临床经验 Open Access
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世界华人消化杂志. 2009-08-18; 17(23): 2421-2425
在线出版日期: 2009-08-18. doi: 10.11569/wcjd.v17.i23.2421
HBV相关性肾炎与HBV基因变异的相关性
李霜青, 安惠霞, 赵玉先, 姜国涛
李霜青, 安惠霞, 赵玉先, 哈尔滨医科大学附属第二医院肾内科 黑龙江省哈尔滨市 150086
姜国涛, 天津市第五中心医院肾内科 天津市 300450
基金项目: 黑龙江省自然科学基金资助项目, No. 080620.
作者贡献分布: 李霜青、安惠霞及赵玉先对此文所作贡献均等; 安惠霞是通讯作者，此课题由安惠霞指导设计; 研究过程由李霜青与赵玉先操作完成; 姜国涛参与部分实验研究包含提供患者等, 所用新试剂与分析工具由安惠霞提供; 数据分析由李霜青完成; 本论文写作由李霜青、安惠霞及赵玉先完成.
通讯作者: 安惠霞, 教授, 黑龙江省哈尔滨市, 哈尔滨医科大学附属第二医院肾内科. an_huixia@sina.com
电话: 0451-86605256
收稿日期: 2009-05-21
修回日期: 2009-07-05
接受日期: 2009-07-20
在线出版日期: 2009-08-18

目的: 探讨乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)易感性与HBV基因变异的关系.

方法: 选取HBV-GN患者19例为试验组, 慢性HBV感染者22例为对照组, 应用基因测序技术检测HBV血清C基因区、CP区基因位点的变异.

结果: CP区中nt1727和nt1773位点试验组的变异率显著高于对照组(100% vs 50.0%, 47.4% vs 13.6%, 均P<0.05). nt1762/1764联合变异率在2组中的差别无统计学意义(P>0.05). C基因区中nt2011变异率试验组显著低于对照组(10.5% vs 40.9%, P<0.05). nt2005、nt2201、nt2245和nt2290变异率在2组中的差别无统计学意义(P>0.05).

结论: HBV-GN易感性可能与HBV的基因变异有关.

关键词: 乙型肝炎病毒; 肾炎; 基因变异
引文著录: 李霜青, 安惠霞, 赵玉先, 姜国涛. HBV相关性肾炎与HBV基因变异的相关性. 世界华人消化杂志 2009; 17(23): 2421-2425
Correlation of different hepatitis B virus gene mutations with the development of hepatitis B virus-associated glomerulonephritis
Shuang-Qing Li, Hui-Xia An, Yu-Xian Zhao, Guo-Tao Jiang
Shuang-Qing Li, Hui-Xia An, Yu-Xian Zhao, Department of Nephrology, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Guo-Tao Jiang, Department of Nephrology, the 5th Central Hospital, Tianjin 300450, China
Supported by: the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. 080620.
Correspondence to: Professor Hui-Xia An, Department of Nephrology, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China. an_huixia@sina.com
Received: May 21, 2009
Revised: July 5, 2009
Accepted: July 20, 2009
Published online: August 18, 2009

AIM: To investigate the correlation of different hepatitis B virus gene mutations with the development of hepatitis B virus-associated glomerulonephritis (HBV-GN).

METHODS: Nineteen HBV-GN patients and 22 chronic hepatitis B (CHB) patients were included in the study. Gene mutations in the core gene coding region and core promoter/precore region of HBV were detected by complete genome sequencing.

RESULTS: In the core promoter/precore region, the prevalences of the nt 1727 and nt 1773 mutations were significantly higher in HBV-GN patients than in CHB patients (100% vs 50.0% and 47.4% vs 13.6%, respectively; both P < 0.05). No significant differences were noted in the prevalences of the nt 1762/1764 mutations between the two groups of patients (P > 0.05). In the core gene coding region, the prevalence of the nt 2011 mutation was significantly lower in HBV-GN patients than in CHB patients (10.5% vs 40.9%, P < 0.05). No significant differences were noted in the prevalences of the nt 2005, nt 2201, nt 2245 and nt 2290 mutations between the two groups of patients (P > 0.05).

CONCLUSION: Some hepatitis B virus gene mutations may be correlated with the development of HBV-GN.

