干扰素对肝癌细胞胸苷磷酸化酶表达和凋亡的双重影响

摘要

目的: 进一步研究干扰素-α(IFN-α)对人肝癌细胞胸苷磷酸化酶(TP)表达及凋亡的双重影响.

方法:  体外分别用0、10、100、1000、5000、10 000 kU/L IFN-α处理人肝癌细胞SMMC-7721, RT-PCR检测细胞TP mRNA表达水平, 免疫细胞化学方法检测细胞TP蛋白表达变化, 流式细胞仪检测凋亡细胞百分比. 

结果: IFN-α上调SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平, 呈现剂量依赖性. 与未处理组相比, 浓度为5000、10 000 kU/L的IFN-α处理的细胞TP mRNA表达水平显著升高(P<0.05), 而且细胞质内TP蛋白染色强度及阳性染色细胞数均较未处理组的细胞差别明显, 但不同浓度的IFN-α对凋亡细胞百分比的影响不明显, 对照组和浓度10 000 kU/L IFN-α组的凋亡细胞百分比分别为7.19%±2.76%和6.42%±3.66%, 差别无统计学意义.

结论:  一定剂量的IFN-α既能上调肝癌细胞TP表达水平, 又能抵消TP表达上调后抑制细胞凋亡的作用.

关键词: 胸苷磷酸化酶; 干扰素-α; 细胞凋亡; 肝细胞癌

Effects of interferon-alpha on thymidine phosphorylase expression and apoptosis in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells

Yong-Sheng Xiao, Jian Zhou, Jia Fan, Qi-Man Sun, Yan Zhao, Qiong Xue, Zao-Zhuo Shen, Zhao-You Tang

Yong-Sheng Xiao, Jian Zhou, Jia Fan, Qi-Man Sun, Yan Zhao, Qiong Xue, Zao-Zhuo Shen, Zhao-You Tang, Liver Cancer Institute & Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, 200032, China

Supported by: the Doctoral Fund of Ministry of Education of China, No. 20030246052; and the Foundation of Shanghai Municipal Education Commission, No. 02JG05035.

Correspondence to: Professor Jian Zhou, Liver Cancer Institute & Zhongshan Hospital, Fudan University, 180 Fenglin Road, Shanghai 200032, China. zhou.jian@zs-hospital.sh.cn

Received: October 26, 2009
Revised: December 12, 2009
Accepted: December 14, 2009
Published online: December 18, 2009

Abstract

AIM: To investigate the effects of interferon-alpha (IFN-α) on thymidine phosphorylase (TP) expression and apoptosis in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells.

METHODS: The expression of TP mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The expression of TP protein was evaluated by immunocytochemistry. The percentage of apoptotic cells was measured by flow cytometry.

RESULTS: IFN-α upregulated the expression of TP mRNA in a dose-dependent manner in SMMC-7721 cells. IFN-α at a dose of 5000 or 10 000 kU/L induced a 3-fold upregulation of TP mRNA compared to non-treated cells (P < 0.05). Compared with non-treated cells, the intensity of TP staining and the number of TP-positive cells significantly increased in IFN-α treated cells (5000 or 10 000 kU/L). However, no significant difference was found in the percentage of apoptotic cells between IFN-α (10 000 kU/L)-treated cells and non-treated cells (6.42% ± 3.66% vs 7.19% ± 2.76%, P > 0.05).

CONCLUSION: IFN-α at appropriate doses may upregulate the expression of TP mRNA and protein and antagonize TP-induced inhibition of apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells.

Key Words: Thymidine phosphorylase; Interferon-alpha; Apoptosis; Hepatocellular carcinoma

0 引言

胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase, TP)在肿瘤组织内部催化卡培他滨等5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)的前体药物转化为有细胞毒作用的5-FU, 是5-FU前体化疗药物发挥作用的关键酶[1]. 但TP同时能抵抗缺氧[2]、细胞毒性化疗药物[3]诱导的细胞凋亡. 有报道干扰素(interferon, IFN)能够上调肿瘤细胞内TP酶的表达[4-6], 同时一定剂量的IFN又能够诱导肝癌细胞的凋亡[7-9]. 本课题拟进一步研究干扰素-α (IFN-α)对肝癌细胞TP表达及凋亡的双重影响, 为临床联合应用IFN-α与卡培他滨防治肝癌提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌细胞系SMMC-7721引自第二军医大学, 用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液, 在37 ℃、50 mL/L CO₂的培养箱中培养和传代. 干扰素-α(IFN-α): 由罗氏公司上海分公司惠赠.

