基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2008-12-28; 16(36): 4046-4050
在线出版日期: 2008-12-28. doi: 10.11569/wcjd.v16.i36.4046
苦参碱与氧化苦参碱体外抗乙肝病毒的比较
聂红明, 陈建杰, 高月求, 金树根, 王灵台
聂红明, 陈建杰, 高月求, 金树根, 王灵台, 上海中医药大学附属曙光医院临床肝病中心 上海市 201203
聂红明, 主治医师, 中西医结合专业博士, 主要从事肝病的中西医结合临床治疗和相关基础研究.
基金项目: 上海市科委基金资助项目, No. 04ZR14132; 上海市卫生局资助项目, No. 044087.
作者贡献分布: 聂红明与陈建杰对此文所作贡献均等; 此课题由聂红明, 陈建杰, 高月求, 金树根及王灵台设计; 研究过程由聂红明与金树根操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由高月求提供; 数据分析由聂红明与金树根完成; 本论文写作由聂红明完成.
通讯作者: 陈建杰, 201203, 上海市浦东新区张衡路528号, 上海中医药大学附属曙光医院临床肝病中心. beining0630@126.com
电话: 021-51328888-8209
收稿日期: 2007-07-30
修回日期: 2008-12-03
接受日期: 2008-12-08
在线出版日期: 2008-12-28

目的: 观察苦参碱与氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg, HBeAg和Pre-S1的影响, 探讨其体外抗乙型肝炎病毒作用.

方法: 采用HepG2.2.15细胞模型进行体外培养, 给予不同浓度苦参碱与氧化苦参碱, 作用9 d后收集上清液, 用MTT法观察药物对HepG2.2.15细胞的抑制作用, 用ELISA法检测上清夜中HBsAg, HBeAg和Pre-S1的分泌.

结果: 苦参碱与氧化苦参碱在浓度为0.001 mol/L以下时对HepG2.2.15的生长抑制作用较小(低于25%). 在浓度为1000 μmol/L到0.1 μmol/L之间, 苦参碱和氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率均高于50%, 而对HBeAg的抑制率均低于50%; 浓度为0.001 mol/L时对Pre-S1的抑制率分别为53.58%、59.33%.

结论: 苦参碱与氧化苦参碱均具有一定的抗HBV作用, 两者无显著差别, 且对HBsAg和Pre-S1的抑制效果优于拉米夫定.

关键词: 苦参碱; 氧化苦参碱; HepG2.2.15细胞; 乙肝病毒s抗原; 乙肝病毒e抗原; 前S1抗原
引文著录: 聂红明, 陈建杰, 高月求, 金树根, 王灵台. 苦参碱与氧化苦参碱体外抗乙肝病毒的比较. 世界华人消化杂志 2008; 16(36): 4046-4050
Comparison of the antiviral effect between matrine and oxymatrine against hepatic B virus in vitro
Hong-Ming Nie, Jian-Jie Chen, Yue-Qiu Gao, Shu-Gen Jin, Ling-Tai Wang
Hong-Ming Nie, Jian-Jie Chen, Yue-Qiu Gao, Shu-Gen Jin, Ling-Tai Wang, Department of Liver Diseases, Shuguang Hospital, Shanghai University of Chinese Medicine, Shanghai 200021, China
Supported by: the Shanghai Committee of Science and Technology, No. 04ZR14132; and the Project of Shanghai Office of Healthy, No. 044087.
Correspondence to: Jian-Jie Chen, Department of Liver Diseases, Shuguang Hospital, Shanghai University of Chinese Medicine, 528 Zhangheng Road, Pudongxin District, Shanghai 200021, China. beining0630@126.com
Received: July 30, 2007
Revised: December 3, 2008
Accepted: December 8, 2008
Published online: December 28, 2008

AIM: To evaluate the effect of matrine and oxymatrine on secreting HBsAg, HBeAg and Pre-S1 in HepG2.2.15 cells.

