临床研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2009. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2009-11-18; 17(32): 3307-3312
在线出版日期: 2009-11-18. doi: 10.11569/wcjd.v17.i32.3307
OY-TES-1在肝细胞癌中的表达及抗体血清学分析
范蓉, 黄巍, 肖绍文, 罗彬, 何少健, 罗国容, 谢小薰
范蓉, 黄巍, 广西中医学院组织学与胚胎学教研室 广西壮族自治区南宁市 530001
肖绍文, 罗彬, 何少健, 罗国容, 谢小薰, 广西医科大学组织学与胚胎学教研室 广西壮族自治区南宁市 530021
范蓉, 博士, 副教授, 主要研究方向为癌-睾丸抗原与肿瘤、生殖的相关性研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30760055; 广西高发疾病研究创新性团队基金资助项目, No. 桂教人[2007-59]号.
作者贡献分布: 范蓉与谢小薰对此文所作贡献均等; 此课题由范蓉与谢小薰设计; 研究过程由范蓉、黄巍、肖绍文、罗彬及何少健完成; 研究所用新试剂和分析工具由罗彬与何少健提供; 数据分析由范蓉、黄巍、肖绍文、罗彬及罗国容完成; 本论文写作由范蓉与谢小薰完成.
通讯作者: 谢小薰, 教授, 530021, 广西壮族自治区南宁市, 广西医科大学组织学与胚胎学教研室. xiexiaoxun@yahoo.com
电话: 0771-5358577
收稿日期: 2009-09-11
修回日期: 2009-10-31
接受日期: 2009-11-02
在线出版日期: 2009-11-18

目的: 了解OY-TES-1在肝细胞癌(HCC)中的表达及其抗体出现情况, 探讨将OY-TES-1用于肿瘤免疫诊疗的可能性.

方法: 利用实时定量PCR和免疫组织化学技术, 从mRNA和蛋白质两个水平研究OY-TES-1在HCC中的表达特点; 采用酶联免疫吸附实验检测HCC患者及正常人血清中相应的抗体, 并对其临床意义做初步的分析.

结果: 经实时定量PCR检测, HCC中OY-TES-1 mRNA阳性率为73.21%(41/56), 癌旁阳性率为64.86%(24/37), 有17对HCC及配对癌旁组织均表达阳性, OY-TES-1 mRNA在HCC及癌旁组织两者的表达阳性率无差异(P>0.05); 在37对HCC及配对癌旁组织中, HCC中OY-TES-1 mRNA水平明显高于对应的癌旁组织, 其差异与病理分级有关(P<0.05). HCC中OY-TES-1蛋白阳性率为40%(4/10). 血清学检测未发现76例正常人和17例肝硬化患者血清中有相应抗体, HCC患者血清抗体阳性率为20%(12/58), OY-TES-1血清抗体的出现与HCC患者的年龄、性别等临床资料无相关.

结论: OY-TES-1在HCC中有较高的表达频率及表达水平, 该蛋白具有较强的免疫原性, 他有望作为用于HCC辅助诊断及免疫治疗的肿瘤抗原.

关键词: 癌-睾丸抗原; OY-TES-1基因; 基因表达; 血清
引文著录: 范蓉, 黄巍, 肖绍文, 罗彬, 何少健, 罗国容, 谢小薰. OY-TES-1在肝细胞癌中的表达及抗体血清学分析. 世界华人消化杂志 2009; 17(32): 3307-3312
OY-TES-1 expression and serum immunoreactivity in hepatocellular carcinoma
Rong Fan, Wei Huang, Shao-Wen Xiao, Bin Luo, Shao-Jian He, Guo-Rong Luo, Xiao-Xun Xie
Rong Fan, Wei Huang, Department of Histology & Embryology, Guangxi Traditional Chinese Medical College, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Shao-Wen Xiao, Bin Luo, Shao-Jian He, Guo-Rong Luo, Xiao-Xun Xie, Department of Histology & Embryology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30760055; and the Innovative Team Foundation for Research on Highly Occurring Diseases in Guangxi, Gui Jiao Ren No. 2007-59.
Correspondence to: Professor Xiao-Xun Xie, Department of Histology & Embryology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. xiexiaoxun@yahoo.com
Received: September 11, 2009
Revised: October 31, 2009
Accepted: November 2, 2009
Published online: November 18, 2009

AIM: To investigate OY-TES-1 expression and serum immunoreactivity in human hepatocellular carcinoma (HCC) and explore the possibility of using OY-TES-1 as a target for immunotherapy and auxiliary diagnosis of HCC.

