丹参酮ⅡA介导p38MAPK信号转导诱导人肝癌细胞凋亡

摘要

目的: 研究丹参酮ⅡA诱导人肝癌细胞凋亡和凋亡相关基因表达的p38MAPK信号转导通路, 揭示其抗肝癌的部分机制.

方法: 4、8、16 mg/L丹参酮ⅡA分别作用人肝癌SMMC-7721细胞48 h后, 免疫荧光染色观察细胞凋亡情况; 琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞特征性DNA条带; 流式细胞仪法(Flow cytometry, FCM)检测细胞凋亡和细胞周期; 荧光定量PCR检测Fas和Caspase-3基因mRNA的表达水平; 并比较阻断p38MAPK信号通路后丹参酮ⅡA对肝癌细胞凋亡和Fas和Caspase-3基因mRNA的表达.

结果: 丹参酮ⅡA作用48 h后, 荧光显微镜下观察到经Hoechst染色的典型凋亡细胞. 琼脂糖凝胶电泳可见凋亡细胞DNA呈规律性的梯状条带. 4、8、16 mg/L浓度丹参酮ⅡA作用人肝癌细胞后的细胞凋亡率分别为12.83%±1.51%, 17.86%±2.70%和29.24%±7.58%, 与对照组6.30%±2.08%比较均有显著性差异(P<0.01); 阻断p38MAPK信号通路后, 凋亡率和G₀/G₁期细胞比例明显降低(P<0.01). 8 mg/L丹参酮ⅡA作用人肝癌细胞48 h后Fas mRNA和Caspase-3 mRNA的表达明显上升; 阻断p38MAPK信号通路后, 丹参酮ⅡA作用人肝癌细胞的Fas mRNA和Caspase-3 mRNA的表达明显下降.

结论: 丹参酮ⅡA能诱导人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡, 阻滞肝癌细胞于G₀/G₁期. 通过p38MAPK信号转导通路上调Fas、Caspase-3 mRNA的表达可能是其诱导肝癌细胞凋亡的重要机制.

关键词: 丹参酮ⅡA; 肝癌; 凋亡; p38MAPK; 信号转导; Fas; Caspase-3

Tanshinone ⅡA induces apoptosis of liver cancer cells via p38MAPK signal transduction

Yan Wang, Qi Li, Zhong-Ze Fan, Jue Sun, Yi-Qin Wang, Rui-Hai Liu, Hong Gao

Yan Wang, Qi Li, Zhong-Ze Fan, Jue Sun, Hong Gao, Department of Oncology, Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China

Yi-Qin Wang, School of Basic Medical Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

Rui-Hai Liu, Department of Food Science, Cornell University, Ithaca, New York 14853, USA

Supported by: the Shanghai Traditional Chinese Medicine Scientific Research Fund From Shagnhai Health Municipal Bureau No. 2004012A; and the Shanghai 3rd Leading Academic Discipline Project, No. S30302.

Correspondence to: Qi Li, Department of Oncology, Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China. lzwf@hotmail.com

Received: November 28, 2008
Revised: December 17, 2008
Accepted: December 22, 2008
Published online: January 18, 2009

Abstract

AIM: To study the effect of TSⅡA on inducing apoptosis via p38MAPK signal transduction in human liver cancer.

METHODS: The apoptosis rate was assessed in liver cancer cells by immunofluorescence after treatment with TSⅡA, and gel electrophoresis was used to observe the typical DNA ladder. Apoptosis and cell cycle were determined by flow cytometry (FCM), the mRNA expression level of Fas and Caspase-3 were detected using fluorescent quantitation PCR. The mRNA expression level of Fas and Caspase-3 was detected after treatment with blocking agent.

