活机制.
Lee et al[8]检测胃癌患者肿瘤和血液中基因(DAP2Kinase、E2cadherin、GSTP1、p15、p16)启动子甲基化情况, 发现血液中细胞异常甲基化能如实反映肿瘤中基因异常甲基化情况. 由此可见, 基因启动子甲基化对于胃癌的早期诊断、高危人群的检测、肿瘤风险的评估具有重要指导意义. 本研究胃癌组织中有36例发生甲基化, 甲基化率为45%, 对应全血中有32例, 甲基化率为40%, 癌旁组织中未检测到发生甲基化. 全血中甲基化的检出率为88.9%. 胃癌组织中与全血中甲基化率差异, 可能是肿瘤细胞尚未脱落入血或是末梢血液肿瘤细胞数量太少, 未达到实验检测水平. 但在癌组织中未检测出甲基化的在全血中也未检测出, 说明全血中甲基化特异性为100%. 因甲基化发生在胃癌的早期, 为提高检出率, 对于高危人群可采取同一患者同时检测多份血样或是短时间内复查血样.
同时, 分析胃癌组织及全血中甲基化情况与临床及病理特征的关系, 显示甲基化率与年龄、性别、肿瘤发生部位及肿瘤浸润深度无关, 与肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移相关. 提示RUNX3基因启动子甲基化情况可用于判断肿瘤的转移情况, 预测胃癌的手术、放化疗疗效等.
胃癌的早期诊断对于改善预后至关重要, 胃癌相关基因启动子异常甲基化是细胞癌变过程中的一个早期事件、频发事件, 且经研究RUNX3对胃癌的特异性高于其他胃癌相关基因, 所以RUNX3有可能成为胃癌早期诊断的特异性基因.
由于DNA甲基化异常不仅可在手术标本中检测到, 还能从各种体液中检测到, 如外周血清/血浆及唾液、痰等, 给检测带来极大便利. 基因的异常甲基化是可逆的过程, 通过甲基化酶抑制剂使沉默的基因重新表达, 成为肿瘤治疗的一种新手段.
Runx基因是近年来发现的一种新型抑癌基因, 与人类多种肿瘤的发生、发展有着极密切的关系. 2002年日本学者Li et al首例发现RUNX3还有调节胃上皮细胞的增生与凋亡平衡的作用, 说明RUNX3的失活与胃癌的发生发展密切相关, 可能是胃癌发生发展的关键性抑癌基因.
王晓艳, 副教授, 中南大学湘雅三医院消化内科.
在多种肿瘤中RUNX3甲基化成为最近几年研究的热点, 采取简单易行的检测手段检测其甲基化成为进一步研究需要解决的问题.
DNA甲基化: 指在DNA甲基转移酶(DNMTS)的介导下, 二核苷酸中胞嘧啶(C)的第5位C原子上的H被S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基取代, 使之变成5-甲基胞嘧啶(m5C)的化学修饰过程. 人类RUNX3位于染色体1p36.1, 是runx家族中最小也是迄今对其研究最少的基因, 全长67 kb, 含有6个外显子和p1、p2两个启动子, 两个启动子富含GC, p2启动子GC含量达到64%, 易发生甲基化变化.
本研究选题较好, 设计合理, 结果可信, 有较好的参考价值.
编辑:李军亮 电编:吴鹏朕
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