肝细胞生长因子对肝细胞癌细胞系SMMC-7721黏着斑激酶的影响

摘要

目的: 探讨肝细胞生长因子(HGF)对黏着斑激酶(FAK)、Src表达及活性的影响以及PI3K在该过程中的作用.

方法: LY294002预处理阻断PI3K的活性、HGF处理SMMC-7721后检测FAK和Src的表达、磷酸化及在细胞内的分布. 应用免疫印迹技术检测FAK、Src的表达及磷酸化, 免疫荧光技术检测FAK在SMMC-7721细胞中的分布.

结果: HGF(50 μg/L)可以促进FAK Y397位点的磷酸化, 对FAK的表达没有影响. 应用PI3K抑制物LY294002处理后, FAK Y397的磷酸化水平显著降低. HGF处理后, FAK主要位于细胞边缘, 呈簇状分布, 应用PI3K抑制物, FAK在细胞内弥散分布. HGF处理后, Src激酶和Src Y416的磷酸化水平明显增加, 而经LY294002处理后, Src激酶与Src Y416的磷酸化水平明显降低.

结论: 肝细胞癌中, HGF以PI3K依赖性的方式促进FAK和Src的活化.

关键词: 肝细胞癌; 肝细胞生长因子; 黏着斑激酶; PI3K

Effects of hepatocyte growth factor on the expression and phosphorylation of focal adhesion kinase in SMMC-7721 cells

Rong-Jian Su, Zhen Li, Hong-Dan Li, Hui-Juan Song, Liu-Fang Cheng

Rong-Jian Su, Hong-Dan Li, Hui-Juan Song, Key Laboratory of Molecular Cell Biology and New Drug Development of the Education Department of Liaoning Province, Scientific Experimental Center, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

Zhen Li, Liu-Fang Cheng, Department of Gastroenterology, General Hospital of the Chinese PLA, Beijing 100583, China

Supported by: the Doctor Scientific Startup Foundation of Liaoning Province, No. 20061074; and the Key Laboratory Foundation of the Department of Education of Liaoning Province, No. 2008S142.

Correspondence to: Professor Rong-Jian Su, Key Lab of Molecular Cell Biology and New Drug Development of the Education Department of Liaoning Province, Scientific Research Center, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China. rongjiansu@hotmail.com

Received: April 14, 2009
Revised: June 15, 2009
Accepted: June 23, 2009
Published online: July 18, 2009

Abstract

AIM: To investigate the effects of hepatocyte growth factor (HGF) on the expression and phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) and Src kinase, and explore the role of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) in this process.

METHODS: After hepatocellular carcinoma cells (SMMC-7721) were pretreated with LY294002 and stimulated with HGF, the phosphorylation status of FAK at Y397 and Src at Y416 were analyzed by Western blot, and the distribution of FAK was observed by immunofluorescence.

RESULTS: HGF (50 μg/L) was able to promote the phosphorylation of FAK at Y397, but had no effect on the expression of FAK. Pretreatment of cells with LY294002 (an inhibitor of PI3K) significantly decreased the phosphorylation of FAK at Y397. After HGF treatment, FAK was mainly clustered in the periphery of hepatocellular carcinoma cells. In contrast, FAK was diffused throughout the cells after pretreatment with PI3K inhibitor. HGF treatment could significantly raise the phosphorylation levels of Src kinase and Src-Y416 while pretreatment with LY294002 could significantly decrease the phosphorylation levels of Src kinase and Src-Y416.

CONCLUSION: HGF is able to promote the activation of FAK and Src in a PI3K-dependent manner.

Key Words: Hepatocellular carcinoma; Hepatocyte growth factor; Focal adhesion kinase; PI3K

0 引言

肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤, 其发病率呈逐年上升的趋势, 居于全球第5位, 死亡率居第3位仅次于肺癌和胃癌[1]. 肝细胞生长因子(hepatocellular growth factor, HGF)是间质细胞(如成纤维细胞、巨噬细胞等)分泌的一种多效应生长因子, 对细胞增殖、细胞迁移、细胞黏附等多种生物学行为具有调节作用[2]. 目前已经明确HGF可以与细胞膜表面的c-Met结合, 导致c-Met的自身磷酸化[3], 激活下游的信号传导过程. 我们以前的研究表明HGF可以促进肝细胞癌的侵袭和转移, 并且明确HGF对肝细胞癌侵袭和转移作用与PI3K有关[4]. 本文进一步对肝细胞癌细胞系SMMC-7721中HGF对黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的分布及磷酸化水平进行研究, 并进一步探讨PI3K在该过程中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