RESULTS: After SMMC-7721 cells were treated with 4, 8, 16 mg/L of TSⅡA for 48 h, typical morphologic changes of apoptosis were observed by fluorescence microscopy using Hoechst staining. There were regular DNA ladders under agarose gel electrophoresis. after treatment with 4, 8, 16 mg/L of TSⅡA for 48 h, the cell apoptotic rates were respectively 12.83%± 1.51%, 17.86% ± 2.70% and 29.24% ± 7.58%, showing significant difference (P < 0.01). After signal transduction pathway of p38MAPK was blocked, the cell apoptotic rates and cell ratio of G₀/G₁ phase were decreased significantly (P < 0.01). The mRNA expression of the Fas, Caspase-3 gene were increased obviously after treatment with 8 mg/L TSⅡA for 48 h; whereas they were decreased significantly when the transduction pathway was blocked.

CONCLUSION: TSⅡA could induce the apoptosis of human liver cancer cells and arrest in G₀/G₁ phase. The mechanism might be related to up-regulated expression of Fas, Caspase-3 mRNA by regulating p38MAPK signal transduction pathway.

Key Words: TanshinoneⅡA; Hepatoma; Apopotosis; p38MAPK; Signal transduction; Fas; Caspase-3

0 引言

丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA, TSⅡA)为中药丹参主要有效成分之一, 最早用于治疗心脑血管疾病. 近年研究发现, TSⅡA对肝癌、胃癌等多种肿瘤细胞具有显著的杀伤作用, 引起了人们的广泛关注[1-2]. 国内已有的研究证实TSⅡA能够诱导体外培养的细胞凋亡. 我们最近的动物实验研究也表明TSⅡA能够显著的抑制小鼠肝癌瘤体生长, 延长生存期, 其抗肝癌的主要机制是诱导细胞凋亡[3-4]. 但其诱导细胞凋亡机制尚不明确. 本研究从细胞内信号转导角度对TSⅡA诱导人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡及凋亡相关基因进行研究, 探讨p38MAPK信号通路在TSⅡA诱导人肝癌细胞凋亡中的作用, 为揭示TSⅡA治疗肝癌的机制提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌细胞株SMMC-7721购于中科院上海细胞研究所; TSⅡA购自西安冠宇生物技术有限公司, 纯度≥98%(批号: 200512001). p38MAPK特异性的抑制剂SB203580购于美国Serologllcais公司; 总RNA抽提试剂RNAiso Reagent、荧光定量PCR试剂日本TaKaRa公司; 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、Fas和Caspase-3上下游引物和探针由上海闪晶分子生物科技有限公司设计并合成, 其中5'端标记上报告荧光基团FAM(6-carboxy-fluo-rescein-phosphoramidite), 3'端标记上淬灭荧光基团TAMRA(carboxy-tetramethyl-rhodamine). 引物序列如下: Fas上游引物: 5'-GGTTCATCCAGTCGCTTTGT-3', 下游引物: 5'-AATTCTGTTGCCACCTTTCG-3'; Caspase-3上游引物: 5'-TGGCCAATTCTGCCATAAGC-3', 下游引物: 5'-TGGTTCATCCCCATTGACTGT-3'; 内参GAPDH作为对照, 上游引物: 5'-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3', 下游引物: 5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3'. 氯仿、异丙醇、无水乙醇均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 Hoechst染色观察细胞凋亡形态: SMMC-7721细胞常规培养, 取对数生长期细胞制备细胞悬液, 以每孔1×10⁵个细胞接种于6孔培养板中, 在37℃、50 mL/L CO₂的培养箱中培养过夜. 加不同浓度TSⅡA(浓度为4、8、16 mg/L)作用48 h后按说明书固定、染色、封片. 荧光显微镜下激发波长350 nm, 发射波长460 nm观察.

1.2.2 凋亡细胞DNA梯度分析: 不同浓度TSⅡA(4, 8, 16 mg/L)作用SMMC-7721细胞48 h后, 收集细胞, 用PBS离心洗涤, 加入细胞裂解液, 37℃过夜, 酚/氯仿纯化, 无水乙醇沉淀DNA, 4℃过夜, 最后将沉淀溶解在TE缓冲液中, 18 g/L琼脂糖凝胶电泳2 h, 紫外灯下观察.