Key Words: Hepatitis B virus; Glomerulonephritis; Gene mutation
0 引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染在我国很常见, 据WHO统计, 乙型肝炎患者及携带者约占人群的15%. HBV感染可引起多种肝外病变, 乙型肝炎病毒相关性肾炎(hepatitis B virus-associated glomerulonephritis, HBV-GN)是常见的肝外病变之一. 自从1971年 Combes et al[1]首次报道1例乙型肝炎病毒相关性膜性肾病以来, 引起各国学者们的重视与研究. HBV是一种高度变异的病毒, 由于病毒变异往往引起抗原性和致病性的改变, 所以认为HBV感染在临床上出现的不同疾病与病毒变异有关. 目前大量的临床资料报道了HBV基因突变对肝脏疾病的临床表现、疾病发生发展及预后起着决定性的影响[2]. 但是对HBV基因变异与HBV-GN易感性的相关性研究国内外报道较少. 本实验是应用基因测序技术检测HBV C区、C基因启动子(c gene promoter, CP)区基因变异, 旨在探讨HBV-GN易感性与HBV基因突变之间的关系, 以期寻找导致HBV-GN的HBV基因突变易感位点. 从病毒学方面进一步探讨该病的病因及发病机制.

1 材料和方法

1.1 材料

收集2006-10/2007-10我院门诊和住院患者41例, HBV-GN患者19例, 为实验组, 其中男16例, 女3例, 年龄12-54(平均年龄33.63±5.42)岁. 诊断符合1989-10北京HBV-GN专题座谈会上的诊断标准[3]. 慢性乙型肝炎患者22例, 为对照组, 其中男16例, 女6例, 年龄18-57(平均年龄30.43±4.78)岁. 诊断符合第10次全国病毒性肝炎及肝病学术会议讨论修订的诊断标准, 均为无血缘关系的黑龙江地区汉族人, 经血清学检测排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒混合感染.

1.2 方法

1.2.1 实验室检查: 乙型肝炎五项、肝功能、肾功能测定、尿常规、肾活检、HBV DNA定量.

1.2.2 HBV DNA基因变异位点的检测: (1)病毒基因组DNA提取: 血清标本100 μL用蛋白酶K和裂解缓冲液消化, 酚法提取. (2)PCR引物: 根据GenBank数据库中HBV的全基因组序列, 利用Primer Premier 5.0软件设计引物, 上游引物序列及位置nt1652-1671(5'-ACATAAGAGGA CTCTTGGAC-3', 20 bp), 下游引物序列及位置nt2439-2459(5'-ACTAACATTGAGATT CCCGAG-3', 21 bp), 扩增807 bp产物, 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成. (3)PCR: 50 μL反应体积中含10×反应缓冲50 μL, MgCl2(25 mmol/L) 30μL, 4 dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL, 2种引物(10 μmol/L)各2.5 μL, Taq DNA多聚酶(5 U/mL)0.25 μL, 加水至40 μL. 反应条件: 94℃预变性3 min, 继而94℃ 0.5 min、55℃ 0.5 min、72℃ 1 min, 共30个循环, 最后72℃延伸5 min. (4)DNA 序列测定:用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物; 纯化产物由invitrogen公司测序.

统计学处理 计数资料采用χ2检验, 计量资料采用t检验, 所有统计分析均以SPSS13.0软件处理.

2 结果

2.1 HBV-GN与乙型肝炎HBV CP和C基因区的变异率

CP区变异在HBV-GN组的总检出率为100%(19/19), 乙型肝炎组为68.2%(15/22), HBV-GN组变异的检出率高于乙型肝炎组(χ2 = 5.216, P<0.05). C区变异在HBV-GN组的总检出率为94.7%(18/19), 乙型肝炎组为90.9%(20/22), HBV-GN组C区变异的检出率与乙型肝炎组差别无统计学意义(χ2 = 0.000, P>0.05).

2.2 HBV-GN与乙型肝炎HBV CP区变异的关系

HBVnt1727处A→G变异在HBV-GN组总检出率高达100%(19/19), 乙型肝炎为50.0%(11/22), HBV-GN组变异的检出率显著高于乙型肝炎组(χ2 = 7.714, P<0.01). nt1773处C→A变异在HBV-GN组的总检出率为47.4%(9/19), 乙型肝炎为13.6%(3/22), HBV-GN组变异的检出率高于乙型肝炎组(χ2 = 5.604, P<0.05). HBV nt1762T/1764A联合变异HBV-GN组总检出率26.3%(5/19), 乙型肝炎为36.4%(8/22), HBV-GN组和乙型肝炎组nt1762/nt1764联合变异的检出率相比无显著差异(χ2 = 0.475, P>0.05, 表1).

