基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2008. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2008-04-08; 16(10): 1059-1063
在线出版日期: 2008-04-08. doi: 10.11569/wcjd.v16.i10.1059
β-榄香烯脂质体体内外对消化系肿瘤的抑制作用
王士勇, 杨振君, 于环, 杜微丽, 刘飒, 张哲, 张远, 邓英杰
王士勇, 于环, 杜微丽, 刘飒, 张哲, 张远, 中国医科大学附属第四医院生物治疗科 辽宁省沈阳市 110032
杨振君, 中国医科大学附属第二医院信息科 辽宁省沈阳市110004
邓英杰, 沈阳药科大学药学院 辽宁省沈阳市 110016
王士勇, 博士后, 副教授, 主要从事肿瘤生物治疗和干细胞移植.
基金项目: 教育部归国博士启动课题资助项目, No. 2004-527.
作者贡献分布: 王士勇与杨振君对此论文所作贡献均等; 此课题由王士勇与杨振君设计; 研究过程由王士勇、于环、杜微丽、刘飒、张哲及张远操作完成; 研究所用的新试剂由邓英杰提供; 数据分析由王士勇、杨振君完成; 本论文写作由王士勇、杨振君及于环完成.
通讯作者: 王士勇, 110032, 辽宁省沈阳市于洪区崇山东路4号, 中国医科大学附属第四医院生物治疗科. sywang66@yahoo.com
电话: 024-62043763 传真: 024-62571119
收稿日期: 2008-02-02
修回日期: 2008-03-19
接受日期: 2008-03-28
在线出版日期: 2008-04-08

目的: 评价β-榄香烯脂质体注射剂实验性治疗消化系肿瘤的作用.

方法: 用细胞培养方法测定β-榄香烯脂质体及其乳剂对5株人消化系癌细胞株和1株人胚肺成纤维细胞的半数抑制浓度(IC50); 建立肝癌H22昆明鼠实体瘤和腹水模型, 尾静脉注射高(80 mg/kg)、中(40 mg/kg)、低(20 mg/kg)剂量β-榄香烯脂质体, 测定其在动物体内的抑瘤率和生命延长率, 注射葡萄糖和40 mg/kg β-榄香烯乳剂注射液作为阴性和阳性对照.

结果: β-榄香烯脂质体及乳剂对5株人消化系癌细胞株的IC50分别为34.1±4.5 mg/L-51.4 ± 4.2 mg/L和41.5±4.7 mg/L-82.3±8.8 mg/L, 前者约为后者的1/2. 在实体瘤鼠, 高、中、低剂量β-榄香烯脂质体和乳剂的抑瘤率分别为47.4%-50.8%、38.2%-45.0%、23.2%-28.2%和21.8%-43.0%, 平均瘤质量明显低于葡萄糖组(t>4.09, P<0.05). 在腹水瘤鼠, 脂质体和乳剂较葡萄糖组生存期延长51.3%-153.0%(t>7.92, P<0.05), 中、高剂量脂质体组较乳剂组明显延长(t>4.64, P<0.05). β-榄香烯脂质体的刺激症状、尾静脉炎明显低于乳剂组.

结论: β-榄香烯脂质体较乳剂有明显抗肿瘤作用和较低的副作用.

关键词: 消化系统; 肿瘤; β-榄香烯; 脂质体; 抗肿瘤作用
引文著录: 王士勇, 杨振君, 于环, 杜微丽, 刘飒, 张哲, 张远, 邓英杰. β-榄香烯脂质体体内外对消化系肿瘤的抑制作用. 世界华人消化杂志 2008; 16(10): 1059-1063
In vivo and in vitro anti-tumor effects of β-elemene liposome
Shi-Yong Wang, Zhen-Jun Yang, Huan Yu, Wei-Li Du, Sa Liu, Zhe Zhang, Yuan Zhang, Ying-Jie Deng
Shi-Yong Wang, Huan Yu, Wei-Li Du, Sa Liu, Zhe Zhang, Yuan Zhang, Department of Cancer Biotherapy, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110032, Liaoning Province, China
Zhen-Jun Yang, Department of Communication, the Second Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Ying-Jie Deng, School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
Supported by: the Scientific Research Foundation of State Education Ministry for the Returned Overseas Chinese Scholars, No. 2004-527.
Correspondence to: Dr. Shi-Yong Wang, Department of Cancer Biotherapy, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, 4 Chongshan Eastern Road, Yuhong District, Shenyang 110032, Liaoning Province, China. sywang66@yahoo.com
Received: February 2, 2008
Revised: March 19, 2008
Accepted: March 28, 2008
Published online: April 8, 2008

AIM: To investigate the inhibitory effects of β-elemene liposome on digestive tumors in vitro and in vivo.

