修回日期: 2008-03-08
接受日期: 2008-05-20
在线出版日期: 2008-05-28
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一个严重的公共卫生问题, 特别是在我国, 约有1.2亿人为慢性HBV携带者. 对已感染HBV者, 目前治疗效果尚不理想, 生物治疗为其提供了新的思路. 理想的载体系统是决定生物治疗效率的重要因素. 腺病毒载体由于自身的优势在乙型肝炎生物治疗研究中受到越来越多的重视. 本文就腺病毒载体在乙型肝炎生物治疗研究中的应用作一综述.
引文著录: 韩红霞, 唐红. 腺病毒载体在乙型肝炎生物治疗中的应用. 世界华人消化杂志 2008; 16(15): 1649-1654
Revised: March 8, 2008
Accepted: May 20, 2008
Published online: May 28, 2008
Hepatitis B virus (HBV) infection is a worldwide public health problem. Especially in China about 120 million are estimated to be HBV chronic carriers. For those infected with HBV, there has been no curable treatment. However, biotherapy provides a new clue for future treatment. An appropriate vector is the essential factor in determining efficiency of biotherapy. Owe to its own properties, Adenoviral vector has gained increasing interest in the biotherapy of HBV infection resently. This review focused on the progress in the biotherapy of HBV infection using adenoviral vector.
- Citation: Han HX, Tang H. Application of adenoviral vector in biotherapy for hepatitis B virus infection. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(15): 1649-1654
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v16/i15/1649.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v16.i15.1649
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染所致的乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的传染病, 不仅感染人数众多[1-2], 且持续HBV感染易导致肝硬化和肝细胞癌等的发生[3-5]. 我国约有1.2亿人为慢性HBV携带者, 对已感染乙型肝炎病毒HBV者, 目前常用的化学药物及免疫疗法效果尚不够理想. 生物治疗的问世及其迅速发展为乙型肝炎的治疗提供了新的思路, 基因治疗是其最重要的一个方面. 理想的载体系统是决定生物治疗效率的重要因素. 腺病毒载体由于包装容量大、感染效率高、外源基因表达水平较高及相对安全等优点已成为目前最常用的生物治疗载体之一. 由于腺病毒本身具有一定的嗜肝性[6], 肝脏又是重组腺病毒基因表达的主要器官[7], 腺病毒载体在乙型肝炎生物治疗研究中受到越来越多的重视. 腺病毒载体用于抗HBV生物治疗的研究必将促进乙型肝炎生物治疗向临床应用的深入发展. 本文就腺病毒载体在乙型肝炎生物治疗研究中的应用作一综述.
腺病毒的毒粒无包膜, 基因组为dsDNA, 长约36 kb, 外包被二十面体对称的蛋白质衣壳. 早期转录基因有6个: ElA、ElB、E2A、E2B、E3和E4, 大多编码基因表达调节蛋白, 与病毒复制及晚期基因表达的活化有关. 晚期转录基因有5个: L1-L5, 大多编码结构蛋白. 人类腺病毒已发现49 个血清型, 分为A-F 6个亚群. 目前应用的腺病毒载体主要是在病原性较低的人类腺病毒C亚群Ad2和Ad5的基础上构建的.
腺病毒载体作为目前最常用的生物治疗载体之一具有包装容量大、感染效率高、外源基因表达水平较高且相对较安全等优点[8], 但也存在一些不足[9]: 如免疫原性较强, 用量较大时有一定的毒性, 不能持续表达所需产物及需重复给药等, 从而在一定程度上制约其临床应用. 因此, 各国学者正在通过不同方式对腺病毒载体进行改造, 以降低其免疫原性, 增加外源基因表达.
第一代腺病毒载体[10]去除E1区(为病毒复制所必需)和E3区(与逃避宿主的免疫反应有关), 为复制缺陷型腺病毒, 需辅助细胞反式补偿E1区功能才能包装出病毒颗粒. 但在宿主细胞内仍有低水平的病毒蛋白表达, 二次应用时宿主强烈的免疫反应使外源基因的表达迅速消失, 且高滴度时有一定的细胞毒性. 为降低免疫反应, 一种方法是尽量去除腺病毒的基因. 第二代腺病毒载体[9]在去除E1、E3的基础上进一步敲除E2、E4区. 近年来又出现一种叫"无肠腺病毒(gutless adenovirus)"又名辅助病毒依赖型腺病毒(help-dependent adenovirus, HD-Adv)的第三代腺病毒载体[11-12], 他一般是由两端反向末端重复序列、包装信号和末端结合蛋白等组成. 他几乎完全去除腺病毒基因, 不仅大大降低免疫反应, 而且使可插入的外源基因长度达36 kb, 这样就可以插入调控序列, 使外源基因的表达具有可调控性, 但这种载体需依赖辅助病毒反式提供才能够复制和包装, 故存在病毒滴度不高、辅助病毒污染等缺点, 尚需更进一步改进.