METHODS: HepG2.2.15 cell lines were cultured in vitro at different concentrations of matrine and oxymatrine. Nine days later, inhibitory effects of the experimental drugs on HepG2.2.15 cell lines were estimated using MTT and serum HBsAg, HBeAg and Pre-S1 were detected using ELISA.

RESULTS: The inhibitory effects of matrine and oxymatrine on HepG2.2.15 cells under the concentration of 0.001 mol/L was lower (<25%). When concentration was between 1000 μmol/L and 0.1 μmol/L, the inhibition ratios for either matrine or oxymatrine were more than 50% for secreting HBsAg, but lower than 50% for HBeAg. At the concentration of 0.001 mol/L, the inhibitory rates of matrine and oxymatrine on Pre-S1 were 53.58%, and 59.33%, respectively.

CONCLUSION: Both Matrine and Oxymatrine have effect of anti-HBV in vitro in some degrees, and no significant difference is noted. Their inhibitory effects on HBsAg and Pre-S1 are superior to Lamivudine.

Key Words: Matrine; Oxymatrine; HepG2.2.15 cells; HBsAg; HBeAg; Pre-S1
0 引言

苦参碱(matrine)和氧化苦参碱(oxymatrine)是苦参碱型生物碱(matrine type alkaloid)中的一个生物碱单体, 氧化苦参碱是苦参碱的N-氧化物. 苦参碱型生物碱广泛存在于豆科植物苦参、苦豆子及广豆根中, 是这几种常用中草药的主要有效成分之一. 苦参碱及氧化苦参碱(苦参素)目前已经在临床上广泛使用, 尤其在慢性病毒性肝病的应用中十分普遍, 认为其具有较好的抗HBV作用[1-3]. 但尚未见有关苦参碱和氧化苦参碱抗HBV作用比较的报道, 为此, 我们采用体外HepG2.2.15细胞模型进行苦参碱和氧化苦参碱体外抗乙型肝炎病毒作用的研究.

1 材料和方法
1.1 材料

HepG2.2.15细胞是HBV DNA转染人肝癌细胞株HepG2而建立HepG2.2.15细胞系, 可稳定表达病毒蛋白及分泌病毒颗粒等. HepG2.2.15细胞由上海复旦大学病毒与分子生物研究室闻玉梅院士惠赠, 培养基为DMEM, 含100 mL/L胎牛血清, G418(Sigma)200 mg/L, 1×105 U/L青链霉素. 苦参碱和氧化苦参碱由宁夏丰利源生物化学有限公司提供. 阳性对照药物拉米呋定由上海迪赛诺公司惠赠. 各药物用生理盐水配制成母液, 4 ℃保存. 使用时用DMEM培养基配制成所需浓度. 乙肝病毒s抗原检测试剂盒(批号为20040929)和乙肝病毒e抗原检测试剂盒(批号为20041124)购自上海实业科华生物技术有限公司; 乙肝病毒前S1抗原检测试剂盒购自上海阿尔法生物技术有限公司(批号为20050104); 胰酶购于上海吉泰科技有限公司; DMEM培养基和胎牛血清购于Gibco-BRL. CO2培养箱(thermo forma), benchmark plus酶标仪(Bio-RAD).

1.2 方法

1.2.1 指标检测: 采用四氮唑还原法(MTT)检测药物对HepG2.2.15生长的抑制作用; ELISA法测定上清液中HBsAg、HBeAg和Pre-S1含量.

1.2.2 毒性实验: 取HepG2.2.15细胞1瓶, 用胰酶消化后制备成单细胞悬液, 计数后调整细胞浓度至2×107 cell/L, 加入96孔培养板中(每孔100 μL). 置于细胞培养箱中, 37 ℃、50 mL/L CO2培养过夜. 取出培养板, 吸去上清后加入含有不同浓度药物的DMEM培养基(含50 mL/L胎牛血清); 放入细胞培养箱, 继续37 ℃、50 mL/L CO2培养48 h. 药物浓度分别为: 0.03、0.01、0.001、0.0 001、0.00 001 mol/L. 药物作用9 d后, 在96孔培养板各孔中加入10 μL的MTT, 重新放入培养箱继续培养4 h. 仔细吸去上清, 每孔加入150 μL DMSO, 轻轻振荡使甲臜溶解, 用酶标仪检测570 nm处的A值.

