A型肉毒毒素对大鼠胃排空及血浆胃动素、血清瘦素的影响

摘要

目的: 探讨A型肉毒毒素(botulinum A, BTA)对大鼠胃排空及某些激素的影响.

方法: 选用♂Wistar大鼠40只, 随机分为4组: 对照组、BTA小剂量(10 U)组、中剂量(20 U)组及大剂量(40 U)组. 给药方法均为剖腹胃窦部肌层注射. 观察12 wk, 记录进食量及体质量变化. 12 wk末, 测定胃半排空时间, 放免法测定血浆胃动素和血清瘦素含量.

结果: 12 wk, 与对照组相比, 中、高剂量组大鼠进食量及体质量明显降低(24.25±1.33 g, 25.02±1.81 g vs 30.61±2.07 g; 441.54±14.64 g, 437.33±20.73 g vs 517.98±24.11 g, 均P<0.05), 胃半排时间显著延长(161.67±23.53 min, 200.33±44.37 min vs 86.83±22.98 min, P<0.05), 血浆胃动素含量减少, 差别有统计学意义(80.56±10.43 ng/L, 65.99±10.50 ng/L vs 123.65±31.10 ng/L, P<0.05); 小、中、大剂量组血清瘦素均显著低于对照组(0.99±0.13 μg/L, 0.97±0.18 μg/L, 0.83±0.23 μg/L vs 1.28±0.25 μg/L), 差别有统计学意义(P<0.05).

结论: 大鼠注射BTA后体内胃动素、瘦素含量减少, 其可能影响体内某些激素的分泌.

关键词: A型肉毒毒素; 胃排空; 胃动素; 瘦素

Effects of botulinum toxin-A on gastric emptying, plasma motilin and serum leptin in rats

Wen-Hui Liu, Qing-Sen Liu, Hui Han, Ben-Yan Wu

Wen-Hui Liu, Ben-Yan Wu, Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China

Qing-Sen Liu, Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China

Hui Han, Department of Emergency, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China

Correspondence to: Qing-Sen Liu, Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese PLA, 28 Fuxing Road, Haidian District, Beijing 100853, China. liuqs301@msn.com

Received: November 25, 2007
Revised: March 19, 2008
Accepted: May 5, 2008
Published online: June 8, 2008

Abstract

AIM: To study the effect of botulinum toxin-A (BT-A) on gastric emptying and on plasma motilin and serum leptin in rats.

METHODS: Male Wistar rats of nine weeks were divided into four groups: small dose group, middle dose group, high dose group and control group. Each rat received an intramuscular injection of BT-A into the gastric antrum. During the subsequent twelve weeks, weight and diet of every rat in four groups were recorded. At the end of the twelfth week, gastric semi-empty time (min) was determined using nuclide scan and the contents of motilin and leptin were measured using radio-immunity method.

RESULTS: Diet and weight were significantly lower in middle dose group and high dose group than those in control group (24.25 ± 1.33 g, 25.02 ± 1.81 g vs 30.61 ± 2.07 g; 441.54 ± 14.64 g, 437.33 ± 20.73 g vs 517.98 ± 24.11 g, all P < 0.05). At the twelfth weekend, gastric semi-empty time in middle dose group and large dose group were significantly longer than that in control group (161.67 ± 23.53 min, 200.33 ± 44.37 min vs 86.83 ± 22.98 min, all P < 0.05). Plasma motilin in middle dose group and high dose group were significantly lower than those in control group (80.56 ± 10.43 ng/L, 65.99 ± 10.50 ng/L vs123.65 ± 31.10 ng/L, P < 0.05). Serum leptin levels in the three treatment groups were significantly lower than that in the control group (0.99 ± 0.13 mg/L, 0.97 ± 0.18 mg/L, 0.83 ± 0.23 mg/L vs 1.28 ± 0.25 mg/L, P < 0.05).

CONCLUSION: Muscular injection of BT-A into gastric antrum in rats can decrease gastric motilin, prolong gastric emptying, cut down food intake and cause weight loss. The changes of motilin and leptin may be associated with secretion of some hormones.

