As2O3与Aspirin联合应用对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响

摘要

目的: 观察As₂O₃与Aspirin联合应用对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响并探讨其可能机制.

方法: As₂O₃和Aspirin处理SGC-7901细胞, 实验分为: 阴性对照组、2 mmol/L Aspirin组、1 mmol/L Aspirin组、4 μmol/L As₂O₃组、2 μmol/L As₂O₃组和2 μmol/L As₂O₃组+1 mmol/L Aspirin组, 流式细胞术检测As₂O₃和Aspirin单独及联合应用对SGC-7901细胞凋亡的作用, 免疫细胞化学法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达.

结果: 2 μmol/L As₂O₃+1 mmol/L Aspirin联合应用组与4 μmol/L As₂O₃组、2 mmol/L Aspirin组SGC-7901细胞在细胞周期G₁期前均出现明显的亚二倍体凋亡峰, 差异无明显统计学意义, 与阴性对照组细胞、2 μmol/L As₂O₃及1 mmol/L Aspirin单药组相比, 差异均有统计学意义(均P<0.05). As₂O₃与Aspirin联合应用组使Bcl-2表达下降, Bax表达增高, 与阴性对照组、2 μmol/L As₂O₃及1 mmol/L Aspirin单药组相比, 差异均具统计学意义(50.21%±5.94% vs 91.65%±11.51%, 88.66%±10.53%, 89.27%±9.84%; 40.72%±9.54% vs 21.03%±4.32%, 23.07%±6.23%, 22.67%±3.16%, 均P<0.05).

结论: As₂O₃和Aspirin可能通过改变Bcl-2和Bax表达诱导SGC-7901细胞凋亡, 两者联合应用具有协同作用.

关键词: 三氧化二砷; 阿司匹林; 联合应用; 胃癌细胞SGC-7901; 凋亡

As₂O₃ and Aspirin induce apoptosis of human gastric cancer cells SGC-7901

Yu-Sen Gong, Wei Qiu, Xia Liu, Yong-Ping Wu, Lin-Lin Li, Hong Liu

Yu-Sen Gong, Wei Qiu, Xia Liu, Yong-Ping Wu, Lin-Lin Li, Hong Liu, Department of Pathology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China

Supported by: the Natural Science Fund for Colleges and Universities in Jiangsu Province, No. 06KJB310118.

Correspondence to: Hong Liu, Department of Pathology, Xuzhou Medical Collge, 84 Huaihai West Road, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China. hongliu04@yahoo.com

Received: September 11, 2008
Revised: October 18, 2008
Accepted: October 21, 2008
Published online: November 18, 2008

Abstract

AIM: To investigate the effect of As₂O₃ and Aspirin on apoptosis of human gastric carcinoma cells SGC-7901 and to explore its possible mechanism.

METHODS: SGC-7901 cells were incubated in different concentrations of drugs, and then were divided into six groups: control group, Aspirin (2 mmol/L) group, Aspirin (1 mmol/L) group, As₂O₃ (4 μmol/L) group, As₂O₃ (2 μmol/L) group, and As₂O₃ (2 μmol/L) + Aspirin (1 mmol/L) group. 72 hours after the treatment, apoptosis rates in each group were analyzed using flow cytometry. The expressions of Bcl-2 and Bax protein were measured by immunocytochemistry assay.

RESULTS: Flow cytometry analysis revealed statistically significant difference between 2 μmol/L As₂O₃ + 1 mmol/L Aspirin group and control group, 1 mmol/L Aspirin group, 2 μmol/L As₂O₃ group (P < 0.05), while there was no statistically significant difference between 2 μmol/L As₂O₃ + 1 mmol/L Aspirin group and 4 μmol/L As₂O₃ group, 2 mmol/L Aspirin group. Immunocytochemistry showed that there was down-regulated expression of Bcl-2 protein and up-regulated expression of Bax protein in 2 μmol/L As₂O₃ + 1 mmol/L Aspirin group. Statistically significant difference was observed between 2 μmol/L As₂O₃+ 1 mmol/L Aspirin group and control group, 1 mmol/L Aspirin group, 2 μmol/L As₂O₃ group (50.21% ± 5.94% vs 91.65% ± 11.51%, 88.66% ± 10.53%, 89.27% ± 9.84%; 40.72% ± 9.54% vs 21.03% ± 4.32%, 23.07% ± 6.23%, 22.67% ± 3.16%, allP < 0.05).