肝细胞癌细胞系SMMC-7721为中国医科大学发育生物学教研室慧赠. HGF、LY294002购于Sigma公司. FAK和磷酸化FAK抗体(pY397)购于Biosource公司, Src及SrcY416抗体购于Cellsignal公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及HGF处理: 人肝细胞癌细胞系SMMC-7721培养于含100 mL/L胎牛血清、100 g/L青霉素、100 g/L链霉素的DMEM培养液中; 当细胞生长至培养瓶底面的70%-80%, 血清饥饿3 h, 加入HGF(终浓度50 μg/L)处理12 h[4].

1.2.2 LY294002处理: 细胞培养方法同上, 当细胞生长至培养瓶底面的70%-80%, 血清饥饿3 h, 加入LY294002(终浓度10 μmol/L)预处理1 h, PBS漂洗3次, 加入HGF(终浓度50 μg/L)处理12 h.

1.2.3 免疫荧光实验: 胰蛋白酶消化细胞, PBS漂洗3次, 用无血清培养液稀释至2×10⁸个/L, 接种于用10 mg/L的纤粘连蛋白处包被的盖玻片上, 继续培养12 h, 取出盖玻片, PBS漂洗, 37 mL/L甲醛固定30 min, 2 mL/L Triton-X-100通透5 min, 100 mL/L BSA封闭30 min, 一抗室温温育1 h, PBS漂洗, 二抗室温孵育1 h, PBS漂洗, 甘油封片, 荧光显微镜下观察.

1.2.4 免疫印迹: 用细胞刮刀收集收集细胞, PBS漂洗, RIPA缓冲液冰上裂解30 min, BCA法测定蛋白含量. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转膜, 1 g/L BSA封闭, 一抗(FAK, FAK Y397, SRC, SRC Y416)室温孵育3 h, 二抗室温孵育1 h, BCIP/NBT显色.

2 结果

2.1 PI3K对FAK Y397磷酸化的影响

HGF(50 μg/L)可以促进FAK Y397位点的磷酸化, 对FAK的表达没有影响. 应用PI3K抑制物LY294002处理后, FAK Y397的磷酸化水平显著降低(图1). 这些说明在肝细胞癌细胞中PI3K参与FAK活化过程的调节, 抑制PI3K能够抑制FAK的活化.

图1 PI3K对FAK Y397磷酸化的影响. A: HGF能够促进FAK Y397的磷酸化, PI3K抑制物LY294002可以阻断HGF对FAK Y397磷酸化的促进作用; B: HGF不能增加FAK的表达, LY294002对FAK的表达也没有影响; C: Actin的表达一致, 蛋白含量一致.

2.2 PI3K对FAK细胞内分布的影响

HGF处理后, FAK主要位于细胞边缘, 呈簇状分布, 应用PI3K抑制物, FAK在细胞内弥散分布(图2). 这些说明PI3K对FAK在肝细胞癌细胞中的定位具有调节作用.

图2 PI3K对FAK细胞内分布的影响. A: 未做处理的SMMC-7721; B: HGF处理后的SMMC-7721; C: 经LY294002预处理后加入HGF的SMMC-7721. 可见HGF能够导致FAK在细胞内的重新分布, 主要位于细胞边缘, 呈簇状分布; PI3K抑制物处理后FAK弥散分布于细胞内, 簇状结构消失.

2.3 PI3K对Src激酶活化的影响

HGF处理后, Src激酶和Src Y416的磷酸化水平明显增加, 而经LY294002处理后, Src激酶与Src Y416的磷酸化水平明显降低. 这些结果说明HGF可以促进Src激酶的活化(图3).

图3 PI3K对Src激酶活化的影响. A-B: 分别显示了Src和Src Y416的表达情况, 可见HGF能够促进Src激酶和Src Y416的活化; 但经PI3K预处理后, HGF所致的Src激酶和Src Y416的活化明显受到抑制. C: 显示3组细胞的Actin表达相同, 表示蛋白含量上样相同.

