茶多酚对酒精性肝病大鼠TNF-α及肝细胞的影响

摘要

目的: 探讨茶多酚对酒精性肝病大鼠TNF-α表达及肝细胞病变的影响. 

方法:  29只大鼠随机分为: 对照组、模型组、茶多酚干预组. 白酒ig建模, 茶多酚干预. 常规切片及特染评价肝组织病变, 检测血清AST、ALT、MDA含量, ELISA法检测血清TNF-α、RT-PCR检测肝组织TNF-α mRNA表达. 

结果: 与模型组相比, 茶多酚干预组大鼠肝组织学评分(3.00±1.59 vs 4.50±1.31, P<0.05), 血清AST、MDA绝对值(87.33±61.00 vs 226.40±81.34, 2.75±0.72 vs 7.34±3.06, P<0.05), 肝组织TNF-α mRNA表达与TNF-α血清含量均降低(0.55±0.05 vs 0.73±0.07, 4.45±0.83 vs 14.33±1.87; P<0.05).

结论:  茶多酚保护肝细胞线粒体, 减轻脂质过氧化, 减少TNF-α的合成释放.

关键词: 酒精性肝病; 茶多酚; 肿瘤坏死因子α; 酶联免疫吸附法; 逆转录聚合酶链式反应

Effect of tea polyphenols on TNF-α and hepatocytes in rats with alcoholic liver disease

Fen Li, Xiao-Qin Guan, Li Liu

Fen Li, Xiao-Qin Guan, Li Liu, Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Correspondence to: Xiao-Qin Guan, Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China. guanxiaoqin2003@yahoo.com.cn

Received: July 2, 2007
Revised: January 15, 2008
Accepted: January 20, 2008
Published online: February 8, 2008

Abstract

AIM: To investigate the effect of tea polyphenols on tumor necrisis factor-alpha (TNF-α) expression and liver pathological change in rats with alcoholic liver disease.

METHODS: Twenty-nine Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, and tea polyphenols-intervened group. A model of alcoholic liver disease was induced by gastric perfusion with alcohol and intervened with tea polyphenols. Liver tissue sections were stained with H&E. Serum levels of AST, ALT and MDA were determined. Serum TNF-α was detected by ELISA. RT-PCR was performed to determine TNF-α expression in liver tissue.

RESULTS: The scores of pathology (3.00 ± 1.59 vs 4.50 ± 1.31, P < 0.05), serum levels of AST and MDA (87.33 ± 61.00 vs 226.4 ± 81.34, 2.75 ± 0.72 vs 7.34 ± 3.06, P < 0.05) as well as TNF-α (0.55 ± 0.05 vs 0.73 ± 0.07, P < 0.05) and TNF-α mRNA expression (0.55 ± 0.05 vs 0.73 ± 0.07, P < 0.05; 4.45 ± 0.83 vs 14.33 ± 1.87, P < 0.05) were lower in the tea polyphenols-intervened group than in the model group.

CONCLUSION: Tea polyphenols can protect hepatocytes from damage, decrease lipid peroxidation and TNF-α release.

Key Words: Alcoholic liver disease; Tea polyphenols; Tumor necrosis factor-alpha; Enzyme linked immunosorbent assay; RT-PCR

0 引言

酒精性肝病(ALD)是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病. 临床上分轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化. 由于其机制复杂, 涉及乙醇的直接毒性、乙醛的化学性损伤、氧应激和脂质过氧化、线粒体损伤、遗传等多个方面. 近年来ALD的治疗进展缓慢, 对ALD早期疾病的预防显得尤为重要.

茶多酚(TP)是茶叶的主要活性成分, 其主要成分儿茶素占茶多酚总量的60%-80%, TP经消化道吸收后进入全身各组织, 体内广泛分布[1], 抗氧化是其的主要作用. 本研究在建立大鼠ALD模型的基础上, 利用茶多酚能直接溶于乙醇的物理特性, 建模的同时给与茶多酚干预, 观察茶多酚对肝细胞病变及其对血清、肝组织中TNF-α的影响, 探讨茶多酚用于酒精性肝病早期预防和治疗的可能性.

1 材料和方法

1.1 材料

清洁级成年♀Wistar大鼠29只, 体质量200±50 g, 购自重庆医科大学实验动物中心. 实验期间饲养于重庆医科大学动物中心IVC饲养间. 实验仪器: Thermo Hybaid PCR仪为英国产品, Bio-Rad凝胶成像系统为美国产品, Bio-Tec 酶标仪为美国产品, 透射电镜(Hitachi-7500)为日本产品. 试剂有55度红星二锅头白酒: 北京红星二锅头酒厂生产, 苏丹Ⅳ特染试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司, 丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所, TNF-α兔抗鼠多克隆抗体及免疫组化SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司, ELISA定量检测细胞因子TNF-α试剂购自深圳晶美生物工程有限公司, RT-PCR引物、TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒、DNA marker购自宝生物工程(大连)有限公司, 茶多酚TP98购自无锡世纪生物药业公司(茶多酚≥98%, 其中儿茶素≥85%).