CONCLUSION: As₂O₃ and Aspirin induce apoptosis of gastric cancer cells SGC-7901 possibly through suppressing Bcl-2 protein or enhancing Bax protein. Combination of As₂O₃ and Aspirin produces obvious synergistic effect.

Key Words: As₂O₃; Aspirin; Combination; Gastric cancer cells SGC-7901; Apoptosis

0 引言

三氧化二砷(As₂O₃)是中药砒霜的主要成分, 国内外使用As₂O₃治疗急性粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)取得了确定的疗效, 对其他的血液系统疾病和实体瘤的治疗正在显示出他的应用前景[1-2]. 然而As₂O₃是天然存在的一种剧毒物质, 其具有极强的氧化毒性作用, 又是一种强致畸剂, 因而限制了其在临床上的应用剂量, 剂量不足又会降低他的治疗效果. 因此, As₂O₃与其他药物联合应用, 以降低As₂O₃的用量, 降低其毒副作用, 提高疗效是值得研究的问题. 本实验就As₂O₃与Aspirin联合应用对SGC-7901细胞的凋亡及其机制进行研究, 以期为临床制定有效的化疗方案提供实验基础.

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI 1640培养液为美国Gibco公司产品; 新生牛血清购自杭州四季青生物技术材料公司; 浓缩型一抗Bcl-2、Bax及即用型二抗均为北京中山生物技术有限公司产品; Aspirin粉剂由华阴市锦前程药业有限公司赠送; SGC-7901细胞株购自中国医学科学院上海细胞所; "亚砷酸注射液"(国药准字号X19990191)由哈尔滨伊达药业有限公司生产.

1.2 方法

1.2.1 分组: As₂O₃和Aspirin处理SGC-7901细胞, 实验分为: 阴性对照组、2 mmol/L Aspirin组、1 mmol/L Aspirin组、4 μmol/L As₂O₃组、2 μmol/L As₂O₃组和2 μmol/L As₂O₃组+1 mmol/L Aspirin组.

1.2.2 细胞培养: SGC-7901细胞常规培养于新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中, 在37℃, 50 mL/L CO₂饱和湿度培养箱中贴壁培养.

1.2.3 免疫组化检测: 药物作用后72 h, 取出6孔板中贴附细胞的小玻片, 中性福尔马林固定, 采用SP法进行免疫细胞化学染色.

1.2.4 流式细胞术: 收集阴性对照组及药物作用组的细胞, PBS冲洗, 700 mL/L冷乙醇固定过夜, PBS冲洗, 使细胞终浓度2×10⁹/L, 加碘化丙啶(PI), 暗处作用30 min, 用流式细胞仪检测并分析结果.

统计学处理 各组数据均数以mean±SD表示, 用Stata8.0软件进行单因素方差分析及Scheffe法分析组间差异. 检验水准α = 0.05, P<0.05为统计学有显著性差异.

2 结果

2.1 As₂O₃和Aspirin对SGC-7901细胞凋亡的影响

流式细胞术检测, 4 μmol/L As₂O₃组、2 mmol/L Aspirin组和2 μmol/L As₂O₃+1 mmol/L Aspirin联合用药组在细胞周期G₁期前均出现明显的亚二倍体凋亡峰(图1). 各组SGC-7901细胞的凋亡率AR(图2).

图1 流式细胞术检测SGC-7901细胞凋亡情况. A: 对照组; B: 4 μmol/L As₂O₃组; C: 2 mmol/L Aspirin组; D: 2 μmol/L As₂O₃+1 mmol/L Aspirin联合用药组.

