激光诱导大鼠大肠早癌组织自体荧光光谱特征

摘要

目的: 探索激光诱导大肠早癌组织自体荧光光谱特征. 

方法:  采用二甲肼ip法建立SD大鼠大肠癌动物模型, 对大鼠结肠和直肠可疑病变或肿块部位用370 nm激光照射, 诱导组织产生自体荧光并收集光谱后取材, 根据病理诊断分为正常组、早期癌组、进展期癌组, 分析各组光谱特征. 

结果: 正常64例, 早期癌78例, 进展期癌84例, 共226例. 各组光谱在460 nm和505 nm处附近有波峰; 正常组460 nm左右波峰对应的波长与早期癌组、进展期癌组对应波长比较差异有显著性(457.66±3.28 vs 467.87±7.71, 468.60±4.53, P<0.05). 73%(61/84)的进展期大肠癌组织、69%(54/78)的早期大肠癌组织荧光光谱在635 nm附近有荧光峰, 而正常组织缺乏该峰. 早期癌组和进展期癌组自体荧光在460 nm处的荧光强度比在正常组相应强度弱. 早期癌组和进展期癌组I₆₃₅/I₄₆₀(1.9507±1.1460, 2.1368±1.4721)和I₆₃₅/I₆₀₀值 (0.4215±0.2582, 0.4482±0.2309)分别较正常组I₆₃₅/I₄₆₀和I635/I600值大且差异有显著性(0.7494±0.1077, 0.1416±0.0439, P<0.05).

结论:  激光诱导的大鼠大肠正常组织与大肠癌组织(包括早期和进展期大肠癌)自体荧光光谱之间存在差异, 自体荧光光谱部分特征可用于大肠癌早期诊断.

关键词: 激光; 自体荧光; 光谱; 早期大肠癌

Characteristics of laser-induced autofluorescence spectra in early colorectal carcinoma

Qiu-Lin Huang, Yang-De Zhang

Qiu-Lin Huang, the First Affiliated Hospital of Nanhua University, Hengyang 421001, Hunan Province, China

Yang-De Zhang, National Hepatobiliary and Enteric Surgery Research Center of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China

Correspondence to: Qiu-Lin Huang, Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Nanhua University, Hengyang 421001, Hunan Province, China. hql107@hotmail.com

Received: September 2, 2007
Revised: January 15, 2008
Accepted: January 22, 2008
Published online: February 28, 2008

Abstract

AIM: To analyze the characteristics of laser-induced autofluorescence spectra in early colorectal carcinoma.

METHODS: An animal model of colorectal carcinoma was established by injecting DMH in abdominal cavity of Sprague-Dawley rats. Samples were collected from normal, early-stage and advanced carcinoma tissues, respectively. The characteristics of their laser-induced autofluorescence spectra were analyzed.

RESULTS: A total of 226 samples were collected, including 64 normal colorectal tissue samples, 78 early-stage and 84 advanced colorectal carcinoma tissue samples. Spectra peaks were observed at about 460 nm and 505 nm in different groups. The wavelength at 460 nm in normal tissue samples differed significantly from those in early stage and advanced colorectal cancer tissue samples (457.66 ± 3.28, 467.87 ± 7.71, 468.60 ± 4.53, P < 0.05). Spectra peaks were found at 635 nm in 73% advanced colorectal carcinoma tissue samples and 69% early-stage colorectal carcinoma tissue samples, but not in normal colorectal tissue samples. The mean wavelength at 460 nm was longer in normal colorectal tissue samples than in early stage and advanced colorectal carcinoma tissue samples (457.66 ± 3.28 vs 467.87 ± 7.71, 468.60 ± 4.53, P < 0.05). The values of I635/I460 and I635/I600 in early-stage (1.9507 ± 1.1460, 0.4215 ± 0.2582) and advanced carcinoma tissue samples (2.1368 ± 1.4721, 0.4482 ± 0.2309) were higher than those in normal colorectal tissue samples (0.7494 ± 0.1077, 0.1416 ± 0.0439, P < 0.05).

CONCLUSION: The characteristics of laser-induced autofluorescence spectra are different in normal colorectal tissue, early-stage and advanced colorectal carcinoma tissue, and can be used to diagnose early-stage colorectal carcinoma.

Key Words: Laser; Autofluorescence; Spectrum; Early-stage colorectal carcinoma

0 引言

本研究采用调Q式钛宝石激光器激发大肠癌模型大鼠大肠组织产生自体荧光并收集其光谱, 分析大肠早癌组织的光谱特征, 为自体荧光光谱技术诊断早期大肠癌提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠60只, 6-7周龄, 体质量170 g左右, 雌雄各半, 由中南大学湘雅医学院动物学部提供. 1, 2-二甲肼(DMH·2HCl)为美国Acros公司产品, 乙二胺四乙酸二钠(EDTANa₂·2H₂O)、戊巴比妥钠、氢氧化钠和氯化钠均为分析纯. 卫生部肝胆肠外科研究中心研制的大肠早癌自体荧光内镜定位诊断系统(主要组成器件: 激发波长为370 nm的调Q式钛宝石激光器、光纤、多色仪、增强型光电二极管、探头控制器、脉冲发生器、计算机和激光器电源, 美国Princeton Instruments公司光谱分析软件, 大肠早癌荧光检测数据处理软件)、手术显微镜等.