Key Words: Botulinum toxin A; Gastric emptying; Motilin; Leptin

0 引言

A型肉毒毒素(botulinum A, BTA)可抑制所有副交感和胆碱能节后交感神经元ACh释放, 故被广泛用于多种消化道痉挛性疾病的治疗[1]. 国内刘庆森 et al[2]于1997年率先开展BTA治疗贲门失弛缓症, 症状缓解率达95%. 王斌[3]报告将BTA注射于贲门失弛缓症模型犬的LES内, 降低了LES的张力并使其松弛. 有关BTA对胃窦平滑肌的作用报导甚少, 本研究通过于大鼠胃窦部肌层注射BTA后, 观察大鼠胃排空的改变及血浆胃动素(MTL)、血清瘦素(LEP)含量的变化, 为其更广泛的临床应用提供新依据.

1 材料和方法

1.1 材料

♂Wistar大鼠40只, 体质量270-320 g, 购自中国人民解放军总医院动物中心. BTA(97卫药准字兰S-01号)由兰州生物制品研究所赠送, 99TCM-DTPA购于中国科学院原子能研究所), E.cam型SPECT机为德国Siemens公司产品, MTL、LEP放免药盒购于东亚放免所. TP-2000型电子天平由湘仪天平仪器厂生产.

1.2 方法

1.2.1 分组: ♂Wistar大鼠40只, 随机分为4组, 小剂量组(BTA 10 U)、中剂量组(BTA 20 U)、大剂量组(BTA 40 U)和对照组(生理盐水组). 以100 g/L水合氯醛ip麻醉后, 剑突下腹正中切口长约2.5-3 cm, 暴露胃窦部. 小、中、大剂量组于胃窦部四壁(大弯、小弯、前壁、后壁)各点分别注射药物2.5、5和10 U, 均为BTA溶液(以生理盐水稀释)0.1 mL. 对照组同样方法注射生理盐水0.1 mL.

1.2.2 体质量与进食量检测: 从购进之日起, 每只大鼠分笼独立饲养, 正常饲食、饮水, 每天称体质量与进食量至术后4 wk末各组大鼠体质量完全恢复术前值后, 改为每3 d称体质量及记录进食量1次, 至12 wk末. 采用漏底鼠盒, 在盒子下面的托盘上, 加料位置下, 垫硬纸盒以接住漏下的鼠料, 进食量 = 加的总量-余量-漏到底盘上的料量. 为消除生物节律影响, 均于上午8时开始称质量.

1.2.3 核素扫描胃固相排空实验: 12 wk末, 将核素99TCM-DTPA 3 mci注入生鸡蛋黄内煮熟、打成匀浆后稀释至15 mL作为灌胃液. 大鼠禁食24 h, 取灌胃液3 mL(含核素0.6 mci)ig后, 连同支架将大鼠放置于SPECT机检查床上. ig 10 min后开始采集图像, 1 桢/min, 每桢采集60 s, 共采集90桢. 采用ROI技术勾画出胃的轮廓及感兴趣区(图1). 绘出时间-放射性曲线, 按公式计算各时相胃排空率: T时胃排空率(%) = 总放射性-t时胃内放射性K/总放射性×100%

图1 动态采集图像感兴趣区(ROI)勾画方法.

1.2.4. 放射免疫分析法测定血浆MTL、血清LEP含量: 12 wk末, 大鼠心腔内采血, 每只动物血样分2份, 一份加抗凝剂, 另一份不加抗凝剂, 以4000 r/min 4℃离心, 取上清, -20℃冰箱保存, 用于检测MTL及LEP含量. 操作方法按放免药盒说明书进行.

统计学处理 计量资料以mean±SD描述, 组间变量比较用单因素方差分析, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 大鼠进食量

1 d进食量实验组与对照组间无差异(P>0.05). 观察1 wk, 术前2 d各实验组进食量与对照组比较, 差异无统计学意义(P>0.05). 术后1 wk, 小剂量、大剂量组进食量与对照组有显著差异(P<0.05). 至术后4 wk和8 wk, 各实验组进食量显著低于对照组(P<0.05). 术后70 d起, 小剂量组与对照组进食量相比较, 差异无统计学意义(P>0.05). 12 wk末, 中、大剂量组进食量与对照组间仍有显著差异(P<0.05, 表1).

表1 大鼠进食量的变化 (mean±SD, g).

分组	进食
	初始	术前	术后4 wk	术后8 wk	术后12 wk
小剂量组	23.74±3.66	29.48±1.96	24.49±1.93a	25.90±1.51a	28.54±2.17
中剂量组	24.16±4.08	29.54±1.87	22.98±2.30a	24.81±1.05a	24.25±1.33a
大剂量组	23.98±4.11	30.76±1.64	20.76±1.95a	24.87±1.90a	25.02±1.81a
对照组	27.78±4.74	29.66±2.73	31.78±3.34	30.21±1.79	30.61±2.07

^aP<0.05 vs 对照组.