图2 As₂O₃和Aspirin单独及联合应用对SGC-7901细胞凋亡率的影响. 1: 对照组; 2: 2 mmol/L Aspirin组; 3: 1 mmol/L Aspirin组; 4: 4 μmol/L As₂O₃组; 5: 2 μmol/L As₂O₃; 6: 联合用药组.

2.2 As₂O₃和Aspirin对SGC-7901细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

2 μmol/L As₂O₃+1 mmol/L Aspirin联合应用组Bcl-2表达率降低, Bax蛋白表达率增加, 与阴性对照组、2 μmol/L As₂O₃及1 mmol/L Aspirin单药组相比, 差异均具统计学意义(P<0.05, 表1, 图3-4).

表1 As₂O₃与Aspirin作用后SGC-7901细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达 (mean±SD, %).

分组	阳性表达率
	Bcl-2	Bax	Bax/Bcl-2
阴性对照组	91.65±11.51	21.03±4.32	22.95
Aspirin(2 mmol/L)	52.34±7.18a	39.53±6.42a	63.41a
Aspirin(1 mmol/L)	89.27±9.84	22.67±3.16	25.40
As2O3(4 μmol/L)	46.50±8.83a	41.29±7.47a	74.40a
As2O3(2 μmol/L)	88.66±10.53	23.07±6.23	26.02
As2O3(2 μmol/L)+	50.21±5.94ace	40.72±9.54ace	73.75ace
Aspirin(1 mmol/L)

^aP<0.05 vs 阴性对照组;

^cP<0.05 vs 2 μmol/L As₂O₃组;

^eP<0.05 vs 1 mmol/L Aspirin组.

图3 SGC-7901中的Bcl-2表达(SP×400). A: 对照组; B: 2 μmol/L As₂O₃+1 mmol/L Aspirin联合用药组; C: 2 mmol/L Aspirin组; D: 4 μmol/L As₂O₃组.

图4 SGC-7901中的Bax表达(SP×400). A: 对照组; B: 2 μmol/L As₂O₃+1 mmol/L Aspirin联合用药组; C: 2 mmol/L Aspirin组; D: 4 μmol/L As₂O₃组.

3 讨论

As₂O₃中药名砒霜, 最初首先用于治疗急性早幼粒细胞白血病, 且取得了确定的疗效. 新近的研究发现, As₂O₃对其他多种系统肿瘤具有抑制作用, 主要机制集中在诱导肿瘤细胞凋亡[3-4]. 但As₂O₃为一种剧毒物质和强致畸剂, 限制了其在临床上的应用剂量, 降低其治疗效果, 因此如何通过联合其他药物, 提高As₂O₃疗效, 减少其临床用量, 降低其毒副作用, 是值得研究的问题. Aspirin属于非甾体类抗炎药(non-steroids-anti-inflammatory agents, NSAIDs), 是传统临床抗炎镇痛药, 近年来也用于某些肿瘤防治及研究, 发现其对多种体内移植瘤或诱发性肿瘤具有一定的抗肿瘤作用[5-6], 但机制尚未完全阐明. 我们的实验主要研究联合应用As₂O₃与Aspirin对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响, 探讨两者联合应用诱导体外SGC-7901细胞凋亡的机制, 以期为临床制定科学有效的化疗方案提供理论和实验依据.

细胞凋亡也称程序性细胞死亡, 是细胞在一系列内源性基因调控下发生的细胞主动性死亡. 凋亡相关基因众多, 其中bax、p53等基因有促进调亡的作用, bcl-2、bcl-xl等基因有抑制凋亡的作用. bcl-2与bax是其中最具代表性的基因, Bcl-2蛋白的生理功能主要是阻遏细胞凋亡, Bax蛋白的功能与Bcl-2蛋白相反. Bcl-2主要通过与Bax形成二聚体而发挥作用, 当Bcl-2表达量较高则形成异源二聚体而发挥抗凋亡作用, 而bax基因表达占优势则形成同源二聚体而发挥促凋亡作用. 种种研究表明, As₂O₃可抑制肿瘤细胞生长, 与As₂O₃调控bcl-2、bax基因密切相关[7-8]. Aspirin属于NSAIDs, 临床广泛用于消炎、解热、镇痛及抗风湿病. 研究显示NSAIDs具有较广谱的抗肿瘤作用, 尤其是作用于消化道肿瘤[9-11], 其机制包括抑制环氧化酶COX-2减少前列腺素PGE2生成和抑制NF-κB活性或降低NF-κB结合活性诱导凋亡等[12-14]. Aspirin诱导肿瘤细胞凋亡与bax基因的上调有关[15-16]. Gao et al研究表明, Aspirin可诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡, 发现Bcl-2蛋白表达减少, 同时Bax蛋白表达增加[17-18].