1.2.3 流式细胞仪检测: 人肝癌SMMC-7721细胞常规培养至对数生长期, 换无血清培养液培养12 h使细胞周期同步化, 设4、8、16 mg/L TSⅡA组, 20 μmol/L的p38MAPK抑制剂SB203580组, 20 μmol/L的p38MAPK抑制剂SB203580+8 mg/L丹参酮ⅡA组, 培养48 h后, 制成单细胞悬液, 离心弃上清, 沿管壁缓慢加入700 mL/L预冷(-20℃)乙醇固定, 上机检测前RNA酶消化, 再加入PI染色液, 4℃避光30 min. FCM检测凋亡率及细胞周期.

1.2.4 荧光定量PCR: 将TSⅡA稀释至终浓度为8 mg/L, 处理人肝癌细胞48 h后加胰酶消化离心收集细胞. 将各组细胞分别加入2 mL RNAiso, 按说明书提取总RNA, 1 μL总RNA在20 μL体系中按照标准程序进行反转录, 反应条件: 37℃ 15 min, 85℃ 5 s. Fas、Caspase-3和GAPDH基因荧光定量PCR反应体系均如下: Premix EX Taq^TM 10 μL, Rox Reference Dye 0.4 μL, 上下游引物各0.4 μL, 荧光探针0.8 μL, dH₂O 6 μL, cDNA 2 μL, 20 μL体系, 反应条件如下: (1)预变性: 95℃ 10 s, (2)变性: 95℃ 5 s, (3)退火, 延伸: 60℃ 31 s, 40个循环, 数据采用ABI 7300 SDS Software分析. 相对mRNA表达 = 2^-△Ct, △Ct值 = 靶基因Ct值-GAPDH Ct值. 以GAPDH作为内参照, 同时以SMMC-7721细胞作为基准, 各组细胞mRNA的表达量表示成SMMC-7721细胞的N倍. N = 样品表达量/基准表达量 = 2^-样本△Ct/2^-基准△Ct, 每组均做3个样本, 取均数.

统计学处理 采用PEMS3.1医学统计软件包进行统计分析. 采用计量资料以mean±SD表示. 多样本比较采用单因素方差分析, Student's t, Rank sum test, SNK检验方法进行统计分析, 组间比较用t或t'检验. P<0.05具有统计学差异.

2 结果

2.1 荧光显微镜观察细胞的形态学变化

荧光显微镜下对照组SMMC-7721细胞(未加药物处理)细胞核呈弥漫均匀的蓝色荧光染色, 未见凋亡荧光染色细胞. 4、8、16 mg/L剂量的TSⅡA作用于人肝癌SMMC-7721细胞后, 均可见凋亡细胞, 表现为胞核或胞质内可见浓染致密的颗粒荧光及块状荧光(DNA荧光碎片, 图1).

图1 荧光显微镜细胞的形态学(Hoechst染色). A: 正常对照组; B: 8 mg/LTSⅡA组.

2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳

以不同浓度TSⅡA(4、8、16 mg/L)作用SMMC-7721细胞48 h观察DNA断裂. 4 mg/L TSⅡA作用SMMC-7721细胞, 未见DNA梯状条带, 8 mg/L以上剂量的出现典型的DNA梯状条带(图2).

图2 DNA琼脂糖凝胶电泳图. M: Marker; 1: 16 mg/L TSⅡA组; 2: 8 mg/L TSⅡA组; 3: 4 mg/L TSⅡA组.

2.3 TSⅡA对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响

4、8、16 mg/L浓度的TSⅡA作用人肝癌细胞后的细胞凋亡率明显高于对照组的凋亡率(12.83%, 17.86%, 29.24% vs 6.30%), 并出现凋亡典型性特征峰. 对照组G₀/G₁期细胞所占百分率为58.79%. 4, 8, 16 mg/L浓度的TSⅡA作用后G₀/G₁期细胞所占百分率分别为75.35%, 80.65%, 86.84%, 16 mg/L浓度的TSⅡA作用后出现的G₀/G₁期阻滞最为明显. 结果显示随着TSⅡA剂量的增加, 细胞的凋亡率上升, G₀/G₁期细胞比例增加(表1, 图3).