1.2.3 药物对HepG2.2.15细胞上清分泌HBsAg, HBeAg的抑制实验: 取HepG2.2.15细胞, 用胰酶消化后制备成单细胞悬液. 调节细胞浓度至2×107 cell/L, 加入24孔细胞培养板中(1 mL/孔). 放入细胞培养箱, 37 ℃、50 mL/L CO2培养过夜. 取出24孔细胞培养板, 吸出上清后依次加入不同浓度的药物. 药物浓度根据毒性实验的结果, 分别取对HepG2.2.15细胞抑制率低于15%的浓度作为最大无毒浓度, 依次用培养基2倍递减稀释. 放入细胞培养箱, 37 ℃、50 mL/L CO2培养. 分别于第3、6、9天更换新鲜培养基, 并将各孔上清液收集至1.5 mL的离心管中冻存备用.

1.2.4 上清HBsAg, HBeAg和Pre-S1的检测: 采用科华ELISA试剂盒进行检测, 操作按照试剂盒的使用说明进行. 最后用酶标仪读取波长450 nm处的A值.

统计学处理 数据采用微机全部输入SPSS数据库, 统计描述用mean±SD表示, 计量资料齐性检验后进行方差分析.

2 结果
2.1 药物对HepG2.2.15的生长抑制作用

拉米夫定、苦参碱和氧化苦参碱在药物浓度为0.001 mol/L以下时对HepG2.2.15的生长抑制作用较小(表1).

表1 药物对 HepG2.2.15的生长抑制作用 (mean±SD, %).
浓度(mol/L)苦参碱
氧化苦参碱
拉米夫定
A570抑制率A570抑制率A570抑制率
0.030.120±0.00598.681.219±0.04251.860.661±0.18971.73
0.011.612±0.54749.261.867±0.17224.441.294±0.14340.89
0.0012.380±0.28723.822.048±0.14316.771.672±0.33922.50
0.00012.894±0.2526.792.372±0.3273.072.242±0.2480.00
0.00 0012.991±0.3563.582.440±0.5730.221.831±0.30514.74
细胞对照2.454±0.0403.099±0.1782.134±0.030
空白对照0.083±0.0030.083±0.0030.083±0.003
2.2 病毒抗原抑制试验

HepG2.2.15在24孔培养板上生长至单层, 加入不同稀释倍数的药物, 同时设细胞对照组和药物对照组, 培养3、6、9 d分别取上清液测定HBsAg和HBeAg, 并与细胞对照组比较, 计算抑制率、IC50以及TI.

2.2.1 药物对HBsAg的抑制作用: 苦参碱和氧化苦参碱可以有效地抑制细胞分泌HBsAg. 在浓度为1000 μmol/L到0.1 μmol/L之间, 苦参碱和氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率均高于50%, 无剂量依赖性, 其50%抑制率(IC50)为4.9 μmol/L, 其治疗指数(TI = TC50/IC50)为408.16; 而拉米夫定对HBsAg的抑制率较差, 所选浓度范围内均低于50%(表2).

表2 药物对HepG2.2.15分泌HBsAg的抑制作用 (mean±SD, %).
浓度(mol/L)苦参碱
氧化苦参碱
拉米夫定
A570抑制率A570抑制率A570抑制率
10000.483±0.1260.000.560±0.2210.000.576±0.2160.00
1000.330±0.15931.210.290±0.06739.550.405±0.27615.64
100.274±0.16642.850.290±0.07739.510.352±0.05126.62
10.345±0.13328.070.395±0.25717.700.291±0.02039.25
0.10.417±0.19913.120.317±0.10433.820.324±0.13132.45
0.010.673±0.2900.000.682±0.2920.000.502±0.2400.00
细胞对照0.493±0.1150.493±0.1150.493±0.115
空白对照0.26±0.020.26±0.020.26±0.02

2.2.2 药物对HBeAg的抑制作用: 药物作用9 d后, 苦参碱和氧化苦参碱在所选浓度范围内对HepG2215细胞分泌HBeAg的抑制率均低于50%. 但明显优于对照药拉米夫定对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用(表3).