3 讨论

FAK是整合素信号传导途径中的关键酪氨酸激酶, 对于肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要的调节作用[5-6]. 大量研究表明FAK分别通过磷酸化Y397和Y576/577位点激活FAK[7-8]. FAK激活后, 其磷酸化的Y397与Src激酶结合, 形成FAK/SRC复合物而引起Paxillin和cas磷酸化[9-10], 后二者通过接头蛋白Crk和Grb2激活Ras途径的下游激酶MAPK[11], 进而改变细胞行为. HGF通过与c-Met结合后能够激活PI3K[12], 继而引起一系列的细胞内信号传导. 本实验基于前文HGF促进细胞的侵袭和转移[4], 进一步研究HGF对FAK, Src激酶的影响及PI3K在其中的作用.

由免疫印迹结果可见, HGF(50 μg/L)处理后的SMMC-7721细胞FAK的表达不变, 而磷酸化FAK Y397的表达增加, 说明HGF能够促进FAK活化, 但却不增加FAK的表达. 应用PI3K抑制物LY294002处理后, FAKY397的磷酸化水平显著降低. 由此, 说明HGF引起的FAK Y397磷酸化增加, 是通过PI3K激酶起作用的, PI3K激酶对于HGF刺激FAK的磷酸化具有调节作用. 免疫荧光结果可见, HGF处理后的SMMC-7721, FAK的表达主要位于细胞边缘, 呈簇状分布, 细胞内分布很少, 而经PI3K抑制物LY294002处理后, FAK主要是在细胞内弥散分布, 边缘很少, 与对照组的细胞FAK的分布相似. 说明在肝细胞癌细胞中PI3K参与FAK活化过程的调节, 影响其在细胞内的分布, PI3K对HGF引起的FAK的活化具有抑制作用.

HGF处理后, Src激酶和Src Y416的磷酸化水平均明显增加, 而经LY294002处理后, Src激酶与Src Y416的磷酸化水平也均明显降低. 这说明HGF可以促进Src激酶的活化, PI3K激酶对于HGF引起的Src磷酸化具有调节作用. 由此可见, HGF与细胞膜表面的c-Met结合, 导致c-Met的自身磷酸化, 激活PI3K, 进而导致磷酸化的FAK Y397与Src激酶结合, 激活下游的信号通路, 导致肝癌细胞的整合素, E-cad, N-cad的表达改变, 进而改变细胞的侵袭、转移、黏附等行为.

总之, HGF引起的肝癌细胞侵袭和转移能力增强是一个复杂生物的过程[12-14]. 其通过活化PI3K激酶促进FAK Y397的磷酸化, 引起肝癌细胞内FAK分布改变. HGF所引起的肝癌细胞的侵袭和转移能力增强, 黏附能力降低的机制与PI3K有关.

评论

背景资料

肝癌是一种恶性肿瘤, 他的发病率逐年增高. 肝细胞生长因子是间充质细胞分泌的多效应因子, 其与c-Met结合, 激活下游的信号通路. 已经明确HGF可以促进肝细胞癌的侵袭和转移, 并且发现其对肝细胞癌侵袭和转移的作用与PI3K有关.

同行评议者

潘兴华, 副主任医师, 中国人民解放军成都军区昆明总医院病理实验科

研发前沿

HGF能够促进很多肿瘤细胞的侵袭和转移, 对于其机制的研究一直受到众多研究者的重视, 其中信号通路的研究更成为本领域研究热点. 然而, 其具体机制的研究一直未果. 故而, 明确HGF促进肝细胞癌侵袭和转移的机制, 抑制肝细胞癌侵袭和转移成为亟待解决的问题.

相关报道

目前研究认为, HGF对于肝细胞癌侵袭和转移的机制是通过多信号通路实现的, PI3K和MAPK信号通路在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥着重要的作用, FAK和Src能够调节肿瘤的侵袭和转移.

创新盘点

本文以肝细胞癌SMMC-7721为研究对象, 用HGF和PI3K抑制剂LY294002处理, 观察其对于FAK和Src的影响, 并且探讨HGF发挥作用的机制. 结果发现HGF通过PI3K信号通路发挥其影响FAK和Src的作用, 促进SMMC-7721的侵袭和转移作用.

同行评价

本研究选题新颖, 设计合理, 结果可靠, 具有一定的参考价值.

备注

编辑:李军亮 电编:何基才

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