1.2 方法

1.2.1 动物实验: Wistar大鼠29只, 随机分为三组, 对照组5只, ALD模型组11只, 茶多酚干预组13只. 灌胃溶液: (1)ALD模型组: 55度白酒+玉米油. (2)茶多酚干预组: 55度白酒+玉米油+茶多酚. (3)对照组: 玉米油. 每日上午九点ig 1次. 其中: 55%白酒以8-15 mL/(kg·d)剂量, 每周递增. TP: 0.25 g/(kg·d), 玉米油: 2 mL/(kg·d). 实验结束得到大鼠: 对照组5只, 模型组9只、干预组9只. 7 wk末处死大鼠, 下腔静脉穿刺抽血5-6 mL, 分离血清. 取相同部位肝组织40 g/L甲醛固定, 石蜡包埋切片及冰冻切片做脂肪特殊染色, 光镜观察. 取1 mm3肝组织, 固定于4 ℃预冷的20 g/L戊二醛中, 备电镜检测. 另取50-100 mg大小的肝组织若干, 分别用1 mL/L DEPC水处理过的锡箔纸包裹后存放于液氮中, 备RT-PCR检测. 其余肝脏组织保存在-80 ℃冰箱.

1.2.2 光镜观察: 各组动物肝组织病理切片经HE染色, 冰冻切片苏丹Ⅳ染色确认细胞内脂滴储积情况. 依照2006年修订的酒精性肝病诊疗指南[2]标准进行组织评分, 评分主要内容包括: 肝细胞脂变及坏死、肝小叶炎症细胞浸润、纤维化程度.

1.2.3 电镜观察肝细胞超微结构: 按常规透射电镜样品制备方法固定、脱水、浸透、包埋, 光镜半薄切片定位后行超薄切片. 枸橼酸铅电子染色后, 在透射电镜(Hitachi-7500)下观察超微结构.

1.2.4 血清和肝组织指标检测: 用全自动生化仪测定大鼠血清ALT、AST水平, 血清MDA检测严格按照说明书进行, ELISA法检测血清TNF-α, 严格按照说明书进行. 肝组织TNF-α mRNA表达检测采用半定量RT-PCR法. 内参: β-actin. 应用TRIzol试剂提取总RNA, 参照RT-PCR试剂盒说明逆转录成cDNA, 10 μL体系. PCR扩增: 50 μL体系: 5×PCR Buffer 10 μL, 灭菌蒸馏水28.75 μL, TaKaRa Taq HS 0.25 μL, TNF-α上下游引物各0.5 μL, 逆转录产物10 μL. 反应条件: (94 ℃ 3 min)1 cycle; (94 ℃ 30 s, 62 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s)40 cycles; (72 ℃ 5 min) 1 cycle, TNF-α上游引物: 5'-TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC, 下游引物: 3'-CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC, 扩增产物295 bp, β-actin: 反应体系同TNF-α, 反应条件: (94 ℃ 3 min)1 cycle; (94 ℃ 30 s, 62 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s)30 cycles; (72 ℃ 5 min)1 cycle, β-actin上游引物: 5'-AGAGCTATGAGCTGCCTGAC-3', 下游引物: 5'-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3', 扩增产物374 bp, PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用Bio-Rad Gel Doc2000型凝胶电泳成像系统照相后并用Quantity One软件计算基因相对表达值. 被检测的目的基因相对表达值 = 目的基因条带灰度值/β-actin基因条带灰度值.

1.2.5 免疫组化检测: SABC法检测肝组织中的TNF-α蛋白表达. 石蜡切片脱蜡至水. 30 mL/L H₂O₂灭活内源性过氧化物酶. 封闭非特异性抗原. 加1:400稀释的TNF-α一抗. 4 ℃过夜. 二抗、三抗工作液37 ℃孵育各20 min. DAB显色, 苏木素复染, 封片, 以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照. 结果判断: 北航CM-2000B型生物医学图像分析系统, 每张切片随机选取10个高倍视野, 取面密度, 以平均值结果统计分析.

统计学处理 结果以mean±SD表示. 各组均数先进行方差齐性检验, 计量资料单因素方差分析. 等级资料采用χ²检验. 多组样本均数之间两两比较采用SNK检验. P<0.05有统计学差异.