METHODS: The expression of OY-TES-1 mRNA and protein was detected by real-time PCR and immunohistochemistry, respectively. The presence of serum OY-TES-1 antibody in normal individuals and patients with HCC or hepatocirrhosis was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using purified OY-TES-1 as the antigen. The clinical significance of OY-TES-1 expression and serum immunoreactivity in HCC was then analyzed.

RESULTS: The positive rates of OY-TES-1 mRNA expression in HCC and tumor-adjacent tissue were 73.21% (41/56) and 64.86% (24/37), respectively, showing no significant difference (P > 0.05). The expression level of OY-TES-1 mRNA in HCC tissue was significantly higher than that in tumor-adjacent tissue (P < 0.05). The expression level of OY-TES-1 mRNA was correlated with histological grade of HCC. The positive rate of OY-TES-1 protein expression in HCC tissue was 40% (4/10). The positive rate of serum OY-TES-1 antibody was 20% in HCC patients, while no serum reactivity to OY-TES-1 was detected in 76 normal individuals and 17 patients with hepatocirrhosis. No correlation was found between the presence of OY-TES-1 antibody and clinical and pathological parameters in HCC.

CONCLUSION: OY-TES-1 shows high-level expression and high serum immunoreactivity in HCC and is therefore a potential target for antigen-specific immunotherapy and auxiliary diagnosis of HCC.

Key Words: Cancer-testis antigen; OY-TES-1 gene; Gene expression; Serum
0 引言

2001年, Ono et al[1]通过基因表达系列分析(serial analysis of gene expression, SAGE)技术鉴定出OY-TES-1基因, 由于该基因的mRNA存在于多种肿瘤组织中, 而正常组织仅限于睾丸, 因此,认为OY-TES-1是一种癌-睾丸抗原(cancer testis antigen, CTA). 随后, 虽然一些研究发现OY-TES-1 mRNA并非仅存于睾丸组织, 在许多正常组织也可检测到OY-TES-1 mRNA[2-4]. 然而, 这些研究只是对OY-TES-1 mRNA做定性的研究, 未能反映其mRNA量的差异, 为此, 本课题组进一步对OY-TES-1 mRNA进行定量研究, 我们发现在多数正常组织中OY-TES-1 mRNA的量远低于睾丸组织, 此外, 我们还发现多数正常组织并不表达OY-TES-1蛋白[5]. 同样, Tammela et al也发现在许多正常组织不表达OY-TES-1蛋白[6], 可见在正常组织中OY-TES-1蛋白的表达是限制性的. 而在肿瘤组织中, 现有的研究均一致认同OY-TES-1 mRNA广泛存在多种肿瘤组织, 并在一些类型的肿瘤具有较高的阳性率, 但蛋白水平的研究仅见于卵巢癌[1-3,6]. 虽已有研究提示肝癌可较高频率地表达OY-TES-1 mRNA[1], 但其mRNA量和蛋白的表达目前尚不清楚. 因此, 本研究将利用实时定量聚合酶链反应(qPCR)和免疫组织化学技术, 检测OY-TES-1在广西高发肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达, 并结合抗体血清学分析, 探讨OY-TES-1作为一种CTA用于HCC免疫治疗和辅助诊断的可行性.

1 材料和方法
1.1 材料

用于实时定量RT-PCR检测的组织标本包括56例HCC组织, 其中37例HCC组织存在配对的癌旁组织(距癌灶边缘≥5 cm); 用于免疫组织化学检测的组织标本包括10例HCC组织、4例配对HCC癌旁组织和7例正常肝组织. 用于抗体检测的血清标本包括76例正常人血清、58例HCC、17例肝硬化及4例HCC术后患者血清. 正常人血清来自广西医科大学本科学生的健康体检者, 肿瘤组织及血清标本来自广西医科大学第一附属医院肝胆外科2005-11/2006-06的住院患者, 均经病理学确认.