1.2 方法

大肠癌动物模型建立方法采用二甲肼诱导法[1]: ip 3.5 g/L二甲肼(DMH)溶液, 25 mg/kg, 1 次/wk, 共18 wk. 实验步骤: (1)麻醉: 用30 g/L戊巴比妥钠按40 mg/kg注射到DMH诱导18 wk的大鼠腹腔内; (2)解剖大鼠: 纵行切开腹壁, 自肛门沿结直肠对系膜缘纵行剪开结直肠肠壁, 清除肠道粪便; 手术显微镜辅助下观察肠道病变; (3)对大肠内肿块、可疑病变及"正常组织"利用激光诱发组织自体荧光诊断系统光纤探头垂直于病变方向轻轻接触其表面. 370 nm激光照射检测部位, 收集400-700 nm范围的荧光光谱, 每一组织块收集3条完整波段的光谱; (4)全层切取荧光检测后的肠壁组织, 编号, 部分用40 g/L的甲醛固定, 送病理切片, HE染色, 两名病理科医师阅片; 按病理切片结果进行分组, 分为正常组、早期癌组、进展期癌组, 并收集各组组织荧光光谱. (5)荧光光谱图像数据处理: 利用大肠早癌荧光检测数据处理软件将荧光光谱进行归一化及光谱参数数据化处理. 同一采集部位的荧光光谱的波峰强度及相对应的波长用各自的3条自体荧光波峰强度和波长的平均值表示.

统计学处理 数据用mean±SD表示, SPSS 10.0版统计软件分析. 多组样本间的样本均数比较用单向方差分析的多重比较方法. P<0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 组织病理和大肠自体荧光光谱收集结果

正常大肠组织64例, 早期大肠癌78例, 进展期大肠癌84例. 收集了正常组、早期癌组、进展期癌组在体自体荧光光谱各192条、234条和252条. 各组典型图谱及处理图见图1.

图1 大鼠大肠组织自体荧光图谱. A: 正常组; B: 早期癌组; C: 进展期癌组; D: 大肠癌荧光检测数据处理软件光谱归一化处理.

2.2 大肠组织自体荧光光谱特征

2.2.1 波形: 正常组、早期癌组和进展期癌组收集的自体荧光光谱形态上存在一定差异. 各组光谱大多数在460 nm、505 nm和542 nm左右处有波峰; 460 nm波峰较505 nm和542 nm处波峰明显, 542 nm处波峰较小. 大肠癌组织的自体荧光光谱460 nm左右处的光谱曲线较正常组织要平坦, 其波峰较正常组织不明显. 在正常组自体荧光光谱无635 nm左右的荧光峰. 73%(61/84)的进展期大肠癌组织、69%(54/78)的早期癌大肠组织的荧光光谱(未经归一化和平滑处理)存在635 nm左右处有荧光峰.

2.2.2 波峰位置: (1)早期癌组和进展期癌组组织自体荧光光谱在460 nm左右处的波峰位置(λ₄₆₀)与正常组比较有统计学差异(P<0.05). 各组比较, 505 nm左右处的波峰对应波长λ₅₀₅无显著性差异(P>0.05, 表1).

表1 各组间大肠组织自体荧光光谱λ₄₆₀值与λ₅₀₅值.

分组	n	λ460	λ505
正常组	64	457.66±3.28	509.00±1.25
早期癌组	78	467.87±7.71a	508.54±0.80
进展期癌组	84	468.60±4.53a	509.08±1.21

^aP<0.05 vs 正常组.

2.2.3 大肠癌荧光检测结果: 波峰强度绝大多数大肠在体组织自体荧光光谱在460 nm左右处有最大峰强度, 个别大肠癌组织在635 nm处有最大峰强度. 正常组织在460 nm左右处自体荧光强度一般较大肠癌组织要强. 大肠癌组织该处的光谱相对正常组织要低平(图1A-C).

2.2.4 各组在体组织自体荧光光谱I₆₃₅/I₆₀₀值和I₆₃₅/I₄₆₀值差异: I₆₃₅/I₆₀₀表示635 nm左右处的荧光(峰)强度比上600 nm处荧光强度, I₆₃₅/I₄₆₀表示635 nm处的荧光(峰)强度比上460 nm左右处荧光(峰)强度(表2).

表2 各组大肠组织自体荧光光谱I₆₃₅/I₆₀₀和I₆₃₅/I₄₆₀值.

分组	I635/I600	I635/I460
正常组	0.7494±0.1077	0.1416±0.0439
早期癌组a	1.9507±1.1460	0.4215±0.2582
进展期组a	2.1368±1.4721	0.4482±0.2309

^aP<0.05 vs 正常组.

