临床经验 Open Access
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世界华人消化杂志. 2009-07-08; 17(19): 2000-2004
在线出版日期: 2009-07-08. doi: 10.11569/wcjd.v17.i19.2000
癌-睾丸抗原SSX基因在肝细胞癌中的表达及临床意义
张小静, 范蓉, 何少健, 罗彬, 李颀, 罗国容, 谢小薰
张小静, 新乡医学院基础医学院组织学与胚胎学教研室 河南省新乡市 453003
范蓉, 广西中医学院组织学与胚胎学教研室 广西壮族自治区南宁市 530021
何少健, 罗彬, 李颀, 罗国容, 谢小薰, 广西医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室, 广西壮族自治区南宁市 530021
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30760055; 广西高发疾病研究创新性团队基金资助项目, No. 桂教人[2007-71]号; 河南省教育厅自然科学研究计划基金资助项目, No. 2008B310006; 新乡医学院高学历人才科研启动项目基金资助项目, No. 2006G010.
作者贡献分布: 张小静与谢小薰对此文所作贡献均等; 此课题由张小静、范蓉与谢小薰设计; 研究过程由张小静、范蓉、罗彬、李颀及何少健完成; 研究所用新试剂及分析工具由范蓉与李颀提供; 数据分析由张小静、何少健、罗彬、李颀及罗国容完成; 本论文写作由张小静与谢小薰完成.
通讯作者: 谢小薰，教授，530021, 广西壮族自治区南宁市, 广西医科大学基础, 医学院组织学胚胎学教研室. xiexiaoxun@yahoo.com
电话: 0771-5358577
收稿日期: 2009-04-21
修回日期: 2009-05-18
接受日期: 2009-05-25
在线出版日期: 2009-07-08

目的: 检测癌-睾丸抗原SSX1-5 mRNA在肝细胞癌(HCC)组织中的表达, 探讨其用于HCC免疫治疗的可能性.

方法: 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术, 检测61例HCC组织及52例配对的HCC癌旁组织中SSX1-5 mRNA, 结合临床相关指标进行统计学分析. 随机抽取PCR阳性产物进行DNA测序.

结果: SSX1、SSX2、SSX4和SSX5 mRNA在HCC中的表达率分别为42.6%(26/61)、8.2%(5/61)、39.3%(24/61)和6.6%(4/61); 未检测到SSX3的表达. 在癌旁组织中, 未检测到SSX1-5 mRNA; HCC组织中, 至少表达1个SSX基因者达50.8%(31/61); 表达2个或2个以上者达32.8%(20/61), 表达3个或3个以上者达9.8%(6/61), 同时表达4个者达3.3%(2/61). SSX的表达与临床相关指标关系的分析结果显示: 门静脉癌栓形成与SSX1的表达、患者的年龄与SSX4的表达均具有显著性差异(P<0.05); DNA测序证实PCR阳性产物为目的基因.

结论: SSX1、SSX2、SSX4和SSX5在HCC组织中表达频率不尽相同, 但具有较强的特异性, 提示有可能成为HCC免疫治疗的靶抗原.

关键词: 肝细胞癌; 癌-睾丸抗原; 免疫治疗; 滑膜肉瘤X断裂点基因
引文著录: 张小静, 范蓉, 何少健, 罗彬, 李颀, 罗国容, 谢小薰. 癌-睾丸抗原SSX基因在肝细胞癌中的表达及临床意义. 世界华人消化杂志 2009; 17(19): 2000-2004
Clinical significance of SSX mRNA expression in hepatocellular carcinoma
Xiao-Jing Zhang, Rong Fan, Shao-Jian He, Bin Luo, Qi Li, Guo-Rong Luo, Xiao-Xun Xie
Xiao-Jing Zhang, Department of Histology and Embryology, Xinxiang Medical College, Xinxiang 453003, Henan Province, China
Rong Fan, Department of Histology and Embryology, Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Shao-Jian He, Bin Luo, Qi Li, Guo-Rong Luo, Xiao-Xun Xie, Department of Histology and Embryology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30760055; the Innovative Team Foundation for Research on Highly Occurring Diseases in Guangxi, Gui Jiao Ren No. 2007-71; the Natural Science Research Program of Henan Provincial Education Department, No. 2008B310006; and the Scientific Research Foundation for High-level Talents in Xinxiang Medical College, No. 2006G010.
Correspondence to: Professor Xiao-Xun Xie, Department of Histology and Embryology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. xiexiaoxun@yahoo.com
Received: April 21, 2009
Revised: May 18, 2009
Accepted: May 25, 2009
Published online: July 8, 2009

AIM: To investigate the mRNA expression of cancer-testis (CT) antigens SSX1-5 in hepatocellular carcinoma (HCC) and discuss the possibility of applying these antigens as targets for specific immunotherapy for HCC.

