人类巨细胞病毒UL147基因在临床低传代分离株中的多态性

摘要

目的: 探讨人类巨细胞病毒(HCMV)UL147序列在临床患儿低传代分离株中的多态性及其与临床疾病的关系.

方法: 对23株HCMV临床低传代分离株及2例同年龄组健康儿尿液HCMV-DNA采用PCR方法检测, 阳性健康儿尿液进行HCMV-UL147基因全序列测定及分析.

结果: 25株分离株147 ORF长度为464-480 bp, 序列呈现较高的多态性, 所有研究的标本中没有序列与Toledo完全一致. 序列差异多位于序列的5'端, 二级结构预测表现为2种类型, 在重要的蛋白质功能区氨基酸序列高度保守. 未发现黄疸、小头畸形、先天性巨结肠等不同疾病类型的序列之间的差异.

结论: UL147基因可能在HCMV致病中起一定的作用.

关键词: 人类巨细胞病毒; UL147基因; 多态性

Sequence variability of human cytomegalovirus UL147 genes in clinical isolates

Rong He, Qiang Ruan, Ying Qi, Yan-Ping Ma

Rong He, Qiang Ruan, Ying Qi, Yan-Ping Ma, Virus Laboratory, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30700916.

Correspondence to: Rong He, Virus Laboratory, Shengjing Hospital of China Medical University, 36 Sanhao Street, Heping District, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. her@sj-hospital.org

Received: April 30, 2009
Revised: June 16, 2009
Accepted: June 23, 2009
Published online: August 28, 2009

Abstract

AIM: To explore the sequence variability of human cytomegalovirus (HCMV) UL147 ORF in clinical isolates and its possible associations with HCMV infection.

METHODS: HCMV-UL147 ORF was amplified by PCR assay and sequenced in 23 low-passage isolates and urine from two healthy children. The whole gene sequence of HCMV-UL147 in the urine of healthy children was determined and analyzed.

RESULTS: The length of UL147 ORF of 25 isolates was 464-480 bp. Sequencing analysis showed significant strain-specific variability, and none of the sequences was exactly the same with Toledo. The variation was located in the 5' end of sequence. The prediction of secondary structure demonstrated two types and the amino acid sequences kept highly conservative in the important functional area of protein. In jaundice, microcephaly and Hirschsprung's disease, no sequence differences were found among the disease types.

CONCLUSION: HCMV-UL147 might play a role in HCMV infection and subsequent diseases.

Key Words: Human cytomegalovirus; UL147 gene; Variability

0 引言

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)先天感染是引起新生儿疾病和先天畸形的重要感染因素之一, 可引起黄疸性肝炎、胆道闭锁、先天性巨结肠、小头畸形, 以及智力低下、耳聋等多器官、多系统病变[1]. 关于HCMV先天感染的致畸机制尚不清楚. 有研究表明HCMV在体内存在不同的细胞嗜性, 提示不同临床症状的HCMV分离株的基因结构可能存在差异. Cha et al[2]的研究发现在Toledo等临床低传代分离株中存在一个新的DNA区域, 这个区域至少包括UL133-UL151共19个开放阅读框架(open reading frames, ORFs), 而在实验室株AD169中却不存在这一区域. 这个发现提示这些基因的编码产物可能与HCMV的致病性有关. 本文着重研究HCMV UL147序列在临床患儿低传代分离株中的多态性, 探讨其与病毒临床致病性的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

23株HCMV临床分离株均来自我院1988-1993年期间住院患儿, 患者年龄<14 mo, 其中黄疸患儿15名、小头畸形患儿5名、先天性巨结肠患儿3名. 标本取自1988-1993年的HCMV分离实验, -70℃保存. 并于2000年进行QPCR[3]检测HCMV DNA均为阳性. 2例来自同一地段的同年龄组健康儿尿液, 经QPCR方法检测HCMV DNA阳性, -70℃保存尿标本备用.

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增: (1)取低传代分离株培养上清液0.5 mL, 100℃沸水浴15 min, 室温下离心15 000 r/min, 10 min. 尿液处理采取常规碱裂解法. (2)反应体系50 μL, 循环条件: 95℃ 4 min; 94℃ 45 s, 55℃ 1 min, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃ 10 min. 应用巢式、半巢式PCR对包含UL147 ORF的一段序列(Toledo9752-11449)进行扩增, 引物及序列见表1. (3)电泳检测结果, EB染色, 紫外灯下观察结果.

表1 UL147扩增引物.