我们通过流式细胞术检测发现, 阴性对照组SGC-7901凋亡率仅1.55%, 表明细胞处于凋亡抑制状态, 4 μmol/L As₂O₃、2 mmol/L Aspirin或2 μmol/L As₂O₃+1 mmol/L Aspirin联合作用后72 h, SGC-7901细胞凋亡率分别上升至27.84%、10.07%和19.01%, 与阴性对照组相比, 凋亡率均显著升高(P<0.05), 而2 μmol/L As₂O₃及1 mmol/L Aspirin单用药组无明显凋亡诱导作用, 表明联合用药组较单用同浓度药的作用强, 且2 μmol/L As₂O₃+1 mmol/L Aspirin联合用药组与2 μmol/L As₂O₃及1 mmol/L Aspirin单用药组的凋亡率相比, 差异均具有统计学意义(P<0.05), 说明这两种药物联合应用, 在诱导SGC-7901细胞凋亡方面具有协同作用. 本实验结果还显示, As₂O₃与Aspirin作用于SGC-7901细胞后, Bcl-2蛋白的表达与阴性对照组相比明显降低, Bax蛋白的表达与阴性对照组相比明显增高, 说明As₂O₃与Aspirin联合应用可能是通过升高Bax/Bcl-2比率诱导细胞凋亡.

总之, As₂O₃与Aspirin联合作用于人胃癌细胞株SGC-7901, 具有协同抗肿瘤作用, 同时可以降低两药的用量. As₂O₃与Aspirin联合应用导致抑制Bcl-2蛋白表达, 增强Bax蛋白活性, 诱导细胞凋亡, 提示可能为其抑制胃癌细胞株生长的机制之一.

评论

背景资料

As₂O₃治疗APL已取得了确定的疗效, 对其他血液病和实体瘤的治疗正在显示出他的应用前景, 然而其具有极强的氧化毒性和致畸作用. 本实验针对降低As₂O₃毒副作用, 提高疗效进行研究.

同行评议者

刘绍能, 主任医师, 中国中医科学院广安门医院消化科

研发前沿

如何降低As₂O₃毒副作用且不影响其疗效一直广受重视, 有采用局部给药、改变As₂O₃的物理性状和联合用药等方法. 选用能与As₂O₃有协同作用的药物, 而降低其用量, 值得深入研究.

相关报道

As₂O₃与Aspirin对其他多种系统肿瘤具有抑制作用, 已检测出凋亡相关基因和蛋白表达, 但两者联合用药抗肿瘤及其机制未完全阐明. 所以探讨两者诱导肿瘤细胞凋亡机制是该领域研究的重点.

创新盘点

Aspirin是传统临床消炎止痛药, 近年来发现其具有一定的抗肿瘤作用, 本实验研究As₂O₃与Aspirin联合应用对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响并初步探讨其机制, 相关研究尚未见报道.

应用要点

本研究发现As₂O₃和Aspirin联合应用具有协同作用, 可同时降低两药的用量, 为临床制定化疗方案提供实验经验和理论依据.

同行评价

本研究发现As₂O₃作用于SGC-7901细胞后, Bcl-2蛋白的表达与阴性对照组相比明显降低, Bax蛋白的表达与阴性对照组相比明显增高, 说明As₂O₃与Aspirin联合应用可能是通过升高Bax/Bcl-2比率诱导细胞凋亡. 该文章有一定的科学性、创新性和可读性.

备注

编辑:李军亮 电编:郭海丽

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