表1 丹参酮ⅡA对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响 (mean±SD, %).

分组	凋亡率	细胞周期
		G0/G1	S	G2/M
对照组	6.30±2.08	58.79±1.52	32.15±1.50	9.06±1.10
TSⅡA(4 mg/L)	12.83±1.51d	75.35±0.66d	17.52±1.73	7.13±1.08
TSⅡA(8 mg/L)	17.86±2.70bd	80.65±0.56bd	12.37±1.75	6.96±1.54
TSⅡA(16 mg/L)	29.24±7.58bdf	86.84±0.79bdf	8.20±1.66	4.96±1.39

^bP<0.01 vs TSⅡA组(4 mg/L);

^dP<0.01 vs 对照组;

^fP<0.01 vs TSⅡA组(8 mg/L).

图3 流式细胞图. A: 正常对照组; B: TSⅡA(4 mg/L); C: TSⅡA(8 mg/L); D: TSⅡA(16 mg/L); E: SB203580组; F: SB203580+(TSⅡA 8 mg/L).

2.4 p38MAPK信号通路在TSⅡA诱导肝癌细胞凋亡中的作用

与对照组相比, 抑制剂SB203580组的细胞凋亡率(6.30% vs7.48%)和G₀/G₁期细胞所占百分率(58.79% vs 58.75%)均无明显差异(P>0.05), TSⅡA组作用人肝癌细胞后凋亡率显著提高(6.30% vs 17.86%, P<0.01)并且G₀/G₁期细胞阻滞明显(58.79% vs 80.65%, P<0.01); 阻断p38MAPK信号转导通路后TSⅡA作用人肝癌细胞后凋亡率和G₀/G₁期细胞所占百分率明显降低(P<0.01). 提示TSⅡA通过肝癌细胞内p38MAPK信号转导途径诱导细胞凋亡调控细胞周期(表2, 图3).

表2 丹参酮ⅡA对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响 (mean±SD, %).

分组	凋亡率	细胞周期
		G0/G1	S	G2/M
对照组	6.30±2.08	58.79±1.52	32.15±1.50	9.06±1.10
TSⅡA(8 mg/L)	17.86±2.70d	80.65±0.56d	12.37±1.75	6.96±1.54
SB203580	7.48±1.40b	58.75±2.37b	32.92±0.44	8.32±2.31
SB203580+TSⅡA(8 mg/L)	11.63±2.82bdf	69.10±0.59bdf	22.17±0.06	8.73±0.04

^bP<0.01 vs TSⅡA组(8 mg/L);

^dP<0.01 vs 对照组;

^fP<0.01 vs 其他各组.

2.5 p38MAPK信号通路对TSⅡA诱导肝癌细胞凋亡Fas、Caspase-3 mRNA的影响

荧光定量PCR结果显示, TSⅡA作用人肝癌细胞48 h后Fas、Caspase-3 mRNA的表达明显上调(P<0.01), 分别为正常细胞的15.9倍、24.3倍; 阻断p38MAPK信号通路后, Fas、Caspase-3 mRNA的表达明显下调(P<0.01, 图4).

图4 p38MAPK信号通路在丹参酮ⅡA对人肝癌细胞Fas、Caspase-3表达的影响. ^bP<0.01.