引物	序列	核苷酸位置 (Toledo)
147 forward	5'ATCACCAGGACCGAGACGAAT3'	9752
147 reverse	5'CGGTGACAGGGTGTATCGT3'	11 449
147 nested-forward	5'AGCTGCAATCGTCAGGAAG3'	10 093
147 nester reverse	5'TCGGTAGACCAGAAGGGCG3'	10 845

1.2.2 PCR产物纯化及测序: 应用Wizard SV gel and PCR Clean-Up试剂盒对PCR产物进行纯化, 测序由上海联合基因公司完成.

1.2.3 序列分析: 应用DNASTAR、Genedoc等软件进行序列分析.

2 结果

测序结果显示临床分离株UL147序列之间存在高度多态性, 序列被GenBank收录, 序列号为AY788137到AY788146和AY366449到AY366461.

2.1 核苷酸序列比较

对25个来自临床有症状和无症状HCMV感染患儿的标本进行UL147 ORF研究, 所有研究的标本中147 ORF长度在464-480 bp, 没有序列与Toledo完全一致. 6份标本的序列与Toledo株相似, 序列的差异小于20个, 序列同源性为96.7%-97.1%. 其他19个序列与Toledo株的同源性在90.2%-92.3%. 序列变异集中在5'端. 其中4、9、10、15、16、27、29、39、51号标本均于起始位点处缺失3个碱基; 10、14、15、27、29、39号标本于110位(相对于Toledo)有3个碱基缺失; 16号标本与13位、3号标本于62位也分别有3个碱基缺失(图1-2).

图1 25个临床分离株部分核苷酸序列同源性比较, 以Toledo为参考株. J: Jaundice(黄疸); M: Microcephaly(小头畸形); C: Megacolon(巨结肠); MYT, LS: asymptomatic children(无症状感染儿).

图2 25个临床分离株部分核苷酸序列同源性比较, 以Toledo为参考株. J: Jaundice(黄疸); M: Microcephaly(小头畸形); C: Megacolon(巨结肠); MYT, LS: asymptomatic children(无症状感染儿).

2.2 氨基酸序列比较

预测Toledo的UL147ORF编码蛋白长度为160个氨基酸, 研究的25个序列预测147编码蛋白的长度为157-160个氨基酸, 6个标本的氨基酸序列与Toledo的同源性为96.2%-97.5%, 其他19个序列与Toledo的同源性在86.2%-91.2%(图3).

图3 25个临床分离株氨基酸序列同源性比较, 以Toledo为参考株. J: Jaundice(黄疸); M: Microcephaly(小头畸形); C: Megacolon(巨结肠); MYT, LS: asymptomatic children(无症状感染儿).

2.3 预测蛋白质重要功能区结构分析

在所有UL147序列中存在一个保守的CXC化学趋化因子功能域. NCBIPROS数据库预测UL147编码蛋白功能区显示几乎所有的UL147序列中都存在一个CK2磷酸化位点和一个PKC磷酸化位点. 11个序列在第39位氨基酸处增加了一个TYR位点, 5个序列在第24位氨基酸处增加了一个ACP位点, 2个序列在第72位氨基酸处增加了一个MRS位点(图3).

2.4 蛋白质二级结构预测

蛋白质二级结构预测分析, 25个序列的二级结构大致形成2种类型(图4). 其中, 4、10、15、25、27、29、51、LS、39、38号序列之间的二级结构相似, 其他序列的二级结构与Toledo株相似. UL147编码蛋白的亲水性、表位及抗原性预测结果显示25个序列与Toledo株的性质差异不大(图5).

图4 预测UL147蛋白二级结构.

图5 UL147 Toledo株编码蛋白的亲水性及抗原性分析.

3 讨论

HCMV属于疱疹病毒β亚科, 是免疫抑制、器官移植患者的严重致病、致死因素, 是导致骨髓移植失败的重要原因, 也是母婴传播病原体之一. 然而, HCMV的致病机制尚不清楚. 近年来许多学者着手从分子水平对此病毒进行研究, 分析发现UL146、UL147 ORFs编码的蛋白与α化学因子类似[4], 趋化因子是一类小的分泌型趋化细胞因子, 具有共同的结构特征: 在2个半胱氨酸残基间形成二硫键. 根据半胱氨酸的位置和数量的不同分为4种类型: CXC, CC, XC和CX3X, X代表除半胱氨酸外的任何一种氨基酸[5]. TOLEDO的UL146基因在CXC功能区前有ELR残基, 被称为VXCX-1, 有研究证实ELR残基对与IL-8活性和受体的结合非常重要[6]. UL147编码产物被称为vCXC-2, 没有ELR功能区, 只有4个半胱氨酸残基. 具有ELR功能区的趋化因子能趋化中性粒细胞[7], 而没有ELR功能区的趋化因子作用于T和B细胞[8-9].