表3 对HepG2.2.15分泌的HBeAg的抑制作用 (mean±SD, %).
浓度(mol/L)苦参碱
氧化苦参碱
拉米夫定
A570抑制率A570抑制率A570抑制率
10002.152±0.3840.922.193±0.3840.741.810±0.40023.66
1002.315±0.2330.232.103±0.51711.262.361±0.5810.40
101.751±1.05726.141.822±0.33023.122.066±0.28412.85
12.139±0.6240.971.783±0.40224.792.275±0.3660.40
0.12.271±0.2700.411.937±0.38718.282.220±0.5860.63
0.012.612±0.0580.002.442±0.3630.002.700±0.1520.00
细胞对照2.594±0.2202.594±0.2202.594±0.220
空白对照0.26±0.020.26±0.020.26±0.02
2.3 药物对HepG2.2.15细胞上清中Pre-S1的影响

取96孔细胞培养上清中0.001 mol/L浓度的各组药物干预孔和细胞对照孔, 用ELISA法检测在该浓度下用ELISA法检测各组药物对HepG2.2.15细胞上清中Pre-S1的影响(表4).

表4 药物对HepG2.2.15细胞上清中Pre-S1的影响.
A值抑制率(%)
苦参碱0.0503±0.01053.58
氧化苦参碱0.0463±0.00259.33
拉米夫定0.0646±0.01133.01

从表中可以看出, 苦参碱和氧化苦参碱在0.001 mol/L浓度时均对HepG2.2.15细胞上清中Pre-S1有较好的抑制效果, 且明显优于拉米夫定对HepG2.2.15细胞上清中Pre-S1的抑制作用.

3 讨论

苦参碱型生物碱是一类具有苦参次碱-15-酮(matridin-15-ketone)基本化学结构相似的化合物, 属于四环的喹嗪啶类(quinolizidine), 分子骨架可看作二个喹嗪啶环的稠合体. 目前已知有近百余种化学成分, 他们广泛存在于豆科植物苦参、苦豆子及广豆根中, 是这几种常用中草药的主要有效成分. 近年来随着分离提取技术的不断发展和进步, 已先后相继分离了不同的苦参碱型生物碱单体. 其中常用的有苦参碱(matrine)、氧化苦参碱(oxymatrine)、槐定碱(sophoridine)、苦豆碱(aloperine)、槐果碱(sophocarpine)、槐胺碱(sophoramine)、槐醇碱 (sophoranol)、氧化槐果碱(oxysophocarpine)等. 而在目前临床上应用最多及研究较深入的是苦参碱及氧化苦参碱, 尤其在慢性病毒性肝病的应用中十分广泛. 基础及临床研究发现, 苦参碱型生物碱具有抗炎、抗过敏、抗心律失常、平喘、抗癌、升白、保肝、抗病毒等广泛生理活性[4-22].

HepG2.2.15细胞是将含有HBV基因组(2个HBV头对尾二聚体, 以尾对尾方向串联)的重组载体质粒转染HepG2细胞, 经G418筛选, 得到的克隆能稳定分泌HBsAg、HBeAg、HBcAg及Dane颗粒, 并可检测到细胞内DNA和RNA等各种中间复制体[25-26], 还能分泌Pre-S1、Pre-S2[27-29], 最近还发现在HepG2.2.15细胞株中, 培养细胞的上清和细胞内均发现HBV covalently closed circular(ccc) DNA[30]. 由于缺乏更好的细胞和动物模型, 能在体外长期培养的肝源性肿瘤细胞株HepG2.2.15细胞是目前用于体外筛选抗HBV药物的主要细胞模型. 我们也采用酶免疫吸附法(ELISA)检测了HepG2.2.15细胞株培养上清中Pre-S1, HBsAg, HBeAg的动态变化, 采用聚合酶链反应法(PCR)检测了HepG2.2.15细胞株培养上清中HBV DNA的动态变化, 发现该模型在体外培养第8天左右是病毒抗原分泌的高峰期[31].