METHODS: The mRNA expression levels of CT antigens SSX1-5 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in 61 HCC specimens and 52 normal adjacent specimens. The correlation between the expression of CT antigens SSX1-5 and clinical parameters was then evaluated. Positive RT-PCR products were sequenced randomly.

RESULTS: In 61 HCC tissues detected, the positive rates of SSX1, SSX2, SSX4 and SSX5 mRNAs were 42.6% (26/61), 8.2% (5/61), 39.3%(24/61) and 6.6% (4/61), respectively. Approximately 50.8% (31/61), 32.8% (20/61), 9.8% (6/61) and 3.3% (2/61) of HCC specimens positively expressed at least one, two, three, and four members of SSX1, SSX2, SSX4 and SSX5, respectively. In addition, no expression of SSX1-5 mRNAs was detected in all 52 normal adjacent specimens. In HCC tissues, the expression of SSX1 mRNA was correlated with the formation of cancer embolus in the portal vein while the expression of SSX4 mRNA was correlated with patient age (P < 0.05). DNA sequencing confirmed the identity of RT-PCR products.

CONCLUSION: Though the positive rates of CT antigens SSX1, SSX2, SSX4 and SSX5 in HCC are different, their expression is high specific. Thus, they are possible promising targets for antigen-specific immunotherapy for HCC.

Key Words: hepatocellular carcinoma; Cancer testis antigen; Immunotherapy; Synovial sarcoma X break-point
0 引言

癌-睾丸抗原(cancer testis antigen, CT抗原)是一类可在多种肿瘤组织中表达, 而在睾丸以外的其他正常组织几乎不表达的抗原, 又称为肿瘤特异性共享抗原(shared tumor specific antigen). 利用这一表达特点, 一些CT抗原的肿瘤疫苗(如NY-ESO-1, MAGE)已试用于临床治疗并取得较好的效果[1-2]. 然而, 由于CT抗原在一些肿瘤中表达频率不高又限制了其疫苗在这些肿瘤中的应用. 因此, 在该研究领域中, 一方面不断地利用各种新技术寻找和鉴定更多的CT抗原, 另一方面则是对已报道的CT抗原进一步深入的研究, 了解其表达特征, 评价这些新发现的CT抗原用于肿瘤免疫治疗的可能性[3-5]. SSX基因又称滑膜肉瘤X断裂点基因(synovial sarcoma X break-point, SSX), 是个多基因家族, 其中一些成员被认为是CT抗原[6]. 本研究利用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)技术, 检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)组织及相应癌旁组织的mRNA, 以了解这些抗原的表达及其与临床相关指标的关系, 探讨将这些抗原用于HCC免疫治疗的可行性.

1 材料和方法
1.1 材料

HCC组织标本61例, 其中男55例, 女6例, 所有标本均来源于广西医科大学第一附属医院, 并经病理诊断证实; HCC癌旁组织(距癌灶边缘≥5 cm)52例, 其中47例为癌及癌旁配对组织. 所有HCC患者均来自广西各地区. 收集患者的年龄、性别、肿瘤大小、病理分级(Edmondson标准)、血清AFP水平、门静脉癌栓(肉眼所见)、肝病背景和TNM分期(国际抗癌联盟(UICC) 1997年第5版TNM分期标准)等临床资料.

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成: 取约300 mg, -70 ℃保存的组织, 利用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取组织总RNA. 所得RNA经琼脂糖凝胶电泳和测定A值, 确定无降解后, 取3 μg总RNA, 用逆转录酶(MBI公司)合成cDNA. 所得cDNA通过PCR扩增看家基因以检测cDNA的质量[7]. 将合格的cDNA分装, -20 ℃保存, 备用.

1.2.2 靶基因的RT-PCR检测: SSX1、SSX2、SSX3和SSX5的总反应体积为30 μL, 取cDNA 1 μL; SSX4的总反应体积为25 μL, 取cDNA 2 μL. PCR循环数均为35个循环. 靶基因SSX1-5的引物序列、退火温度和扩增片断长度见表1. 每次PCR反应中, 均采用睾丸cDNA为阳性对照, 不加模板为阴性对照. PCR完毕后, 取5 μL产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察拍照.