1.2 方法

1.2.1 不同浓度IFN-α对SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平的影响: 将对数生长期的细胞铺于6孔板, 培养24 h, 弃去原培养液, 分别加入含IFN-α的新鲜培养液, IFN-α的浓度分别为0、10、100、1000、5000、10 000 kU/L, 继续培养24 h, 每个浓度2个孔. 利用半定量RT-PCR方法[10]检测细胞TP mRNA表达水平, TP引物5'-ACAAGGTCAGCCTGGTCCTC-3'(forward)和5'-TCCGAACTTAACGTCCACCAC-3'(reverse), 产生344 bp PCR产物. 内参照β-actin引物5'-TGGGCATGGGTCAGAAGGAT-3'(forward)和5'-AAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'(reverse), 产生991 bp PCR产物. PCR反应参数: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min, 35个循环后72 ℃再延伸10 min. PCR产物于1.7%琼脂糖凝胶电泳, 用Imagemaster VDS system给凝胶照相, 并分析凝胶中的PCR产物. 重复上述实验3次.

1.2.2不同浓度IFN-α对SMMC-7721细胞TP蛋白表达水平的影响: 胰酶消化、收集IFN-α处理的肝癌细胞, 室温, 400 g离心4 min, 弃上清. 加入1 mL PBS, 重悬细胞, 室温, 400 g离心4 min, 弃去大部分上清, 保留约50-100 μL, 重悬细胞, 涂于载玻片上, 滴入鼠抗人TP/PD-ECGF抗体, 置于湿盒中室温孵育60 min, TBS缓冲液冲洗载玻片3次, 滴入EnVisionTM液, 置于湿盒室温孵育30 min. 涂片置新鲜配置的0.04% DAB显色液中(40 mg DAB溶于TBS液70 mL中, 滴加1% H2O2 30 mL)显色2-10 min. 水洗终止反应, 苏木素复染, 盐酸酒精分化, 65 ℃恒温烤片30 min, 二甲苯透明中性树胶封片, NIKON MICROPHOT EPI-FL显微镜观片.

1.2.3 不同浓度IFN-α对SMMC-7721细胞凋亡水平的影响: 将上述不同浓度IFN-α处理的肝癌细胞制成1×109个/L单细胞悬液, 离心, 弃上清, 加入2 mL预冷的柠檬酸固定30 min. 再离心, 弃上清, 加入RNase A, 37 ℃孵育10 min后放入冰浴中, 加入0.5 mL碘化丙锭(50 mg/L)行DNA染色. 流式细胞仪检测IFN-α对细胞凋亡的影响[10]. 重复上述实验3次.

统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行统计分析, P<0.05为差别具有统计学意义.

2 结果

2.1 IFN-α对SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平的影响

SMMC-7721细胞应用IFN-α处理后, TP mRNA表达水平逐渐升高, 具有剂量依赖性. 用浓度5000与10 000 kU/L IFN-α处理细胞, TP mRNA表达水平显著升高, 与未用IFN-α处理组相比, 差别具有统计学意义(P<0.05, 图1).

图1 不同浓度IFN-α对SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平的影响. M: 100 bp Marker; A: 0 kU/L; B: 10 kU/L; C: 100 kU/L; D: 1000 kU/L; E: 5000 kU/L; F: 10 000 kU/L.

2.2 IFN-α对SMMC-7721细胞TP蛋白水平的影响

应用IFN-α后, SMMC-7721细胞TP染色强度逐渐增加, TP阳性染色主要集中在细胞质中, 阳性染色细胞数目逐渐增多, 当IFN-α浓度为5000、10 000 kU/L时, TP染色强度及阳性染色细胞数均较未用IFN的细胞差别明显. IFN-α浓度达10 000 kU/L时, TP染色强度及阳性染色细胞数均达最高水平(图2).

图2 不同浓度IFN-α对SMMC-7721细胞TP蛋白表达水平的影响(×100). A: 0 kU/L; B: 10 kU/L; C: 100 kU/L; D: 1000 kU/L; E: 5000 kU/L; F: 10 000 kU/L.

2.3 IFN-α对SMMC-7721细胞凋亡的影响

应用不同浓度的IFN-α处理SMMC-7721细胞, 随着IFN-α浓度的增加, 细胞的凋亡百分比并未发生明显变化, 浓度0和10 000 kU/L IFN-α的凋亡细胞百分比分别为7.19%±2.76%和6.42%±3.66%, 差别无统计学意义(表1).

表1 不同浓度IFN-α对SMMC-7721细胞凋亡的影响.

