组蛋白甲基转移酶SMYD3在不同HBV表达水平肝癌细胞中的差异表达

摘要

目的: 探讨HBV组蛋白甲基转移酶SMYD3在肝癌细胞中的表达与HBV感染状态相关性.

方法: 选取HBV阴性和HBV阳性的肝癌细胞株HepG2、HepG2.2.15, 利用实时逆转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)方法检测SMYD3 mRNA表达水平, Western blot检测细胞中SMYD3蛋白表达差异.

结果: SMYD3 mRNA及蛋白在HepG2.2.15的表达水平显著高于HepG2(0.92±0.12 vs 0.18±0.05, 0.28±0.03 vs 0.54±0.05, 均P<0.01), 有统计学差异.

结论: HBV可能通过上调SMYD3途径促进肝癌的恶性生物学行为.

关键词: SMYD3; 表观遗传学; 肝肿瘤; 乙肝病毒; 实时逆转录聚合酶链反应

SMYD3 expression differences in hepatoma cell lines with different HBV expression levels

Jun He, Zhao-Long Ma, Li-Bo Chen, Guo-Bin Wang

Jun He, Zhao-Long Ma, Li-Bo Chen, Guo-Bin Wang, Hepatobiliary Surgery Center, Union Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30672067.

Correspondence to: Li-Bo Chen, Hepatobiliary Surgery Center, Union Hospital, Huazhong University of Science and Technology, 1277 Jiefang Avenue, Wuhan 430022, Hubei Province, China. libo_chen@hotmail.com

Received: February 26, 2008
Revised: April 16, 2008
Accepted: May 13, 2008
Published online: June 28, 2008

Abstract

AIM: To evaluate correlation between histone methyltransferase SMYD3 expression in hepatoma and HBV infection.

METHODS: SMYD3 mRNA expressions and SMYD3 protein expression levels in HBV-negative HepG2 and HBV-positive hepatoma cell line HepG2.2.15 were determined using real time PCR and Western blot, respectively.

RESULTS: SMYD3 mRNA and protein levels were significantly higher in HepG2.2.15 than those in HepG2 (0.92 ± 0.12 vs 0.18 ± 0.05, 0.28 ± 0.03 vs 0.54 ± 0.05, both P < 0.01).

CONCLUSION: HBV may promote hepatoma cell malignancy through its SMYD3 up-regulating pathways.

Key Words: SMYD3; Epigenetics; Hepatoma; Hepatitis B virus; Real time RT-PCR

0 引言

SMYD3是最近发现的具有催化组蛋白H3-K4甲基化位点发生甲基化活性的甲基转移酶, 通过组蛋白甲基化、活化癌基因表达等在肝癌等恶性肿瘤中发挥重要的调控作用[1-2]. 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是我国肝细胞癌发生的重要原因. 研究表明, HBV可以通过破坏正常细胞凋亡, 抑制抑癌基因p53活性, 破坏DNA损伤修复, 诱导抑癌基因启动子甲基化导致抑癌基因沉默等途径发挥诱癌、促癌作用, 但关于HBV和肝癌发生、进展的关系还没完全阐明; HBV是否通过影响SMYD3等组蛋白甲基化酶表达、改变组蛋白甲基化状态来调控肝癌发生与进展还未见报道. 我们通过检测不同HBV表达水平肝癌细胞株中SMYD3的表达差异, 初步探讨HBV是否可能通过上调SMYD3途径参与肝癌发生、发展的调控.

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2, HepG2.2.15细胞由我院中心实验室保存; Anti-SMYD3(羊抗人), Anti-HBX(小鼠抗人)购自美国Abcam公司; RNA提取试剂盒TRIzol Reagant为Invitrogen公司产品, 逆转录试剂盒购自Gibco公司, 荧光定量PCR试剂盒购自Roche公司, 引物由上海Invitrogen公司合成.

1.2 方法

1.2.1 HepG2细胞和HepG2.2.15细胞培养: 分别在含100 mL/L胎牛血清的RIMP 1640培养基和DMEM高糖培养基、50 mL/L CO₂、37℃饱和湿度条件下培养, 每2-3天用2.5 g/L胰酶消化传代.

1.2.2 HepG2和HepG2.2.15细胞中HBV检测: 在6孔细胞培养板中放置无菌盖玻片, 并以细胞密度2×104/L, 2 mL/孔接种于培养板. HepG2细胞和HepG2.2.15细胞各3孔. 当细胞在盖玻片上的密度达到90%时用PBS冲洗, 40 g/L多聚甲醛固定, Anti-HBcAg以1:200比例稀释点滴细胞4℃过夜. 加SABC及DAB染色, 操作按照说明书进行.