2 结果

2.1 实验动物一般情况

对照组被毛光滑, 活泼, 体质量增加, 大便正常. 灌白酒的大鼠精神萎靡、行动迟缓, 皮毛黄、无光泽, 有激惹征象, 部分大鼠大便稀软.

2.2 肝脏大体及组织病理改变

石蜡切片评分: 对照组: 2.60±1.40. 模型组: 4.50±1.31. TP干预组: 3.00±1.59(图1), 模型组与TP干预组有显著性差异. 对照组大鼠肝组织肉眼及光镜下改变不明显, 其他二组肝脏体积稍增大, 边缘变钝, 色泽晦暗, 切面油腻感. 模型组大鼠肝细胞胞质疏松化, 部分细胞气球样变, 胞质内见大小不等的空泡, 苏丹Ⅳ染色证实空泡变性的肝细胞内含大小不等、被染成猩红色的脂质. 偶见Mallory小体, 小叶内少量点状坏死, 汇管区及小叶内少量淋巴细胞、嗜中性粒细胞浸润, 但纤维增生不明显. 茶多酚组上述改变明显轻于模型组, 未见纤维增生(图2).

图1 各组HE染色组织切片评分.

图2 各组HE染色组织切片及苏丹Ⅳ染色. A-B: 模型组, 肝细胞脂变; C-D: 茶多酚组, 肝细胞脂变明显减少. A, C: HE×200; B, D: 苏丹Ⅳ×400.

2.3 肝细胞超微结构

模型组大鼠肝细胞内易见脂滴, 线粒体肿胀, 并能见到环状线粒体、内质网扩张, 而茶多酚干预组肝细胞超微结构基本正常(图3).

图3 模型组与茶多酚组肝细胞超微结构比较(TEM×10000). A: 模型组; B: 茶多酚组.

2.4 各组血清指标含量和TNF-α的检测结果

肝组织TNF-α mRNA RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图见图4; 肝组织TNF-α蛋白表达, 免疫组化结果见表1. 免疫组化结果显示: 模型组肝组织TNF-α阳性细胞数明显多于茶多酚组, 表达强度(面密度)明显高于茶多酚组(P<0.05). 阳性细胞在肝小叶内弥漫分布, 小叶中央静脉周围细胞数相对较多. 枯否细胞有表达(图5). 各组血清ALT、AST、MDA含量比较见表2, 表3.

表1 TNF-α的检测结果(mean±SD).

分组	肝组织mRNA	血清含量(ng/L)	免疫组化
对照	0.43±0.09	3.77±1.02	0.03±0.02
模型	0.73±0.07	14.33±1.87	0.39±0.19
茶多酚	0.55±0.05	4.45±0.83	0.09±0.07

表2 各组血清ALT、AST、MDA含量比较(mean±SD).

分组	n	AST(U/L)	ALT(U/L)	MDA(mmol/L)
对照	5	123.20±60.19a	37.20±17.42a	3.22±1.27a
模型	9	226.40±81.34	97.14±37.92	7.34±3.06
茶多酚	9	87.33±61.00c	57.11±19.12	2.75±0.72a

^aP<0.05 vs 模型;

^cP<0.05 vs 对照, 模型.

表3 酒精组与茶多酚组血清AST/ALT的四格表.

处理	比值>2	比值<2	合计
酒精	7	2	9
茶多酚组	1	8	9
合计	8	10	18

图4 RT-PCR肝组织TNF-a mRNA表达(n = 3). 1: 对照组; 2: 茶多酚组; 3: 模型组; M: DNA marker; β-actin: 374 bp, TNF-α: 295 bp.

图5 肝组织TNF-α免疫组化结果(SABC×100). A: 模型组; B: 茶多酚组.

3 讨论

乙醇进入细胞内, 除了经线粒体氧化代谢, 还可以活化细胞色素P4502E1, 产生大量ROS. 当ROS的量超出机体抗氧化系统的清除能力时, 发生氧应激, 氧应激达到一定强度, ROS氧化细胞膜上不饱和脂肪酸, 导致脂质过氧化, 损伤膜结构. 线粒体是细胞内重要的膜性细胞器, 线粒体膜结构的异常与细胞功能损伤相关联. 肝细胞中AST大约有80%存在于线粒体中. 而ALT主要位于肝细胞的细胞质中, 临床上对酒精性肝病患者血清检测结果呈现AST/ALT>2的特点, 也提示ALD中肝细胞的超微损伤主要在线粒体. 我们的实验结果显示: 茶多酚组血清AST明显低于模型组, 同时组内动物血清AST/ALT>2的比例小于模型组. 超微结构显示虽然实验动物给与高浓度的白酒7 wk, 但线粒体的结构未见明显异常, 说明同时给予的茶多酚对线粒体有保护作用. 病理切片及特染结果提示该组大鼠肝细胞脂变程度、肝小叶内炎症情况也轻于模型组, 同时血清中脂质过氧化产物丙二醛的含量也低于模型组. 提示茶多酚可减轻ALD病程中的脂质过氧化损伤.