3 讨论

大肠癌在临床上是常见的肿瘤之一, 由于早期诊断较困难, 其术后5年的生存率只有40%-50%, 因而提高大肠癌患者生存率的关键在于提高早期大肠癌的检出率. 自体荧光分析法因为其具有灵敏、快速、简便、无创伤等优点被作为恶性肿瘤诊断方法的研究日趋活跃, 并被证明有较好的应用价值[2-3]. 同样研究发现大肠癌与正常组织自体荧光光谱特征存在明显差异[4-5], 从而使之为大肠癌诊断提供了一种新的诊断思路[6], 但由于临床上早期大肠癌发现困难, 故有关大肠早癌自体荧光光谱特征研究极少. 本研究利用二甲肼ip建立大肠早癌动物模型, 对激光诱导的大肠正常组织、早期大肠癌及进展期大肠癌组织荧光光谱特征差异进行了研究. 本研究发现正常组织、早期大肠癌及进展期大肠癌组织荧光光谱在460 nm、505 nm及542 nm左右处大多有波峰, 同时发现大肠癌组织自体荧光该处的光谱比较平坦, 荧光强度要弱于正常组织. 一般认为460-505 nm左右处的荧光峰与多种物质有关[7], 在肿瘤的发展过程中这些物质的改变是自体荧光光谱波峰特征改变的基础.

本研究也发现在正常组织自体荧光光谱中红光区635 nm处缺乏荧光峰, 而早期癌和进展期癌组织光谱部分存在该荧光峰. 研究表明该处的荧光峰波长与卟啉的自体荧光峰相应波长相同, 因此认为是由卟啉引起. 事实也证明大肠正常组织和癌组织中卟啉含量有明显差异[8], 因此大肠癌组织的荧光光谱在635 nm处的荧光峰出现为大肠癌的诊断提供良好的指标. 本研究发现各组光谱在505 nm处波峰的相应波长比较无显著性差异, 因而利用该峰位置用于鉴别大肠良恶病变的可能性不大. 而在460 nm处早期大肠癌和进展期大肠癌组自体荧光光谱的波峰对应的波长较正常组织红移约10 nm, 且差异有显著性, 早期及进展期大肠癌组织的自体荧光光谱在460 nm处的荧光峰对应波长较正常组织的自体荧光光谱在460 nm处的荧光峰对应波长要长, 因此这一大肠癌组织自体荧光光谱特征可以用于作为区分大肠癌(包括早期大肠癌)与正常组织的参数. 该研究发现早期大肠癌及进展期大肠癌组织荧光光谱在460 nm、505 nm及542 nm左右波峰强度大体上要弱于正常组织荧光强度. 可能由于肿瘤细胞的浸润, 黏膜层的增厚及某些荧光物质相对量的变化, 所导致自体荧光强度的改变[9-10], 这为自体荧光技术诊断肿瘤打下了基础[11]. 但由于大肠组织生化与形态特征的个体差异较大, 不同患者的同类型组织样本之间的荧光光谱强度差异很大, 再加上结肠组织的不规则性导致每个样本测量时的测量结构不能保证完全相同. 故通过光谱绝对强度差异来作为诊断判别依据都是不可靠的, 故部分研究者采用比值选取方法[12], 以消除该因素的影响. 在本研究中利用I635/I600和I635/I460两比值, 发现早期和进展期癌组的自体荧光光谱两比值均数与正常组比较要大, 且差异有显著性. 因此利用组织自体荧光光谱在该波段处的强度比可作为区分正常组织与大肠癌组织(包括早期大肠癌)的参数.

总之, 本研究发现激光诱导大肠正常组织、早期癌及进展期癌组织自体荧光某些光谱特征存在差异, 为激光诱导自体荧光光谱诊断大肠早癌提供了理论依据.

评论

背景资料

自体荧光光谱分析法诊断恶性肿瘤的研究日趋活跃. 大肠癌是临床上常见恶性肿瘤之一, 但由于常用的检查方法较难发现早期大肠癌, 因而大肠早癌自体荧光光谱特性如何仍未被揭示, 导致该技术在临床中应用受到了限制.

同行评议者

徐智, 教授, 北京大学第三医院外科.

研发前沿

本文采用大肠癌动物模型, 激光诱导大肠正常组织、早期大肠癌组织和进展期大肠癌产生自体荧光, 收集各组组织自体荧光光谱加以分析, 以揭示各组自体荧光光谱之间差异, 为自体荧光光谱技术用于大肠早癌的诊断提供依据.

应用要点

本文通过研究正常大肠组织、各期大肠癌组织间自体荧光光谱特征差异、以揭示大肠早癌自体荧光光谱特征, 为激光诱导大肠组织自体荧光光谱技术用于大肠早癌的诊断提供依据.

名词解释

自体荧光: 当生物组织受到一定波长激光照射时, 分子可吸收能量, 发生分子内能级跃迁, 并跃迁至高能级, 当他回到最低电子激发态, 把部分能量通过发射相应的光子的形式来释放时, 就发射出分子荧光, 即"自体荧光".

同行评价

本研究设计合理, 实验方法正确, 数据可靠, 内容翔实, 统计分析准确, 讨论切题, 具有一定的临床应用价值.

备注

编辑: 李军亮 电编: 何基才

参考文献

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