3 讨论

Ide et al研究认为, 肿瘤生长迅速的原因是由于肿瘤细胞增殖较快以致失去控制, 而增殖较快是由于肿瘤细胞的细胞周期较短[5-6]. 近年研究发现情况并非如此, 因为绝大多数肿瘤细胞的细胞周期, 不仅不比他们相应正常细胞短, 而是相同或更长[7-8]. 正常细胞在G₁进入S期、G2进入M期处有控制点, 若细胞DNA出现不正常, 细胞周期可在该处被阻滞; 若细胞DNA的损害较轻, 可通过内切酶等修补后再继续前进; 若DNA损害严重, 不能被修补, 则通过基因调控下的细胞凋亡而自毁. 而肿瘤细胞则不具备这种控制作用, DNA异常的细胞仍能繁殖. 因此, 肿瘤增殖较快的原因是由于肿瘤细胞的无限制增殖, 且细胞的死亡相对或绝对减少所致. 所以根据这些因素, 肿瘤的治疗可采用诱导细胞凋亡疗法、限制肿瘤细胞进入细胞周期以及在某一细胞周期特异地将其杀死或诱导其向正常分化的诱导分化疗法[9].

肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖失控的结果, 也是由于细胞凋亡受阻, 即细胞增殖与凋亡的失衡决定了肿瘤的生长速率. 除了大剂量化疗、放疗可能引起细胞坏死外, 一般抗癌药物、激素制剂、放疗等的作用机制之一, 都是通过诱导各自敏感的细胞发生凋亡来达到治疗目的. 凋亡不仅直接影响着机体组织的正常发育、分化与死亡, 并且在肿瘤治疗中的作用也已受到极大的重视[10-11].

经过多年研究, 人们已鉴定出了构成凋亡途径的多种成分, 揭示细胞凋亡是一个十分复杂的过程. 然而, 此复杂过程也表现出了一系列早期事件的特征模式, 这些特征模式因细胞所受刺激的不同而异, 随后细胞便进入有一系列被称为Caspase的半胱氨酸蛋白酶参与的共同通路[12]. 该共同通路最终导致DNA断裂及与凋亡相关的形态学改变. 已知激活Caspase-3是线粒体-细胞色素c途径、死亡配体、受体途径、颗粒酶B途径的共同通路[13-14]. 激活执行Caspase的关键步骤与细胞色素c有关, 他是线粒体的一个组成部分, 参与呼吸链的组成. 细胞色素c是非细胞抽提物中激活某一关键的过程Caspase/Caspase-3(CPP32/apopain/Yama)的一个必须因素, 并可在HeLa细胞中导致细胞核裂解. 用强效的促凋亡试剂星型孢菌素处理HeLa细胞可以导致细胞色素c从线粒体中释放到胞质中, 并可诱导不同类型的细胞凋亡. Fas(又称CD95或Apol)是一种细胞表面受体, 属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)家族, 他与其配体FasL结合后可以介导细胞凋亡[15].

p38MAPK信号通路是MAPKs蛋白激酶(mitogen activated protein kinase)家族的主要成员之一, 他是丝氨酸/酪氨酸激酶, 丝氨酸/酪氨酸残基可被磷酸化, 细胞外多种应激原都可引起细胞内蛋白激酶的连锁反应, 从而影响细胞的基因转录、蛋白合成和细胞表面受体表达等生物效应[16]. 最近研究表明p38MAPK的活化是诸多抗癌药引起肿瘤细胞凋亡必需的[17-19], 原因可能与细胞增殖分化状态及应激刺激的不同有关. 目前普遍认为p38MAPK至少通过以下途径调控凋亡: (1)增强c-myc表达: 通过激活p38MAPK, 提高IRES介导的c-myc基因转录水平, 诱导细胞凋亡; (2)磷酸化p53: p38MAPK可在体外磷酸化人类P53蛋白的第389位丝氨酸残基, 阻断p38MAPK信号通路能抑制这一过程; (3)参与Fas/FasL介导的凋亡: 在诱导肿瘤细胞凋亡时, 检测到Fas/FasL的表达, 同时亦见p38MAPK活性增强, 提示其介导的凋亡信号转导有p38MAPK通路参与; (4)激活c-jun和c-fos,c-jun基因启动子区包含一个MEF2C位点, p38MAPK能诱导MEF2C激活, 增强c-jun的转录活性, 诱导细胞凋亡; (5)在通过刺激Bax流入线粒体而导致细胞凋亡的过程中, p38MAPK的活化起到关键作用.