本实验对25个来自临床有症状和无症状HCMV感染患儿的标本进行UL147 ORF研究, 所有研究的标本中147 ORF长度在464-480 bp, 没有序列与Toledo完全一致. 25个标本测序分析结果显示序列之间存在多态性, 6份标本的序列与Toledo株相似, 序列的差异小于20个, 序列同源性为96.7%-97.1%. 其他19个序列与Toledo株的同源性在90.2%-92.3%. 序列变异集中在5'端. 12个序列存在不同程度的碱基缺失, 但均未引起移码突变.

25个标本中黄疸患儿15名、小头畸形患儿5名、先天性巨结肠患儿3名、同年龄组健康儿2名, 通过对不同病种患者UL147序列分析, 未发现健康儿与患者UL147序列多态性的差异, 也未发现3种不同类型HCMV感染临床疾病与UL147 序列多态性间的关系.

25个临床标本的UL147编码蛋白的亲水性、表位及抗原性与Toledo株的性质差异不大, 所有序列均具有一个保守的CXC化学趋化因子功能域, 而化学因子在感染中与中性粒细胞的作用相关, 提示HCMV-UL147可能在病毒感染中起重要作用. 为下一步针对UL147基因功能研究提供了可靠的证据.

同时, 研究发现, UL147编码蛋白在PKC、CK2位点也是高度保守, 提示此区域在病毒作用机制中起重要作用.

与Toledo相比, 有11个序列在蛋白第39为氨基酸处增加了一个TYR位点, 5个序列在第24位氨基酸处增加了一个ACP位点, 2个序列在第72位氨基酸处增加了一个MRS位点. 这些位点是否在UL147蛋白功能中起作用, 如何起作用尚需进一步研究.

评论

背景资料

1996年, Cha et al对HCMV实验室株AD169株和Towne株及一株命名为Toledo的临床株进行了核酸序列比较, 发现Towne株含有4个、Toledo株含有19个在AD169株不存在的基因, 且Towne株中的4个新基因只有一个基因与Toledo株的基因相同(UL147), 表明HCMV此段序列为高度可变区. Toledo株的19个新基因被分别命名为HCMV UL133-UL151, 作者推测, 此19个基因可能在病毒的复制、潜伏和对宿主的致病性方面起重要作用, 其中一些基因具有编码糖蛋白的能力, 可能在体内病毒对细胞受体的吸附方面起重要作用, 决定病毒的组织细胞嗜性.

同行评议者

樊红, 副教授, 东南大学医学院发育与疾病相关基因教育部重点实验室

研发前沿

目前有关19个基因多态性的研究主要来源于器官移植患者和艾滋病患者, 进一步选取不同感染类型标本作为研究对象, 将使多态性更加全面.

相关报道

Penfold et al证实, UL146和UL147的产物与α趋化因子序列相似, 其中UL146产物与病毒对中性白细胞的吸附有关, 与在感染中病毒的扩散和巨细胞包涵体病患者病毒在中性白细胞持续存在有关. UL147编码产物被称为vCXC-2, 没有ELR功能区, 只有4个半胱氨酸残基. 具有ELR功能区的趋化因子能趋化中性粒细胞, 而没有ELR功能区的趋化因子作用于T和B细胞有关.

创新盘点

自1996年发现HCMV实验室株缺少临床分离株Toledo含有的UL133-UL151基因后的几年来, 共有2篇论文研究了其中的UL147基因, 本研究选取引起先天感染不同系统畸形的分离株, 及无症状感染儿分离株作为研究对象, 研究更有说服力.

应用要点

本研究选择按照病毒感染的组织细胞不同进行严格分类的HCMV分离株和无症状感染儿HCMV分离株, 进行UL147基因的多态性研究, 渴望在分子水平阐明不同临床分离株致病性差异的机制, 寻找具有临床诊断和治疗价值的基因或基因变化, 为HCMV先天感染的临床诊断和防治提供资料.

同行评价

本文研究HCMV UL147序列在临床患儿低传代分离株中的多态性, 探讨其与病毒临床致病性的关系, 对HCMV感染引起新生儿疾病和先天畸形的病因和机制的研究和临床分析具有重要的指导意义.

备注

编辑:李军亮 电编:何基才

参考文献

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2.	Cha TA, Tom E, Kemble GW, Duke GM, Mocarski ES, Spaete RR. Human cytomegalovirus clinical isolates carry at least 19 genes not found in laboratory strains. J Virol. 1996;70:78-83.  [PubMed]  [DOI]

3.	何 蓉, 刘 兰青, 吕 绳敏, 阮 强. 荧光定量PCR方法检测婴儿尿液中人类巨细胞病毒基因的含量. 中华儿科杂志. 2001;12:739-742.  [PubMed]  [DOI]

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7.	Penfold ME, Dairaghi DJ, Duke GM, Saederup N, Mocarski ES, Kemble GW, Schall TJ. Cytomegalovirus encodes a potent alpha chemokine. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:9839-9844.  [PubMed]  [DOI]

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