亦有学者对腺病毒载体的纤维结构进行改造[13-15]使其靶向转导以降低免疫反应, 或者构建携带器官特异性启动子的重组腺病毒[16]实现目的基因的靶向转录表达, 使其更安全、有效. 利用人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因启动子替代野生型腺病毒E1A自身启动子构建肿瘤特异性增殖型腺病毒载体AdhTERT. 在AdhTERT载体上插入外源抗肿瘤基因[17], 在肿瘤细胞中病毒复制发生溶瘤作用, 另一方面hTERT基因启动子调控外源插入基因特异表达, 产生抗肿瘤作用.
核酶(ribozyme)是具有裂解活性的RNA分子, 能特异地结合并切割靶RNA分子. 通过设计针对HBV基因编码区不同位点的锤头状核酶, 可特异性识别并切割HBV特定基因编码区mRNA, 从而抑制HBV基因表达. 在证实核酶对HBV基因表达有抑制作用的基础上, 为进一步提高核酶的表达效率及向应用过渡, 李谨革 et al[18]将针对HBV C区(1942-1944、2029-2031、2063-2065位点)的多位点核酶克隆入腺病毒载体中, 将重组腺病毒RAdCMV-Rz123感染2.2.15细胞, 可表达出目的核酶, 并发挥核酶的剪切作用, 对HBeAg表达的抑制率最高达87.1%, 比他们[19]在前期实验中应用的其他载体介导表达的多位点核酶对HBV C基因表达的抑制率都高(其中, pDCTRZA-Rz123即由表达核酶的理想启动子tRNA所启动表达的多位点核酶对HBV C基因表达的抑制率最高, 为81%). 证实重组腺病毒表达的多位点核酶对HBV基因表达有明确的抑制作用, 提示核酶可能是一种有效的抗病毒手段, 也说明了腺病毒载体的实用性, 为将来用于临床治疗乙型肝炎提供了一定的理论依据.
RNA干扰(RNA interference, RNAi)[20]是短片断双链小干扰RNA(small inter fering RNA, siRNA)诱导序列高度同源的mRNA降解的转录后基因沉默机制. 在应用RNAi抗HBV感染的研究中, 在体外细胞和动物体内均已证实siRNA对HBV具有较强的抑制作用[21-23]. 质粒载体构建方便, 在筛选有效siRNA靶位时被广泛采用. 但是, 质粒载体也存在一些不足, 如转染效率低、目的基因表达时间短暂. 体内试验目前普遍采用小鼠尾静脉高压注射质粒, 通过快速注射大量液体的方法引起小鼠一过性右心衰使质粒进入肝脏, 这种方法有一定的技术难度且对小鼠影响较大, 显然不适合用于以后的临床治疗. 为克服质粒载体上述缺点, Uprichard et al[24]构建了携带针对HBV基因组重叠区域的polⅢ-siRNA表达框的重组腺病毒AdEasy-shRNA, 在体外HBV阳性肝细胞株中, 表达shHBV546和shHBV765, 均显著抑制了HBV mRNA的表达. 尾静脉注射2×109 pfu重组腺病毒将HBV shRNA导入复制型HBV转基因小鼠体内, 结果肝内HBV RNA转录水平、血清HBsAg和HBeAg分泌水平均明显下降. 在干扰素受体缺陷的HBV转基因小鼠, 同样观察到shRNA对HBV RNA转录、HBsAg和HBeAg 分泌直接特异的抑制作用, 排除了腺病毒感染诱发机体非特异的干扰素抗病毒反应. 可能是由于第一代腺病毒载体潜在的毒性作用, 第20天时90%的重组腺病毒被清除. 尽管如此, 该研究用腺病毒载体介导siRNA运输, 首次验证了siRNA对已存在的HBV基因转录和表达特异的抑制作用, 对RNAi将来用于临床治疗慢性HBV感染具有指导意义.