1.2.3 肝癌细胞中SMYD3的mRNA的检测: 采用TRIzol一步法提取细胞总RNA. 逆转录后得到cDNA后行real time RT-PCR, SMYD3引物正义: 5'-TGAATGTGACTGTTTCCGTTGC-3', 反义5'-ATTGCTGCTTATGATCGCCTGG-3', 产物为172 bp; 内参照β-actin引物正义: 5'-GAACGGTGAAGGTGACAG-3', 反义5'-TAGAGAGAAGTGGGGTGG-3', 产物为168 bp; 反应参数设置95℃ 2 min; 94℃ 30 s; 57℃ 30 s; 72℃ 30 s, 循环45次; 72℃ 5min.在延伸过程中收集荧光信号, 计算样品的Ct值, 用2^-△△Ct法计算SMYD3 mRNA的表达量.

1.2.4 肝癌细胞中SMYD3蛋白表达的检测: 细胞培养融合80%, 收集细胞提取总蛋白. 将定量后的蛋白质样品每孔20 μg点样于SDS聚丙烯酰胺凝胶小孔, 100 V电泳1 h, 300 mA下转膜1.5 h, 将转好的硝酸纤维素膜用封闭液室温振荡封闭2 h, 然后加入1:200 SMYD3一抗, 37℃孵育2 h, TBS缓冲液漂洗15 min, 共3次, 再加入1:5000辣根过氧化酶标记的二抗, 37℃孵育1 h, TBS缓冲液漂洗15 min, 共3次, 增强化学发光剂(Amersham公司)显影, 胶片曝光, 结果用UVP扫描仪扫描成像.

统计学处理 各组实验分别重复3次, 计算平均值, 再进行SPSS One-way ANOVA(SNK method)方差分析, 以P<0.05为具有统计学意义.

2 结果

2.1 HepG2.2.15和HepG2细胞中HBV的检测

通过SABC法检测细胞中的HBcAg表达, 表明HepG2、HepG2.2.15分别是HBV阴性和HBV阳性细胞(图1).

图1 HepG2、HepG2. 2.15细胞中HBV检测. A: HepG2; B: HepG2.2.15.

2.2 肝癌细胞中SMYD3 mRNA的表达

Real-time RT-PCR结果显示; HepG2.2.15细胞组的SMYD3 mRNA表达量明显高于HepG2细胞组(0.92±0.12 vs 0.18±0.05 P<0.01), 具有显著统计学差异(图2).

图2 SMYD3 mRNA在不同肝癌细胞株的表达水平差异. ^bP<0.01.

2.3 SMYD3蛋白在不同肝癌细胞株中的表达差异

Western blot结果灰度值相对量显示: HepG2.215细胞组中的SMYD3也呈高表达状态, 显著高于HepG2细胞组(0.28±0.03 vs 0.54±0.05, P<0.01, 图3).

图3 肝癌细胞SMYD3蛋白的表达.

3 讨论

HBV感染是原发性肝癌的首要病因. 国内外对HBV在肝癌发生进展中的作用进行了大量的研究, 尤其是HBX基因与肝癌的关系. 目前认为HBx蛋白致癌作用主要有以下5方面: (1)HBx可上调HepG2细胞端粒酶活性,使较多的细胞进入S期[3]. 这些都表明X基因通过上调细胞端粒酶活性而抑制宿主细胞凋亡,是诱导肝细胞癌变的一条可能途径. (2)HBx可通过蛋白质-蛋白质作用阻断p53的功能. 同时, HBx对p53的转录亦有强烈的抑制作用. Park et al[4]报道, HBx可抑制p53的活性, 减少细胞周期蛋白激酶抑制剂P21Waf1/cip1蛋白表达, 延长细胞从G1期向S期的转换, 增加肝细胞基因突变的可能性. HBx能和参与核酸外切修复的ERCC竞争p53结合位点, 抑制p53对损伤核酸的外切修复作用, 增加重要基因的变异频率. HBX还可下调p53对抑癌基因PTEN的转录激活作用, 使PTEN的表达水平下降, 增加细胞恶性转化的危险性[5]. (3)HBV X破坏DNA损伤的修复, 单纯HBx在肝细胞的表达并不足以引起HCC, 环境因素与HBx的协同作用是HCC形成的主要机制. HBx并不显著增加DNA的变异率(mutation frequency, MF), 但他可使环境致癌因素如黄曲霉毒素B1、UV射线和二乙基亚硝基胺(DEN)引起的DNA损伤产生累积, 即HBx抑制了损伤DNA的修复. (4)HBx诱导肿瘤细胞的侵袭依赖于MT1-MMP和COX2活性, 一方面HBX使膜型基质金属蛋白酶-1(MTl-MMP)和环氧合酶-2(COX-2)表达上调[6-7]降解细胞周围细胞外基质(ECM)促进了肝癌细胞的侵袭和转移; 另一方面HBX促进肿瘤新生血管形成通过多环节促进了肝细胞HIF-1α的转录表达,增加了肝细胞HIF-1α蛋白质的稳定性并增强了HIF-1α对VEGF的激活作用[8]. (5)HBx激活DNA甲基化转移酶1活性使E-cadherin启动子区甲基化[9], E-cadherin表达被抑制导致细胞间的黏附作用减弱, 从而促使肿瘤细胞的转移, 从而增强肿瘤的转移和侵袭能力. 有研究报道[10], 在癌旁组织和慢性乙型肝炎中, 抑癌基因p16INK4A基因启动子甲基化与HBx蛋白高表达有关, HBx蛋白可能通过诱导p16INK4A基因启动子甲基化而使该抑癌基因失活, 这也反映了HBx在通过表观遗传方面影响抑癌基因的表达从而促进肝癌的发生. 而对HBV是否通过组蛋白甲基化参与肝癌恶性生物学行为的调控还未见报道.