茶多酚抗氧化作用与结构有关, 他的几种主要成分物质中都含多个羟基, 其B环上的邻二羟基 (3', 4'_OH), A环上5和7位上的二个羟基, 以及C环上的3位上的羟基, 提供氢与活性氧的孤电子结合. 儿茶素结构上的3', 4邻二羟基可将游离金属离子螯合, 减少金属离子活化而产生的活性氧离子[3]. 另外, 茶多酚还可以保护抗氧化酶, 提高抗氧化酶的活性[4], 减少酒精代谢造成的抗氧化剂的过度消耗, 提高细胞抗脂质过氧化能力.

我们的实验还发现: 茶多酚对肝细胞的保护作用不仅直观地体现在形态学上, 还影响ALD病程中的炎症介质. TNF-α是ALD病程中多效能的前炎症因子, 处于肝细胞损伤的细胞因子网络的核心, 当机体处于应激损伤、急慢性感染情况下, 机体的多种细胞可以合成分泌. 他介导肝细胞的炎症反应, 免疫反应及肝细胞的凋亡和扩增, 肝纤维化等多种病理生理活动[5]. 应用TNF-α抑制剂降低TNF-α水平可减轻酒精性肝损伤[6-7]. 由于血清中TNF-α的量并不能完全说明TNF-α对肝细胞的作用, 近年来人们越来越关心其在不同组织中的表达和变化.

本研究应用RT-PCR、免疫组化、ELISA法分别检测了肝组织及血清中TNF-α的含量, 从mRNA与蛋白水平证明了茶多酚可以减少ALD病程中TNF-α的合成和释放. 这与张宇、周晓蓉et al的研究结果相近[8-9]. 同时发现这三种方法检测出的TNF-α的变化方向一致. 相对于肝组织中的TNF-α的量的变化, 血清中TNF-α变化更加敏感. 分析的茶多酚使TNF-α减少的原因: (1)茶多酚的抗氧化作用直接减少活性氧, 减少ROS引起的转录因子NF-κB活化, 减少受NF-κB转录调节TNF-α的基因表达. (2)ALD肠源性内毒素血症也是TNF-α增多的原因[10-11]. 过量酒精摄入, 不仅会改变肠黏膜的通透性, 而且会增加肠道内细菌的移位, 影响枯否细胞, 导致来源于枯否细胞NADPH氧化酶的超氧阴离子以及其他种类的活性氧增多, 而茶多酚本身还有抑菌杀菌调节免疫的功能, 抑制肠道细菌的过度生长, 降低ALD大鼠血清中内毒素含量. 减轻LPS对枯否细胞的刺激, 减少他所产生的氧自由基. 茶多酚可以通过阻断内毒素诱导的枯否细胞NF-κB的活化而减少TNF-α的量[12-13].

茶多酚作为一种安全高效的抗氧化剂, 大量存在于茶叶特别是绿茶中, 而现在抗TNF-α治疗在酒精性肝病的治疗越来越引起人们的重视, 我们的研究结果提示: 茶多酚对ALD病程中TNF-α和肝细胞病变有影响, 这为茶多酚预防性的应用ALD发病的早期阶段或者将他用作抗炎治疗的辅助剂, 减轻肝脏的病损程度提供一定的理论依据.

评论

背景资料

酒精性肝病是长期大量饮酒引起的肝脏疾病, 近年来发病率不断上升. 其病因复杂, 虽然近年来研究颇多, 但在酒精性肝炎、肝硬化的的临床治疗上进展缓慢.

同行评议者

朴熙绪, 教授, 延边大学医院消化内科

创新盘点

本研究着眼于肝脏病变的早期干预和预防, 选用与日常生活相关的茶多酚作为干预药物, 源于其较强的抗氧化特性, 本文研究其对于肝细胞结构及功能的影响, 较全面地了解茶多酚对重要作用的细胞因子TNF-α的影响.

应用要点

本研究结果为将茶多酚应用酒精性肝病发病的早期阶段, 也可将他用作抗炎治疗的辅助剂, 减轻肝脏的病损程度提供了一定的理论依据.

同行评价

本文设计合理, 方法先进, 逻辑性较强, 具有一定实验价值和理论依据.

备注

编辑: 李东辉 电编: 何基才

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