我们在实验中发现TSⅡA作用人肝癌细胞后, 荧光显微镜下观察到经Hoechst染色的典型凋亡细胞; 琼脂糖凝胶电泳可见凋亡细胞DNA呈规律性的梯状条带; PI染色流式细胞仪检测出现明显的肝癌细胞凋亡(P<0.01), G₀/G₁期细胞比例相对增多(P<0.01), 阻断p38MAPK信号转导通路后, 凋亡率和G₀/G₁期细胞比例明显降低(P<0.01). TSⅡA作用人肝癌细胞后, Fas、Caspase-3 mRNA的表达明显上调(P<0.01), 阻断p38MAPK信号通路后, Fas、Caspase-3 mRNA的表达明显下调(P<0.01). 提示TSⅡA治疗肝癌的机制与诱导肝癌细胞凋亡、阻滞肝癌细胞于G₀/G₁期有关, 通过p38MAPK信号转导上调Fas、Caspase-3 mRNA是TSⅡA诱导肝癌细胞凋亡的重要机制之一. 本实验显示TSⅡA具有较好的诱导肝癌细胞凋亡的作用, 在治疗肝癌方面具有较好的应用前景.

评论

背景资料

丹参酮ⅡA是中药丹参的有效成分之一, 近年研究发现, 丹参酮ⅡA对肝癌等多种肿瘤细胞具有显著的杀伤作用, 已成为肿瘤治疗的一个新靶点. 本研究组在动物实验研究中发现丹参酮ⅡA能够显著抑制小鼠肝癌瘤体生长, 延长生生存期, 其抗癌主要机制是诱导细胞凋亡.

同行评议者

唐文富, 副主任医师, 四川大学华西医院中西医结合科

研发前沿

随着分子生物学技术的发展, 信号转导及表达调控机制成为当今肿瘤研究中的热点. 如能从细胞内信号转导角度深入研究丹参酮ⅡA诱导肝癌细胞凋亡的机制, 将会为肝癌的治疗提供新的途径.

相关报道

国内外有关报道提示丹参酮ⅡA对多种肿瘤细胞具有显著的杀伤作用. 国内已有的研究证明丹参酮ⅡA能够诱导体外培养的细胞凋亡, 但对丹参酮诱导肝癌细胞凋亡的具体机制尚缺乏报道.

应用要点

本文研究了丹参酮ⅡA诱导人肝癌细胞凋亡的有效浓度和剂量关系, 探讨了其治疗作用的分子机制, 为丹参酮ⅡA治疗肝癌提供了理论依据.

名词解释

MAPK级联: 细胞内的主要信息传递系统, 可将细胞外信息传递至细胞核中, 从而介导细胞产生各种反应. 其中p38 MAPK信号途径是MAPK家族中的重要组成部分, 经外界刺激应激而激活, 故又称为MAPK应急信号通路, 其在全身炎性反应、细胞凋亡、休克、肿瘤转移、耐药等方面具有十分重要的作用.

同行评价

本研究阐明了丹参酮ⅡA诱导人肝癌细胞Smmc-7721凋亡的一个机制, 具有重要研究前景.