表1 HBV-GN组及乙型肝炎组患者HBV CP区变异位点的比较 n(%).
分组n1727变异A→G1762/1764联合变异AG→TA1773变异C→A
HBV-GN组 1919(100.0)5(26.3)9(47.4)
乙型肝炎组2211(50.0)8(36.4)3(13.6)
χ2值 12.9830.4755.604
P值 <0.01>0.05<0.05

2.3 HBV-GN与乙型肝炎HBV C基因区变异的关系 (1)nt2011处变异在HBV-GN组总检出率为10.5%(2/19), 乙型肝炎组为40.9%(9/22), 乙型肝炎组变异的检出率显著高于HBV-GN组(P<0.05). (2)nt2201变异率在HBV-GN组和乙型肝炎组的差别无统计学意义(84.2% vs 68.2%). 其中, 变异位点T→C在HBV-GN组有16例, 乙型肝炎组有11例, 差别有统计学意义(84.2% vs 50.0%). (3)nt2290变异率在HBV-GN组和乙型肝炎组的差别无统计学意义(89.5% vs 77.3%). 其中, 变异位点C→T在HBV-GN组有16例, 乙型肝炎组有11例, 差别有统计学意义(84.2% vs 50.0%). (4)nt2005、nt2245变异率在HBV-GN组和乙型肝炎组的差别无统计学意义(68.4% vs 50.0%、78.9% vs 81.8%, 均P>0.05, 表2-3).

表2 HBV-GN组及乙型肝炎组患者HBV C区变异比较 n(%).
分组n2005变异2011变异2201变异2245变异2290变异
HBV-GN组 19 13(68.4)2(10.5)16(84.2)15(78.9)17(89.5)
乙型肝炎组2211(50.0)9(40.9)15(68.2)18(81.8)17(77.3)
χ2值1.4254.7940.6840.0000.383
P值 >0.05<0.05>0.05>0.05>0.05
表3 乙型肝炎肾炎组及乙型肝炎组患者HBV C区变异位点的比较 n(%).
分组n2005变异T→A2011变异G→C2201变异T→C2245变异C→T2290变异C→T
HBV-GN组19 12(63.2)2(10.5)16(84.2)15(78.9)16(84.2)
乙型肝炎组229(40.9)4(18.2)11(50.0)14(63.6)11(50.0)
χ2值2.0200.0625.3061.1545.306
P值>0.05>0.05<0.05>0.05<0.05

2.4 HBV-GN肾组织的免疫组织化学特点 所收集病例中, 肾活检病理结果比较以HBsAg与HBeAg沉积最为多见, 检出率分别为47.4%、52.6%. 其次为HBcAg沉积, 检出率为31.6%.

2.5 HBV-GN与乙型肝炎患者血HBV DNA定量和生化指标的比较

HBV DNA在HBV-GN组高于乙型肝炎组(P<0.05), 但肝功的改变在2组中的差别无统计学意义(表4).

表4 HBV-GN组及乙型肝炎组患者血生化指标的比较(mean±SD).
分组ALT(U/L)AST(U/L)HBV DNA定量(copies/mL)
HBV-GN组78±19.249±14.04.28±0.98×104
乙型肝炎组80±18.450±12.32.97±0.68×104
t值0.3400.2444.62×102
P值>0.05>0.05<0.05
3 讨论

HBV是一种高变异的病毒, 其突变率高达1010-1011点突变/d, 比其他DNA病毒高出10倍以上. 病毒侵入机体后, 在机体内受自然压力、人体免疫力和药物治疗的影响, 常出现病毒变异. 发生变异的病毒可引起病毒复制水平的改变, 从而导致其抗原性和致病性改变, 所以认为HBV感染在临床上出现的不同疾病谱与病毒变异有关. 随着HBV变异研究的不断深入, 变异所引起的生物学意义也不断被人们所认识. 此外, HBV常见的变异位点: 基本核心启动子(basal core promoter, BCP)、前C区和核心区基因的变异. 故本实验研究HBV-GN与HBV C区、CP区基因突变的相关性.

CP位于HBV基因组nt1643-1849, 即位于X开放读码框的3'末端和前C/C开放读码框的5'末端重叠区, CP调控HBV的复制, 控制前CmRNA和CmRNA(前基因组RNA)的转录, 前者为合成HBeAg的模板, 后者为合成HBcAg、多聚酶及逆转录的模板. CP的变异使CmRNA转录明显减少, 前基因组mRNA转录增加, 导致HBeAg合成减少, 肝细胞内HBcAg、DNA聚合酶及HBV DNA的复制增加[4-5]. 不少学者进行了体外实验, 发现CP区变异后, HBV前基因组RNA转录效率提高2-3倍, 病毒包装效率提高10倍之多. 已有研究表明: HBV基因变异与HBV感染的结局有密切关系. Kaneko et al[6]分析7例重肝患者HBV基因序列, 结果有5例HBV CP区发生突变, 说明CP区基因突变可导致HBV DNA的复制增加. 本实验的结果显示, 在CP区中, HBV-GN组的总变异检出率为100%(19/19), 乙型肝炎组为68.2%(15/22), HBV-GN组总变异的检出率高于乙型肝炎组(P<0.05). nt1727 A→G(P<0.01)和nt1773 C→A变异率HBV-GN组高于乙型肝炎组(P<0.05). 其中, nt1727在HBV-GN组全部发生突变, 由AAG→AGG, 显著高于乙型肝炎组(P<0.01). 提示了具有nt1727、nt1773基因突变者患HBV-GN的危险性大. 结果提示HBV-GN的发病与nt1727、nt1773基因突变相关. HBV-GN与突变后的CP致HBV DNA复制增加关系需进一步进行研究.