组蛋白甲基化是基因表观遗传学调控的重要方式. SMYD3是具有组蛋白甲基转移酶活性的蛋白质, 通过将组蛋白H3上第4个赖氨酸甲基化改变染色质的构象, 激活相关的癌基因转录, 促进肿瘤细胞的增殖、集落形成, 抑制肿瘤细胞的凋亡[2]. Hamamoto et al[11]研究表明SMYD3在大部分的乳腺癌组中高表达, SMYD3可以调控原癌基因WNT10B的表达促进乳腺癌的发生. 我们研究曾发现, SMYD3在多个肝癌细胞株及肝癌组织中大量表达; 利用RNA干扰技术下调SMYD3表达后, HepG2细胞的增殖受到抑制并出现较为明显的凋亡[12]. 动物实验也表明SMYD3 shRNA质粒注射到裸鼠的瘤体内可以减缓瘤体的增长速度. SMYD3不仅通过癌基因活化促进肝癌的恶性表型, 还可能通过使抑癌基因RIZ1启动子CpG岛去甲基化、下调RIZ1的抑癌活性来参与肝癌的调控[13]. 但对SMYD3是否参与HBV致癌/促癌作用还需要进一步研究.

我们初步探讨了不同HBV表达水平肝癌细胞株中SMYD3表达的差异, 发现与HBV阴性的HepG2细胞相比, SMYD3mRNA和蛋白在HBV阳性的HepG2.2.15中的表达均显著增加, 提示我们肝癌细胞中SMYD3的表达可能受到HBV调控, HBV也可能通过SMYD3途径发挥致癌/促癌作用. 我们的相关研究发现抑制SMYD3表达可以下调肝癌细胞中癌基因c-myc表达[14], 而c-myc是HBV致癌的重要途径[15], 提示我们SMYD3可能在HBV癌基因激活途径中发挥重要的桥梁作用.

HBV如何调控肝癌细胞中SMYD3表达还有待于进一步阐明. 已有的研究表明, HBV可以通过多种方式参与肝癌发生的调控, 其中细胞信号途径如RAS-RAF-p38MAPK、SAPK/JNK、ERK等, 以及蛋白酶途径等是HBV致癌作用的重要环节[16]. 对肝癌细胞HBV检测表明HepG2.2.15细胞中HBV主要表达于细胞质, 我们通过基因转染发现HBX基因转染后SMYD3基因和HBX共同位于肝癌细胞质(另文发表), 提示我们肝癌细胞中HBV可能通过这些信号途径上调 SMYD3的表达和活性. SMYD3启动子上含有E2F-1结合元件是影响SMYD3活性的重要原因[17]; 而在HepG2细胞中HBV增加E2F-1的活性[18], 提示我们HBV通过增加E2F-1活性与SMYD3启动子上的E2F-1结合元件相作用, 从而调控肝癌细胞中SMYD3的表达, 是HBV阳性肝癌细胞中SMYD3表达、活性增加的重要原因.

评论

背景资料

HBV作为肝癌发生首要促进因素已被科学界公认. HBx蛋白作为一种HBV功能蛋白通过多种作用机制促使肝癌的发生和发展. SMYD3是一种组蛋白转移酶, 通过组蛋白修饰在肝癌、大肠癌等多种肿瘤的发生和进展中起着重要的调控作用. 但关于HBV是否通过SMYD3途径参与肝癌发生尚缺乏研究.

同行评议者

沈柏用, 副教授, 上海市交通大学医学院瑞金医院肝胆胰外科中心.

研发前沿

目前关于HBV研究的热点主要集中在HBX蛋白在乙肝相关性肝癌的作用和致病机制. 至于HBx和组蛋白转移酶SMYD3联系在一起的表观遗传学途径报道甚少.

创新盘点

本文首次将HBV中的HBx和组蛋白转移酶SMYD3结合到一起, 证实两者之间的相互关系, 从而为HBV从表观遗传学方面研究其促癌作用提供新的依据.

应用要点

本实验结果为研究HBV提出一个新的方向, HBV可能在表观遗传学途径通过调控SMYD3表达参与肝癌的发生与进展.

名词解释

SMYD3: 催化组蛋白H3-K4甲基化的组蛋白甲基化转移酶. SMYD3在肝癌等肿瘤中大量表达, 促进肿瘤细胞异常增殖.

同行评价

本文选题符合该领域的研究热点, 设计科学合理, 统计处理恰当, 结论可靠, 具有一定的学术价值.

备注

编辑:潘伯荣 电编:吴鹏朕

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