表1 靶基因引物序列、退火温度和扩增长度.
基因引物序列退火温度( ℃)产物大小(bp)
SSX1正义:5'-CTAAAGCATCAGAGAAGAGAAGC-3'54421
反义:5'-AGATCTCTTATTAATCTTCTCAGAAA-3'
SSX2正义:5'-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC-3'58434
反义:5'-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG-3'
SSX3正义:5'-GGAAGAGTGGGAAAAGATGAAAGT-3'58381
反义:5'-CCCCTTTTGGGTCCAGATATCA-3'
SSX4正义:5'-AAATCGTCTATGTGTATATGAAGCT-3'60415
反义:5'-GGGTCGCTGATCTCTTCATAAAC-3'
SSX5正义:5'-GTTCTCAAATACCACAGAAGATG-3'58324
反义:5'-CTCTGCTGGCTTCTCGGGCG-3'

1.2.3 DNA测序: 随机选取SSX1-5阳性的PCR产物, 经纯化后进DNA测序(ABI3100自动测序仪, 美国).

统计学处理 应用SPSS for Windows 11.5统计学分析软件, 对所得数据进行统计学处理. 样本率的比较用χ2检验, 样本均数的比较用t检验.

2 结果
2.1 SSX基因mRNA的表达

SSX1-5 PCR扩增产物电泳图见图1. 在HCC组织中, SSX1表达率(42.6%)最高, 其次为SSX4(39.3%), 随后为SSX2(8.2%)和SSX5(6.6%), 未检测到SSX3; 在癌旁组织中, 未检测到SSX1-5 mRNA.

图1
图1 SSX1-5的PCR扩增产物电泳图. M: DNA分子质量标记; 1: SSX1(421 bp); 2: SSX2(434 bp); 3: SSX3(381 bp); 4:SSX4(415 bp); 5: SSX5(324 bp); 6: 阴性对照.
2.2 SSX基因在HCC组织中的共表达

在检测的HCC组织中, 至少表达1个SSX基因者达50.8%(31/61); 表达2个或2个以上者达32.8% (20/61); 表达3个或3个以上者达9.8%(6/61); 同时表达4个者达3.3%(2/61)(图2).

图2
图2 SSX基因在HCC组织中的共表达.
2.3 SSX基因mRNA的表达与临床相关指标的关系

经χ2检验及t检验分析发现, 在HCC组织中, 除门静脉癌栓形成与SSX1的表达、患者的年龄与SSX4的表达具有显著性差异外(P<0.05), 其余指标均与SSX1和SSX4的表达无显著性差异(P>0.05). SSX2和SSX5在HCC组织中表达与所分析的指标的差异均无显著性(P>0.05, 表2).

表2 HCC中SSX mRNA的表达及与临床指标的关系.
临床指标nSSX1
SSX2
SSX4
SSX5
+阳性率(%)+阳性率(%)+阳性率(%)+阳性率(%)
总数612744.258.22439.346.60
性别
男552443.659.12341.847.20
女635000116.700
HBV
+532241.559.42139.647.55
-8562.500.0337.500.00
AFP(μg/L)
≤2511327.300436.319.10
>25502448.0510.02040.036.00
肿瘤大小(cm)
≤511436.419.1436.419.10
>5502346.048.02040.036.00
病理分级E
Ⅰ/Ⅱ341544.138.81029.425.90
Ⅲ/Ⅳ271244.427.41451.927.40
癌栓
+171270.6a001058.8211.80
-441534.1511.41431.824.80
肝硬化病史
有442147.7511.41943.249.10
无17635.300529.400
TNMG
Ⅰ/Ⅱ19636.6315.8736.815.30
Ⅲ/Ⅳ422150.024.81740.537.10
平均年龄(岁)+49.48±11.0753.00±9.1451.08±11.04a46.75±8.66
-45.50±9.9746.75±10.6144.81±9.6147.30±10.76
E: Edmondson分级; G: 国际抗癌联盟(UICC)1997年第5版的TNM分期;
aP = 0.01<0.05.
2.4 DNA测序

随机抽取PCR阳性产物进行DNA测序, 所得序列与基因库检索序列一致, 证实所扩增的产物为目的基因的片段.

3 讨论

广西是HCC的高发区, 探讨如何将CT抗原用于HCC的辅助治疗有一定的临床意义. 目前, 有关广西HCC组织中SSX基因mRNA的表达仅有一些报道[4,8-9], 但存在以下不足: (1)SSX3和SSX5在HCC组织中的表达情况尚未见报道; (2)例数较少; (3)SSX表达与临床相关指标的分析有限. 基于以上情况, 本研究扩大样本例数, 检测SSX家族的5个成员(SSX1-5), 并结合多项临床指标进行分析. 本研究结果显示SSX1(42.6%)和SSX4(39.3%)的表达率较高, 而SSX2(8.2%)和SSX5(6.6%)的表达率较低. SSX1和SSX2表达率低于先前报道[4,9], 而SSX4则明显高于Luo et al[8]的报道, 这可能与不同的标本有关, 但不排除与SSX家族成员在HCC中的表达异质性有关. 本研究未发现1例表达SSX3, 与SSX3在其他肿瘤组织中的表达率几乎为零的情况相似[10-11]. 同一基因家族中, 为何一些成员完全不表达, 目前机制尚不清楚, 有待进一步的研究探测.