IFN-α浓度(kU/L)	凋亡细胞百分比(%)
0	7.19±2.76
10	8.51±4.04
100	7.65±1.99
1000	10.16±4.56
5000	7.70±0.09
10 000	6.42±3.66

3 讨论

5-FU作为多种恶性肿瘤特别是消化系肿瘤(包括肝癌)的主要化疗药物已有40多年历史, 但有效率仅15%. 卡培他滨是一个新型的氟尿嘧啶前体药, 已被美国FDA批准用于紫杉醇抵抗的乳腺癌的临床治疗[11], TP是其发挥作用的关键酶. 由于肿瘤具有异质性, 如何提高TP低表达或无表达的肿瘤对氟尿嘧啶前体药物的敏感性, 是进一步提高其疗效的关键.

目前提高肿瘤组织中TP表达水平的方法包括转染TP cDNA[12], 以提高肿瘤细胞的TP mRNA表达水平, 但受转染效率、表达载体及给药途径等的限制尚不能广泛应用于临床. 另外, 多种细胞因子如IL-1α、TNF-α、IFN-γ、IFN-α都能上调TP的表达或活性[4-6,13].

IFN-α作用于细胞表面I型干扰素受体后, 通过细胞内JAK-STAT信号通路[4], 活化TP基因转录起始位点存在的IFN-α激活反应元件(TP/ISRE)[14], 从而加速TP基因的转录. 本研究结果亦显示, 较高浓度IFN-α作用24 h能使SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平升高3倍, TP染色强度及阳性染色细胞的数量在高浓度IFN-α作用的显著增加. 同时IFN-α还具有稳定TP mRNA的作用. TP mRNA分析表明, 在其mRNA转录末端第40个核苷酸处存在与稳定mRNA的顺式反应元件[15]同源的富含嘧啶核苷酸的序列(92%), IFN-α可能通过影响该嘧啶核苷酸富集序列而稳定TP mRNA.

有报道指出, TP能抑制缺氧[2]和顺铂[3]诱导的细胞凋亡. TP通过抑制Fas蛋白介导的途径抑制细胞凋亡的发生, 且TP的这一功能不受其催化活性的影响[16]. TP抵抗细胞损伤因素诱导的凋亡至少部分受PI3K/Akt信号途径调控[17]. 我们以前的研究表明, 与未转染的细胞相比, 转染TP cDNA后肝癌细胞凋亡被抑制近50%[10]. 本实验却观察到, 随着培养液中IFN-α浓度增加, SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平显著增加, 但细胞凋亡百分比并未出现显著下降, 即IFN-α可能通过促进细胞凋亡的作用, 恰好抵消了TP mRNA表达上调后对细胞凋亡的抑制作用. 结合文献分析, IFN-α促进细胞凋亡的机制可能包括: (1)通过Fas/FasL途径起作用. IFN-α通过上调细胞Fas和/或Fas L的表达[18], 增强细胞对Fas诱导凋亡信号敏感性[19]. (2)自分泌TNF-α, 促进细胞凋亡[20].

卡培他滨等5-FU的前体药物依赖肿瘤组织中的TP酶发挥选择性抗肿瘤作用, 本研究结果表明, 应用一定剂量的IFN-α既能实现上调肝癌细胞TP的表达水平, 又通过其自身所具有的促进细胞凋亡的作用而抵消了TP表达上调后所致的抑制细胞凋亡的作用, 为IFN-α与5-FU前体药联合应用于临床治疗肝细胞癌提供了实验依据.

评论

背景资料

肝细胞癌是全球最常见的恶性肿瘤之一, 每年有50余万新发病例, 其中50%在中国. 目前化疗在肝细胞癌的综合治疗中仍有很大需求, 尤其是出现肺、骨等脏器的转移. 全身应用5-氟尿嘧啶对肝癌的有效率仅约15%.

同行评议者

郝纯毅, 主任医师, 北京肿瘤医院肿瘤外科.

研发前沿

对肿瘤细胞而言, 胸苷磷酸化酶(TP)是一把"双刃剑". 肿瘤细胞TP表达水平上调, 对5-氟尿嘧啶类前体化疗药物敏感性增加, 但TP表达上调后同时具有促进血管生成、抑制细胞凋亡的不良作用. 多种细胞因子能够上调肿瘤细胞TP表达.

应用要点

深入研究IFN-α对TP"双刃剑"作用的影响, 为临床联合应用IFN-α与卡培他滨等5-氟尿嘧啶的前体药物治疗肝细胞癌提供更多的实验依据.

同行评价

本研究选题较好, 设计合理, 具有一定的学术价值.

备注

编辑:李军亮 电编:吴鹏朕

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