备注

编辑:李军亮 电编:吴鹏朕

参考文献

1.	Zhong ZH, Chen WG, Liu YH, Li QX, Qiu Y. [Inhibition of cell growth and induction of apoptosis in human hepatoma cell line HepG2 by tanshione IIA]. Zhongnan Daxue Xuebao Yixueban. 2007;32:99-103.  [PubMed]  [DOI]

2.	Zhou L, Chan WK, Xu N, Xiao K, Luo H, Luo KQ, Chang DC. Tanshinone IIA, an isolated compound from Salvia miltiorrhiza Bunge, induces apoptosis in HeLa cells through mitotic arrest. Life Sci. 2008;83:394-403.  [PubMed]  [DOI]

3.	Li Q, Wang Y, Feng N, Fan Z, Sun J, Nan Y. Novel polymeric nanoparticles containing tanshinone IIA for the treatment of hepatoma. J Drug Target. 2008;16:725-732.  [PubMed]  [DOI]

4.	李 琦, 王 炎, 范 忠泽, 冯 年平, 高 虹, 南 艺蕾, 倪 雷, 鲍 文磊, 隋 华. 丹参酮ⅡA及其纳米粒诱导肝癌细胞凋亡及对p38 MAPK、TGF-β信号蛋白表达的影响. 肿瘤. 2008;28:8-12.  [PubMed]  [DOI]

5.	Ide T. [Mechanism of cell proliferation--cell cycle, oncogenes, and senescence]. Yakugaku Zasshi. 2006;126:1087-1115.  [PubMed]  [DOI]

6.	Dash BC, El-Deiry WS. Cell cycle checkpoint control mechanisms that can be disrupted in cancer. Methods Mol Biol. 2004;280:99-161.  [PubMed]  [DOI]

7.	Ribatti D, Vacca A. The role of microenvironment in tumor angiogenesis. Genes Nutr. 2008;3:29-34.  [PubMed]  [DOI]

8.	Zhao P, Zhong W, Ying X, Yuan Z, Fu J, Zhou Z. Manganese chloride-induced G0/G1 and S phase arrest in A549 cells. Toxicology. 2008;250:39-46.  [PubMed]  [DOI]

9.	Johansson M, Persson JL. Cancer therapy: targeting cell cycle regulators. Anticancer Agents Med Chem. 2008;8:723-731.  [PubMed]  [DOI]

10.	Lee SK, Kim HN, Kang YR, Lee CW, Kim HM, Han DC, Shin J, Bae K, Kwon BM. Obovatol inhibits colorectal cancer growth by inhibiting tumor cell proliferation and inducing apoptosis. Bioorg Med Chem. 2008;16:8397-8402.  [PubMed]  [DOI]

11.	汤 睿, 朱 正纲. 凋亡途径与肿瘤治疗. 世界华人消化杂志. 2008;16:2469-2472.  [PubMed]  [DOI]

12.	Salvesen GS, Riedl SJ. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 2008;615:13-23.  [PubMed]  [DOI]

13.	Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R, Wang X. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell. 1996;86:147-157.  [PubMed]  [DOI]

14.	Yang X, Stennicke HR, Wang B, Green DR, Jänicke RU, Srinivasan A, Seth P, Salvesen GS, Froelich CJ. Granzyme B mimics apical caspases. Description of a unified pathway for trans-activation of executioner caspase-3 and -7. J Biol Chem. 1998;273:34278-34283.  [PubMed]  [DOI]

15.	张 红英, 李 锦毅, 张 建永. Fas、FasL及Caspase-3在维甲酸诱导胃癌细胞凋亡中的作用. 世界华人消化杂志. 2008;16:3255-3260.  [PubMed]  [DOI]

16.	邱 建武, 郭 薇, 申 丽娟. p38MAPK在肝细胞癌中的研究进展. 世界华人消化杂志. 2008;16:503-509.  [PubMed]  [DOI]

17.	Hui L, Bakiri L, Stepniak E, Wagner EF. p38alpha: a suppressor of cell proliferation and tumorigenesis. Cell Cycle. 2007;6:2429-2433.  [PubMed]  [DOI]

18.	Chiacchiera F, Simone C. Signal-dependent regulation of gene expression as a target for cancer treatment: inhibiting p38alpha in colorectal tumors. Cancer Lett. 2008;265:16-26.  [PubMed]  [DOI]

19.	Bradham C, McClay DR. p38 MAPK in development and cancer. Cell Cycle. 2006;5:824-828.  [PubMed]  [DOI]