有研究在比较两种化合物对CCl4所致肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响时发现, 氧化苦参碱对小鼠急性CCl4肝损伤降底转氨酶作用强于苦参碱[23]. 比较苦参碱及氧化苦参碱对A549细胞系增殖能力的影响及其对A549细胞凋亡的诱导效应, 发现苦参碱可抑制A549细胞系增殖并诱导其凋亡; 相同浓度下氧化苦参碱不能抑制A549细胞系增殖, 10倍剂量也未出现细胞凋亡[24]. 目前为止, 尚未见这两个基本化学结构相似的化合物抗HBV作用的比较研究相关报道. 我们的研究表明, 苦参碱和氧化苦参碱在体外均具有较好的抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg, HBeAg的作用, 且优于对照药拉米夫定. 而苦参碱和氧化苦参碱相比较, 两者抗HBV作用无显著差别.

本实验还表明, 苦参碱和氧化苦参碱在浓度为0.001 mol时对HepG2.2.15细胞分泌Pre-S1抗原的抑制率分别为53.58%、59.33%. 我们之前研究发现在HepG2.2.15细胞株培养上清中Pre-S1分泌的变化特征与HepG2.2.15细胞株培养上清中HBsAg和HBeAg类似. 检测HepG2.2.15细胞株培养上清中Pre-S1的变化同样具有较大临床意义[31]. Pre-S1抗原为HBV的一种外壳蛋白, 他和前S2蛋白(Pre-S2)一起在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起重要作用. Pre-S蛋白主要存在于具有感染性的Dane颗粒中, 球形颗粒中亦有少量Pre-S1蛋白. 大量的临床和实验研究表明Pre-S1与HBV和HBV DNA有良好的相关性, 是反映HBV在体内复制的良好标志[32-33]. 因此, 对Pre-S1抗原的抑制再次表明苦参碱和氧化苦参碱抗乙肝病毒的良好作用.

评论
背景资料

苦参碱及氧化苦参碱(苦参素)目前已经在临床上广泛用于治疗病毒性肝炎, 尤其氧化苦参碱被认为具有较好的抗HBV作用. 但是其目前疗效仍被质疑, 而且缺乏循证医学的证据. 为此, 我们采用体外HepG2.2.15细胞模型对其抗HBV作用进行分析.

同行评议者

金瑞, 教授, 首都医科大学附属北京佑安医院消化科

研发前沿

近年来随着分离提取技术的不断发展和进步, 已先后相继分离了多种不同的苦参碱型生物碱单体. 基础及临床研究发现, 苦参碱型生物碱具有抗炎、抗过敏、抗心律失常、平喘、抗癌、升白、保肝、抗病毒等广泛生理活性. 而在目前临床上应用最多及研究较深入的是苦参碱及氧化苦参碱, 尤其在慢性病毒性肝病的应用中十分广泛.

应用要点

本文对苦参碱及氧化苦参碱体外抗HBV作用进行比较, 进一步明确两者的差别, 为临床用药提供依据; 此外, 对于将来进一步开发抗HBV新药提供研究思路, 尤其是从苦参碱型生物碱中寻找更好的抗HBV新药提供研究思路.

同行评价

本文是一篇比较有研究价值的论文, 从研究思绪, 材料与方法, 研究结果都比较科学合理,为进一步研究奠定基础.

编辑: 李军亮 电编: 吴鹏朕

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