2.2 大鼠体质量

各实验组与对照组的初始体质量无差别(P>0.05); 每天记录体质量, 至术前组间比较体质量无差异(P>0.05), 具有可比性. 中、大剂量组最大体质量下降值与对照组比较差别有统计学意义(P<0.05). 中、大剂量组最大体质量下降占术前体质量百分比与对照组比较差别有统计学意义(P<0.05, 表2).

表2 大鼠体质量变化情况 (mean±SD, g).

分组	体质量
	初始	术前(术当日)	术后12 wk	最大体质量下降	最大体质量下降占术前体质量百分比(%)
小剂量组	293.20±11.30	314.30±11.59	498.73±16.23	18.42±3.29	5.83±1.07
中剂量组	290.74±9.31	311.98±9.23	441.54±14.64a	23.26±5.71a	7.45±1.77a
大剂量组	296.72±9.29	318.00±7.19	437.33±20.73a	30.73±5.69a	8.72±3.76a
对照组	293.06±11.63	307.02±11.95	517.98±24.11	12.44±7.63	4.06±2.56

^aP<0.05 vs 对照组.

2.3 核素胃排空实验

12 wk末中、大剂量组胃半排时间(分别为161.67±23.53 min、200.33±44.37 min)显著长于对照组(86.83±22.98 min), 且差别有统计学意义(P<0.05), 小剂量组胃半排空时间(110.5±26.67 min)虽长于对照组, 但两组间无差别.

2.4 血浆MTL及血清LEP水平

12 wk小剂量组与对照组间血浆MTL水平差别无统计学意义(P>0.05); 中剂量组、大剂量组均低于对照组, 且差别有统计学意义(P<0.05); 小、中、大剂量组血清LEP均低于对照组, 差别有统计学意义(P<0.05, 表3).

表3 12 wk血浆MTL及血清LEP含量 (mean±SD).

分组	MTL(ng/L)	LEP(mg/L)
小剂量组	114.49±15.93	0.99±0.13a
中剂量组	80.56±10.43a	0.97±0.18a
大剂量组	65.99±10.50a	0.83±0.23a
对照组	123.65±31.10	1.28±0.25

^aP<0.05 vs 对照组.

3 讨论

肉毒毒素(botulinum toxin, BT)是由厌氧的梭状芽孢肉毒杆菌产生的外毒素, 属于一种高分子蛋白的神经毒素. 根据毒素抗原的不同, 分为7个血清型, 其中A型毒力最强[4], 也是临床上应用最广泛的一型. BTA与神经肌肉接头处突触前膜胆碱能神经末梢快速而强烈的结合, 选择性裂开突触蛋白质(SNAP-25)的锌依赖性蛋白酶而抑制ACh的释出, 阻断神经肌肉的传导[5]. 除了强烈阻滞骨骼肌神经外, 还可抑制胃肠道平滑肌的收缩, 广泛用于治疗贲门失弛缓症、Oddis括约肌功能失调、出口梗阻型便秘、肛门痉挛等疾病, 且疗效显著[6]. 胃肠运动受肠神经系统(ENS)、中枢神经系统以及体液因子的调节[7]. ENS在调节胃肠运动中起重要作用, 含多种神经元. 胃肠运动的主要兴奋性神经递质是ACh. MTL、SP是促进胃肠运动的主要胃肠激素, 而VIP、NO和ATP是胃肠运动的主要抑制性神经递质.