1.2 方法

1.2.1 实时定量RT-PCR检测: 提取组织总RNA, 逆转录成cDNA. 设计定量PCR引物及探针, 上游引物: 5'-GCGACACCTCCCACAAGAC-3'; 下游引物: 5'-GCCCACCGTACAAATCCAG-3'; 探针: 5'-FAM-CAACCAGGTAGGGTCC-TAMRA-3'. 制备OY-TES-1标准品, 定量PCR检测在iCycler iQTMPCR仪(Bio-Rad)上进行[5]. 以去离子水为阴性对照, 标准品及待测样品均设三个复管, 同一批次进行检测. 根据标准曲线计算每个待测样本基因的拷贝数取其平均数, 以目的基因相对于管家基因的量(OY-TES-1/HPRT)进行待测样品的标准化处理, 确定组织中OY-TES-1 mRNA的相对表达量.

1.2.2 免疫组织化学染色: 常规组织固定, 石蜡包埋, 切片厚5 μm, 切片经脱蜡水化后, 高压修复5 min, 以SP试剂盒染色, 苏木精复染. 步骤按试剂盒说明书操作, 其中sp32/OY-TES-1多克隆抗体(1:2000稀释, 本室制备[7])37 ℃孵育1 h.

1.2.3 ELISA检测: 用碳酸缓冲液(0.05 mmol/L, pH 9.6)稀释MBP/OY-TES-1融合蛋白至浓度为1.0 mg/L[8]. 将稀释好的MBP/OY-TES-1融合蛋白加入酶标板(每孔100 µL), 4 ℃包被过夜. 用PBST(PBS中含0.05% Tween-20), 在室温下洗板3次, 50 g/L脱脂奶于37 ℃封闭1 h, 上待检血清(1:64)于37 ℃孵育1 h, 随后用Biotin-绵羊抗人IgG单克隆抗体(1:10000)于37 ℃孵育1 h, 洗板后加入Avidin-HRP(1:200)37 ℃孵育30 min, 再次洗板加TMB避光显色15 min, 用1 mol/L硫酸终止反应. 酶标仪(南京DJ5032型)测定A450与A630值. 以包被麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)为阴性对照.

统计学处理 应用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析, 样本率的比较用χ2检验, 样本均数的比较参数法用t检验、非参数法用秩和检验, P<0.05有统计学意义.

2 结果
2.1 OY-TES-1 mRNA在组织中的表达

HCC中OY-TES-1 mRNA阳性率为73.21%(41/56), 其癌旁组织的阳性率为64.86%(24/37); 在37例HCC组织及配对的癌旁组织中, HCC及其癌旁组织均为阳性占45.95%(17/37), 均为阴性占8.11%(3/37), HCC为阳性而其癌旁组织为阴性的占27.03%(10/37), OY-TES-1 mRNA在HCC和癌旁组织的阳性率无差异.

从mRNA表达量来看, HCC表达量的中位数为0.7511, 其癌旁组织为0.0929, 两者比较具有统计学差异(P<0.05). 经临床资料分析, OY-TES-1 mRNA表达量与HCC患者的性别、年龄、肿瘤大小、病理分级等HCC临床资料无相关; 癌与癌旁组织的表达量差异与病理分级有关, 肿瘤恶性程度越高, 其表达差异越明显(表1).

表1 HCC中OY-TES-1 mRNA表达水平与临床资料的关系.
HCC组织
癌与配对癌旁组织的差值
nOY表达量1T值nOY表达量T值
性别
男5127.64711863318.863680
女537.2000420.1250
年龄(岁)
≤452929.55177391919.7105328
>452727.37041818.2500
HBV
阳性4828.54172263319.954544
阴性828.2500411.1250
肿瘤大小(cm)
<5927.6667249523.1000115
≥54728.65963218.3594
病理分级
Ⅰ+Ⅱ3325.89397412215.0909371a
Ⅲ+Ⅳ2332.23911524.7333
AFP(μg/L)
<4003026.18338102117.7619330
≥4002631.17311620.6250
癌栓
无3826.31585962518.3800243
有1833.11111220.2917
肝硬化
无1627.6875443719.5000136
有4028.82503018.8833
TNM分期
Ⅰ+Ⅱ1524.93333741116.1818178
Ⅲ+Ⅳ4129.80492620.1923
1平均秩和;
aP<0.05.
2.2 OY-TES-1蛋白组织中的表达