对SSX基因表达与临床相关指标关系的分析发现, 已有门静脉癌栓的HCC患者, SSX1的表达率明显高于无门静脉癌栓形成的HCC患者, 提示SSX1阳性的患者HCC的复发及转移可能性较大, 预后较差. 目前已知随着年龄的增加, 机体DNA甲基化程度逐渐降低, 去甲基化程度逐渐增高[12], 而体外实验也发现在肿瘤细胞培养中加入去甲基化试剂可诱导SSX基因表达[13-14]. 因此, SSX4的表达与患者年龄相关, 这从另一方面提示SSX4的表达与可能去甲基化有关, 此外, 尽管本研究结果显示SSX基因的表达率与AFP值的无显著性差异, 但在11例AFP值正常(<20 μg/L)的HCC组织中, 有6例表达SSX1、SSX4和SSX5. 这一现象提示, SSX1、SSX4和SSX5的表达对HCC的辅助诊断可能有一定的意义.

SSX基因在其他肿瘤组织中存在共表达现象[15], 这一现象也同样存在于HCC组织中. 本研究结果显示至少表达1个SSX基因的占50.8%(31/61); 至少表达2个SSX基因的占32.8% (20/61); 至少表达3个SSX基因的占9.8%(6/61); 同时表达4个SSX基因的占3.3%(2/61). 这种共表达现象可能与CT抗原在组织中的相互作用有关, 因为当单个基因因去甲基化被激活后, 该基因可能以连锁反应的形式相继激活其他基因, 导致共表达现象的出现[13]. 尽管这一现象出现的机理尚不清楚, 但由于半数的HCC患者表达至少1个SSX基因, 以及一个个体中可同时表达多个SSX基因, 这将十分有利于SSX多价疫苗的应用.

本研究显示了SSX1-5在HCC组织中的表达率不尽相同, SSX1和SSX4的表达率较高, 而SSX2和SSX5的表达率偏低. 由于该家族成员在核酸及蛋白水平均有较高的同源性, 并存在共同表达现象, 尤其是半数的HCC患者可表达至少一种SSX, 因此, SSX1、SSX2、SSX4和SSX5均有可能作为HCC免疫治疗的靶抗原, 通过研发SSX的多价疫苗, 不但可扩大免疫治疗的适用范围, 而且由于多价疫苗包含多个特异性抗原表位, 可以针对因肿瘤细胞异质性表达而致的免疫逃逸, 以达到提高疗效的目的.

评论
背景资料

癌-睾丸抗原(CT抗原)是一类可在多种肿瘤组织中表达, 而在睾丸以外的其他正常组织几乎不表达的抗原, 又称为肿瘤特异性共享抗原. 利用这一表达特点, 一些CT抗原的肿瘤疫苗(如NY-ESO-1, MAGE)已试用于临床治疗并取得较好的效果. 然而, 由于CT抗原在一些肿瘤中表达频率不高又限制了其疫苗在这些肿瘤中的应用.

同行评议者

王鲁, 副教授, 复旦大学附属中山医院肝外科

创新盘点

目前, 有关广西HCC组织中SSX基因mRNA的表达仅有一些报道, 但存在着一些不足, 如: 例数较少, 临床相关指标的分析有限等. 基于以上情况, 本研究扩大样本例数, 检测SSX家族的5个成员(SSX1-5), 并结合多项临床指标进行分析.

应用要点

由于SSX1、2、4和SSX5在HCC中的表达具有较强的特异性及具有共表达等特性, 因此均有可能作为HCC免疫治疗的靶抗原, 通过研发SSX的多价疫苗, 可扩大免疫治疗的适用范围, 并且可以提高疗效.

名词解释

1 癌-睾丸抗原(CTA): 一类在正常组织中(睾丸生精上皮除外)通常不表达, 而在多种肿瘤组织中广泛表达的肿瘤共享抗原.

2 SSX基因: 又称滑膜肉瘤X断裂点基因(SSX), 他的发现与滑膜肉瘤中的易位染色体t(X; 18)(p11.2; q11.2)有着密切的联系.

同行评价

本研究选题新颖, 设计合理, 结果有一定的参考价值.

编辑: 李军亮 电编: 吴鹏朕

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