C区位于HBV基因组nt1814-2456, 长约638 bp, C基因区可转录形成315 kb mRNA, 和前基因组mRNA. 后者大部分翻译、合成HBcAg(含183 个氨基酸残基), 小部分被包装成核心颗粒, 充作反转录的模板. 其编码的产物HBcAg带有T、B细胞识别的表位. C基因产物的中、前段发生聚积变异多见. 这种聚积变异, 反映了B细胞、T细胞及其亚群识别和结合的表位可能有差异, 同时也反映了C蛋白所受免疫攻击的程度. 在对乙型肝炎的临床研究中发现, C基因区多位点突变, 可使转录, 合成的HBcAg发生变异, 影响细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的识别, 助长了HBV免疫逃避, 不利于病毒的清除, 导致HBV持续感染[7]. Ehata et al[8]报告对30例HBV慢性感染者进行血清学HBV DNA检测, 20例慢性肝炎患者中有15例HBV C基因序列在84-101位的编码区发生变异(该区为TCL识别位点序列区), 这15例均为慢活肝和肝硬化. 说明C区的基因突变可导致导致HBV持续感染. 本实验中, C基因区中, HBV-GN组C区总变异的检出率与乙型肝炎组差别无统计学意义. nt2201 T→C和nt2290 C→T变异率HBV-GN组高于乙型肝炎组(84.2% vs 50.0%), 差别有统计学意义, 而变异位点nt2011在HBV-GN组则显著低于乙型肝炎组(P<0.05), 这提示具有nt2201 T→C和nt2290 C→T的患者患HBV-GN的危险性大, HBV变异位点nt2201 T→C和 nt2290 C→T与HBV-GN的发病可能有相关性.

王朝晖 et al[9]对338例经肾穿刺证实的肾炎患者病毒血清学特点进行分析, 在血HBsAg(+)的肾炎患者中, HBV相关肾炎发病与体内HBV DNA复制程度密切相关. 而本实验结果中可见HBV DNA在HBV-GN组高于乙型肝炎组(P<0.05), 但肝功的改变在两组中无显著差别, 这与上述报道相符合.

本实验结果证实, HBV CP区、C区基因多位点变异与HBV-GN的发病具有相关性, 但是否HBV-GN与HBV基因突变导致HBV持续感染、病毒复制增加尚需大量的临床研究以进一步证实. 在HBV-GN的病例中, 以HBsAg与HBeAg沉积最为多见[10], 其次为HBcAg沉积.

总之, HBV-GN易感性与HBV基因变异可能有相关性, 这有助于深入了解HBV变异株在HBV-GN发病机理中的作用以及临床上通过对乙型肝炎患者进行HBV常见变异位点进行检测,来判断是否增加了发生HBV-GN的危险性. 此外, 可寻找药物作用的新靶点, 开发新的抗乙型肝炎药, 为HBV-GN的治疗提供新的方向. 但鉴于样本量及地区性的限制, 本研究结果还需要大规模多中心的流行病学研究进一步证实. 此外, 由于肝炎的发生取决病毒与宿主两方面, 任何引起宿主免疫反应的改变都可能引起病情的变化, 有的变异株可在某一宿主引起HBV-GN, 而在另一宿主却引起慢性肝炎或重肝, 故HBV-GN的发生除病毒变异外, 还可能与病毒亚型、宿主免疫状态、细胞因子和组织相容性白细胞抗原有关.

评论
背景资料

乙型肝炎病毒(HBV)感染在我国很常见, 据WHO统计, 乙型肝炎患者及携带者约占人群的15%. HBV感染可引起多种肝外病变, 乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)是常见的肝外病变之一.

同行评议者

金瑞, 教授, 首都医科大学附属北京佑安医院消化科.

研发前沿

HBV是一种高度变异的病毒, 由于病毒变异往往引起抗原性和致病性的改变, 所以认为HBV感染在临床上出现的不同疾病与病毒变异有关.

创新盘点

本实验应用基因测序技术检测HBV C区、C基因启动子(CP)区基因变异, 旨在探讨HBV-GN易感性与HBV基因突变之间的关系, 以期寻找导致HBV-GN的HBV基因突变易感位点. 从病毒学方面进一步探讨该病的病因及发病机制.

同行评价

本研究新颖性尚可, 对临床医师有一定的参考价值.

编辑:李军亮 电编:吴鹏朕

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