Carmona et al[25]利用RNA polⅢ的启动子U6合成了一系列针对HBx保守序列的shRNA, 将shRNA 5、shRNA 6表达框分别克隆至腺病毒载体构建了重组腺病毒ADV shRNA 5和ADV shRNA 6, 尾静脉注射5×109 pfu重组腺病毒将shRNA导入HBV转基因小鼠, 二者均显著降低了小鼠血清中HBsAg和HBeAg的含量, 血清中HBV DNA也有明显下降. 表明腺病毒载体介导的针对HBx特异序列的shRNA能够较显著地抑制HBV复制, 有望成为应用RNAi治疗慢性HBV感染的候选靶位, 具有一定的临床应用前景.
乙肝疫苗能比较有效地预防HBV的感染. 随着基因重组技术及免疫学的发展, 不仅使得常规疫苗实现了优化组合, 而且出现了免疫复合物性疫苗、DNA疫苗、DC疫苗等新型疫苗, 为利用乙肝疫苗来防治HBV感染提供了新思路. DNA疫苗[26]是把编码某种免疫原的外源基因克隆到真核表达载体上, 再以重组体免疫机体, 引起特异性的免疫应答, 从而达到预防和治疗疾病的目的. DNA疫苗虽然比常规疫苗具有明显的优势, 既安全又可持续诱导体液免疫和细胞免疫[27], 但是, 由于质粒转导效率低, 体内只有十分有限的DNA分子被抗原递呈细胞尤其是树突状细胞(dendritic cell, DC)摄取, 影响了其免疫效果. 为了提高DNA疫苗的免疫应答需改善DNA的运输或/和使用有效的免疫佐剂, 或者更为有效的是活化DC, 以恢复和增强DC的抗原递呈功能.
腺病毒载体已被证实较质粒载体有更高的基因转移效率[28-32,34]和诱导更强的保护性免疫(尤其是特异性CTL细胞免疫)[29-32], 作为疫苗载体具有明显的优势, 已被广泛应用于新型抗病毒基因疫苗的研究中[31-33]. Isogawa et al[34]研究发现, 肌内免疫100 mg表达HBV中分子包膜蛋白的质粒pCMV-S2.S和静脉感染2×109 pfu携带1.3倍HBV基因组的复制缺陷型重组腺病毒Ad-HBV, 二者诱导均产生了针对包膜蛋白的特异性CTL 免疫应答, 但有不同的分布: 前者优先聚集于脾脏, 也存在于引流淋巴结和外周血; 而后者主要存在于肝脏. 表明静脉感染Ad-HBV可产生靶向肝脏的特异性CTL免疫应答, 这对主要依赖细胞免疫以清除肝内HBV的乙型肝炎的治疗尤为有效. 提示腺病毒载体是一种具有前途的抗HBV基因疫苗载体.
He et al[35]构建了携带HBsAg及共刺激因子B7-1编码基因的重组腺病毒RAd1310和仅携带HBsAg编码基因的重组腺病毒RAd1312, 分别免疫BALB/c小鼠, 在小鼠体内都观察到了HBsAg的有效表达, 都产生了针对HBsAg特异性的CTL 应答及特异性抗体, 而共表达HBsAg及B7-1的重组腺病毒RAd1310获得了较强的CTL应答及抗体滴度, 提示重组腺病毒能诱导强而有效的细胞免疫, 共刺激因子B7-1可增强特异性细胞免疫和体液免疫. 周智 et al[36]构建了共表达HBsAg及B7-2的重组腺病毒rAdv-HBs-B7-2, 免疫小鼠亦产生了有效的免疫应答, 且在低剂量时未观察到明显副作用. 以上研究利用腺病毒载体介导HBsAg与共刺激因子共表达, 成功地诱导了有效的细胞免疫及体液免疫, 这正是疫苗发展的方向, 为研制具有预防和治疗双重作用的新型疫苗提供了新思路.