正常肝组织中OY-TES-1蛋白的免疫反应均为阴性. HCC组织中目的蛋白的免疫反应阳性率为40%(4/10). OY-TES-1蛋白主要分布于癌细胞胞质, 部分分布于细胞核; 癌细胞胞质内OY-TES-1蛋白呈均质状, 而细胞间质为阴性. 4例HCC癌旁的肝硬化组织中, 有1例呈蛋白免疫反应阳性, OY-TES-1蛋白仅在一些肝细胞的胞质中, 蛋白呈颗粒状分布, 而胞核和间质为阴性(图1).

图1
图1 OY-TES-1蛋白在HCC及癌旁的肝硬化组织中的表达. A: HCC组织(×20); B: HCC组织(×40); C、F: 阴性对照(免疫前血清, ×40); D: HCC癌旁的肝硬化组织(×20); E: HCC癌旁的肝硬化组织(×40).
2.3 血清抗体筛选

正常人OY-TES-1抗体平均A值为0.131±0.060, 用MBP/OY-TES-1检测了76例正常人血清, 同时以MBP为阴性对照, 所得数据经统计学分析显示两者无差异, 说明检测的正常人血清中无OY-TES-1抗体. 以大于正常人平均吸光度值3个标准差者判为阳性(临界点A450为0.311), 17例肝硬化与4例HCC术后患者血清中均未测到相应抗体, HCC中该抗体的阳性率为20.69%(12/58)(图2). 血清OY-TES-1抗体阳性率与HCC患者的性别、肿瘤大小、AFP含量等临床资料无关.

图2
图2 58例HCC患者血清OY-TES-1抗体检测结果.
3 讨论

HCC是广西地区最常见且死亡率最高的恶性肿瘤, 其免疫治疗的前提是鉴定出特异性表达的肿瘤抗原. 由于血-睾屏障的存在及生精细胞不表达人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)Ⅰ类分子, 因此睾丸是免疫豁免器官, 具有限制性表达特征的CTA成为近期肿瘤抗原研究领域的一大热点, 国外研究小组已将研制的CTA肿瘤疫苗(如NY-ESO-1抗原肽等)试用于临床治疗并取得较好的效果[9-17]. 迄今已发现140多个CTA成员, 由70多个CTA基因家族或基因编码, 并揭示CTA在肿瘤组织中的表达具有以下特点: (1)同一CTA在不同类型肿瘤组织的表达频率不同; (2)不同CTA在同一类型肿瘤组织的表达频率不同; (3)CTA的表达具有"群集性", 即多种CTA可同时在同一类型肿瘤组织中表达. 因此, 在该研究领域中, 一方面不断地利用各种新技术寻找和鉴定更多的CTA, 另一方面则是对已报道的CTA进行深入地研究, 了解其表达特征, 评价这些新发现的CTA用于肿瘤免疫治疗的可能性[18-20]. 目前本研究小组与国内外其他研究小组已先后报道多种CTA(如MAGE、NY-ESO-1、LAGE、GAGE、NY-SAR-35、CT9、CT10和SSX等基因)在HCC中的表达, 其表达阳性率为8.2%-75.2%[21-32].

21世纪初, Ono et al[1]利用SAGE技术, 鉴定出人OY-TES-1基因, 该基因定位在人12号染色体短臂上, 全长9339 bp, 包含10个外显子, 转录单位全长1895 bp, 其开放阅读框架编码543个氨基酸, OY-TES-1蛋白经翻译后修饰, 形成sp32(sperm protein 32). sp32主要是位于精子顶体内, 与精子前顶体蛋白的包装及顶体酶原的浓缩有关, 还参与精子获能和协助单精入卵[33-35].

Ono et al[1]在验证OY-TES-1为CTA时就发现肝癌中该基因mRNA的阳性率为40%(2/5). 本研究结果显示其在HCC的阳性率为73.21%(41/56). 两者结果的差异除了地区、人种与标本例数差别以外, 一方面考虑肿瘤组织类型的不同, 前者肿瘤标本是泛指肝癌, 本研究所用的标本为特定的一种肝癌-HCC, 提示该基因在HCC的表达率可能较其他类型肝癌组织高; 另一方面, Ono et al[1]采用的是普通逆转录PCR, 本研究所采用的检测技术为qPCR, 后者具有更高的灵敏度. 本研究首次研究了HCC中OY-TES-1 mRNA的表达量, 发现HCC组织中的OY-TES-1 mRNA表达量明显高于癌旁组织, 肿瘤恶性程度越高, 其表达差异越明显, 提示OY-TES-1的表达可能与肿瘤的发生、发展有关.