在胃内, 外来的迷走神经介导餐后胃窦收缩和胃底舒张, 研磨固体食物, 有选择的将固体和液体食物推送入十二指肠, 近端胃(胃底和口侧1/3胃体)通过持续收缩对胃内容物产生恒定的压力, 对胃液体排空起主要作用. 相反, 远端胃(胃体远端2/3和胃窦)控制固体的排空[8]. 本研究中, 胃窦部肌层注射BTA后, 大鼠体质量和进食量的下降表明胃固体食物排空受到强烈抑制. 推测BTA可能通过抑制胃窦部兴奋性神经递质-ACh的释放, 降低了蠕动波的强度, 选择性的干扰了固体食物的胃排空, 产生早饱感, 因此进食量减少, 能量摄入减低, 体质量增长减慢. 而胃窦的动力改变并不影响液体的排空, 治疗期间动物没有因脱水死亡, 这与胃液体食物排空不受影响相一致. 应用BTA除皱有剂量依赖性, 一般来说剂量越大作用时间越长, 麻痹效果越强, 但当超过50 kU/L时, 效果并不增加[9]. 本实验发现小剂量组减轻体质量和进食量的作用维持时间较短, 而中剂量组与大剂量组间并未见到显著差别, 这提示BTA作用于胃窦部时的量效关系也可能与上述相同. 另外, 本实验结果与Gui et al[10]的BTA治疗大鼠体质量减轻和摄食减少的报道相符合. 而且, 我们也通过核素扫描胃固相排空试验证明了BTA治疗组大鼠胃半排时间延长, 提示大鼠胃窦部注射BTA可导致胃排空减慢. 分析胃排空减慢的机制主要是BTA通过抑制胃窦部ACh的释放, 使胃窦平滑肌的收缩幅度和频率均有不同程度下降, 导致胃窦运动异常.

MTL是M0细胞分泌的由22个氨基酸组成的直链多肽, 在消化间期, MTL周期性释放, 使胃和上部小肠产生IMCⅢ相, 并诱发胃强烈收缩和小肠明显的分节运动, 对胃内容物排空起主要作用[11]. Jonsson et al[12]报道胃动力障碍者胃排空延迟, IMCⅢ相减少、缺失. 普遍认为迷走神经能影响MTL的释放. 本研究发现胃窦部注射中、高剂量BTA 12 wk后, 与对照组比较, 大鼠血浆MTL含量下降, 推测可能是BTA抑制了胆碱能神经末梢突触前膜释放Ach, 发生了化学性去神经支配, 进而使MTL分泌减少. 然而, BTA是否也直接作用于胃窦部的M0分泌细胞, 阻断了MTL的分泌通路, 而使其分泌减少, 本实验未做深入探讨, 国内外也未见相关报道, 有待进一步研究.

LEP又名消脂素, 分子量为16 kDa, 由脂肪细胞ob基因编码合成, 释放入血[13]. LEP作为调节能量平衡的重要激素, 可通过多种途径发挥作用. LEP的中枢作用主要通过下丘脑-神经肽通路实现. Williams et al[14]认为体质量增加时LEP分泌增加, 作用于下丘脑原阿片黑皮素(POMC)系统, 经M4受体, 引起一系列对肥胖的反应, 即摄食减少, 脂肪消耗; 同时, LEP与下丘脑的LEP受体结合, 抑制神经肽Y(NPY)的释放, 导致食欲下降, 能耗增加, 减少体质量. 反之亦然. 此外, 也通过兴奋交感神经系统, 提高组织代谢, 动员机体的脂肪储存, 促进能量的转化和消耗[15], 有研究认为LEP尚可直接作用于体内的脂肪细胞, 抑制脂肪的合成. 本研究中, 三个实验组大鼠的终点体质量均低于对照组, 瘦素水平也低于对照组, 符合LEP与体质量及脂肪含量正相关. LEP通过中枢神经及外周机制, 起到抑制食欲、减少能量摄取、同时通过提高代谢率而增加能量消耗及转化, 抑制脂肪合成, 减少脂肪的堆积而使体质量减轻的作用.

评论

背景资料

肉毒毒素(BT)是由厌氧的梭状芽孢肉毒杆菌产生的外毒素, 属于一种高分子蛋白的神经毒素. 根据毒素抗原的不同, 分为7个血清型, 其中A型毒力最强, 也是临床上应用最广泛的一型.

同行评议者

陈卫昌, 教授, 苏州大学附属第一医院消化内科

研发前沿

有关BTA对胃动力的作用机制正成为研究热点, 国外学者分别将BTA注射于动物及肥胖患者的胃窦平滑肌, 降低了胃动力, 达到减轻体质量的目的. 但是对上述现象的机制研究甚少.

创新盘点

本文通过大鼠胃窦部肌层注射BTA, 除记录大鼠体质量及进食量变化外, 还通过核素扫描方法测定胃固相排空速率, 并检测血浆胃动素, 血清瘦素水平变化, 进一步探讨BTA对胃排空及胃肠激素的影响.

应用要点

本实验为BTA更广泛的临床应用提供新依据. 不久, BTA可能成为肥胖症治疗的有力武器.

同行评价

本研究内容新颖, 结果可信, 对探索肥胖的治病策略有一定的研究应用价值.

备注

编辑:李军亮 电编:何基才

参考文献

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