在病毒感染和肿瘤发生中, 存在DC抗原递呈功能缺陷. 提高DC抗原递呈功能, 诱导强而有力的特异性细胞免疫已成为抗病毒和肿瘤免疫治疗的新途径. 目前提高DC抗原递呈功能的方法有两种: 抗原多肽冲击致敏DC疫苗和基因修饰DC疫苗. 其中, 基因修饰DC疫苗能诱导出更强而持久的CTL细胞免疫[37-39]. 已有研究证明腺病毒载体能介导目的基因高效转染DC[40-43,46], 而并不影响DC的表型、抗原递呈功能和诱导特异性的免疫应答[43-45,47], 是介导基因修饰DC理想的载体系统. 黄茵 et al[46]在成功构建携带HBsAg编码基因的重组腺病毒Ad-S, 并观察到能高效转染小鼠骨髓DC和表达HBsAg的前期实验基础上, 他们最近的研究表明[47], Ad-S转导的DC能诱导比HBsAg蛋白冲击DC及DNA疫苗更强的Ⅰ型免疫应答和针对HBsAg的特异性CTL细胞免疫, 对HBV转基因小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平和肝内HBcAg和HBsAg表达均有较迅速和明显的抑制作用. 腺病毒载体介导抗原基因修饰的DC疫苗显示了更强的抗HBV的潜力, 有可能成为慢性乙型肝炎免疫治疗的新的有效手段.
细胞内抗体是指将所需抗体的编码基因导入靶细胞, 在其内表达出具有生物活性的抗体并与相应抗原结合, 以达到治疗的目的. 单链抗体ScFv是细胞内抗体技术最常用的抗体形式. 汤正好 et al[48]利用AdEasy系统构建了表达抗-HBc ScFv重组腺病毒Ad-ScFv, 获得了较高的病毒滴度, 感染真核细胞后高效表达抗-HBc ScFv, 且表达的抗-HBc ScFv具有HBcAg特异性结合活性, 为ScFv的进一步研究及开展乙型肝炎基因免疫治疗提供了一定的实验基础. 另外, 在抑制性多肽、自杀基因抗HBV的研究中, 腺病毒载体亦常被用来介导其转基因表达. Scaglioni et al[49]构建了携带HBV核心蛋白显性失活突变体(dominant negative mutant)编码基因的重组腺病毒AdHBV DN, 感染HepG2.2.15, 2 d感染率达90%-95%, 明显地抑制HBV的复制, 抑制率达90%. 与逆转录病毒相比, 腺病毒载体介导的HBV DN显示了更高的抗病毒效率. Gong et al[50]构建了linker介导的乙型肝炎靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease, TR)重组腺病毒RAd/TRL, 与pcDNA3.1载体相比, 证实了腺病毒载体的有效性.
生物治疗是一种前景十分好的抗HBV治疗手段, 但要真正实现生物治疗的临床应用还需要许多相关方面更深入的研究. 腺病毒载体由于转导效率高、外源基因表达水平较高、相对较安全等优点被广泛应用于生物治疗的研究中, 又由于其具有一定的嗜肝性亦被肝病研究者青睐. 腺病毒载体还有很多技术问题需要解决, 最迫切的是如何降低免疫原性及细胞毒性. 随着对腺病毒分子生物学研究的进一步深入及乙型肝炎发病机制的全面了解, 开发出能够应用于临床治疗乙型肝炎的重组腺病毒制剂的前景十分乐观.
生物治疗已成为癌症治疗的第四模式, 正试用于严重威胁人类健康的病毒性疾病的治疗. 腺病毒载体作为目前最常用的生物治疗载体之一, 在乙型肝炎生物治疗研究中受到越来越多的重视.
陈建杰, 主任医师, 上海中医药大学附属曙光医院(东部)肝病科.
乙型肝炎生物治疗是近年来研究的热点, 更为有效的载体系统-腺病毒载体的开发促进了乙型肝炎生物治疗更深入的研究.
Gong et al构建了linker介导的乙型肝炎靶向核糖核酸酶(TR)重组腺病毒RAd/TRL, 与pcDNA3.1载体相比, 证实了腺病毒载体的有效性.
本文结合乙型肝炎生物治疗研究进展, 客观阐述了腺病毒载体的作用: 显示出不错应用前景的同时也有不足之处, 同时提出进一步研究的方向.
随着生命科学与生物技术的不断发展, 近年来乙型肝炎生物治疗研究取得了重大进展, 有可能成为预防和治疗慢性HBV感染的新的有效途径.
本文引用参考文献比较全面, 客观地指出腺病毒载体在应用中的不足, 显示出不错的应用前景, 同时提出进一步的研究方向, 是一篇较好的综述.
编辑:李军亮 电编:吴鹏朕
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