本研究亦首次报道OY-TES-1蛋白在HCC中的阳性表达率为40%(4/10), 低于本研究所检测mRNA表达率. 一方面由于两个水平检测的标本并不是取自同一患者, 尚不能真实地反映HCC中目的基因的核酸与蛋白表达水平之间的差异; 另一方面, mRNA与蛋白表达并不严格相关, 在检测过程中也易受取材标本的大小与位置等限制而出现差异. 本研究发现OY-TES-1蛋白均匀地分布在HCC肿瘤细胞的胞质中, 在肿瘤组织中无明显的异质性. Tammela et al[6]则发现OY-TES-1蛋白在卵巢癌组织中呈明显的异质性, 推测该蛋白分布特点可能与肿瘤类型有关. 由于正常肝组织不表达OY-TES-1蛋白, 因此对于那些表达该蛋白的HCC, 无疑具备了开展HCC肿瘤免疫治疗的前提. 此外, 本研究还发现在1例HCC癌旁的肝硬化组织中, 一些肝细胞胞质可见目的蛋白呈颗粒状, 这些目的蛋白反应阳性的肝细胞是否预示已有癌变尚需进一步明确.

Ono et al[1]曾用重组的OY-TES-1全蛋白进行了抗体血清学检查, 在20例正常人血清中均为阴性反应, 而肝癌患者血清中该抗体的阳性率为11%(10/95). 本研究再次证实OY-TES-1具有免疫原性, 在HCC患者血清中该抗体的阳性率为20.69%(12/58), 正常人及肝硬化患者血清中为阴性, 这可能与肿瘤细胞高表达OY-TES-1蛋白并将其呈递到细胞膜外、或(和)肿瘤细胞坏死暴露胞质蛋白, 从而引起相应的免疫反应有关. 值得注意的是本研究检测了4例HCC术后患者血清, 也未发现OY-TES-1抗体, 因此OY-TES-1抗体与HCC治疗疗效及预后的关系, 尚需作进一步的研究.

评论
背景资料

OY-TES-1是一种限制性表达于正常组织、选择性高表达于肿瘤组织的癌-睾丸抗原, 目前国外研究小组已将研制的CTA肿瘤疫苗(如NY-ESO-1抗原肽等)试用于临床治疗并取得较好的效果, 因此, 有必要了解OY-TES-1在广西高发肿瘤肝细胞癌(HCC)中的表达及其抗体出现情况, 探讨将OY-TES-1用于肿瘤免疫诊疗的可能性.

同行评议者

丁惠国, 主任医师, 首都医科大学附属北京佑安医院肝病消化科

研发前沿

在癌-睾丸抗原研究领域中, 一方面不断地利用各种新技术寻找和鉴定更多的癌-睾丸抗原, 另一方面则是对已报道的癌-睾丸抗原进行深入地研究, 了解其表达特征, 评价这些新发现的癌-睾丸抗原用于肿瘤免疫治疗的可能性.

相关报道

Ono et al研究小组在验证OY-TES-1为CTA时应用普通PCR发现肝癌中该基因mRNA的阳性率为40%(2/5), 检测肝癌患者血清中该抗体的阳性率为11%(10 /95).

创新盘点

目前尚无OY-TES-1在HCC中表达的报道, 本研究从mRNA和蛋白水平进行定性、定量和定位的研究, 了解该基因在HCC中的表达特点, 检测HCC患者及正常人血清中相应的抗体, 并对其临床意义做初步的分析.

应用要点

OY-TES-1在HCC中有较高的表达频率及表达水平, 该蛋白具有较强的免疫原性, 他有望作为用于HCC辅助诊断及免疫治疗的肿瘤抗原.

同行评价

本研究方法可靠, 数据处理正确, 结果可信, 为其他学者在该方面的研究提供一定的警示作用.

编辑: 李军亮 电编: 何基才

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