METHODS: Five digestive tumor cell lines and one human lung embryonic fibroblast cell line were used to test the IC50 values of β-elemene liposome in vitro by cell culture. H22-bearing Kunming mice were treated with injection of β-elemene liposome through the tail vein at 20, 40 or 80 mg/kg to establish solid and ascites tumor models. Mice treated with glucose or elemene emulsion served as negative or positive controls, respectively. The anti-tumor effects, survival and side effects of β-elemene liposome observed and compared between different groups.

RESULTS: IC50 values of β-elemene liposome and elemene emulsion for the five digestive tumor cell lines were from 34.1 ± 4.5 to 51.4 ± 4.2 mg/L and 41.5 ± 4.7 mg/L to 82.3 ± 8.8 mg/L, respectively, and IC50 of the former was half of the later. In solid tumor models, the inhibitory rates of 80-, 40- or 20-mg/kg β-elemene liposome and elemene emulsion were 47.4%-50.8%, 38.2%-45.0%, 23.2%-28.2% and 21.8%-43.0%, respectively, and the average tumor weights were lower than those in the glucose control group (t > 4.09, P < 0.05). In ascites tumor models, the survival time was 51.3%-153.0% longer in β-elemene liposome or emulsion group than that in the glucose control group (t > 7.92, P < 0.05). Furthermore, the survival time in 80- or 40-mg/kg β-elemene liposome group was longer than that in elemene emulsion group (t > 4.64, P < 0.05). The stimulating symptoms and phlebitis of tail vein generated by injection of β-elemene liposome were slighter than those by elemene emulsion.

CONCLUSION: β-elemene liposome has greater ability to inhibit tumor growth and relieve side effects than elemene emulsion.

Key Words: Digestive system tumor; β-Elemene; Liposome; Anti-tumor effect
0 引言

榄香烯乳注射液(elemene emulsion)是我国自行研制的二类抗肿瘤药, 其主要成分为中药莪术中提取的β-榄香烯, 经过乳化剂特殊处理后和癌细胞有强力亲和性, 属于挥发性油类, 脂溶性强, 对血管的刺激作用大. 几年来, 榄香烯乳剂在临床上取得了较为广泛的应用, 但由于药物本身的特点及不良反应影响了临床的使用[1]. 为了增加疗效和减少副作用, 研究者尝试进行各种剂型的改造[2]. 本研究是将β-榄香烯用脂质体包裹, 通过体外药敏实验和静脉注射予移植了肝癌H22的昆明鼠, 观察其抗肿瘤作用、生命延长率和副作用, 为β-榄香烯脂质体进入临床试验提供依据.

1 材料和方法
1.1 材料

β-榄香烯脂质体注射剂由沈阳药科大学药学院提供[2-3], 每支2 mL, 浓度为5.0 g/L, 乳白色液体, 无沉淀, 冰箱4℃保存. 阳性对照药物为榄香烯乳注射液, 由大连金港制药有限公司生产, 规格5 g/L. 四氮唑兰(MTT)为Sigma产品. 5株人传代消化系癌细胞株为: 肝癌(BEL7402)、胃癌(MG803和SGC7901)、胰腺癌(BXCP-3)和结肠癌(CX-1), 为中国医科大学各实验室保存的细胞株, 人胚胎肺成纤维细胞(WI83)购自上海中科院细胞库. 用RPMI 1640完全培养液(含100 g/L小牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素), 在37℃、50 mL/L CO2条件下培养, 2.5 g/L胰酶消化、传代. 18-22 g昆明鼠, 购自中国医科大学动物中心, 饲养于中国医科大学动物中心动物层流系统中.

1.2 方法

1.2.1 体外实验: 采用MTT法, 取对数生长期细胞, 每孔加入8×103-1×104细胞数, 培养4 h, 再加入480 mg/L至7.5 mg/L共7个浓度的药物, 每浓度至少设3个复孔, 每块培养板设12孔溶剂对照组和3孔空白对照组, 继续培养64 h, 离心去上清, 加入5 g/L MTT溶液200 µL, 继续培养4 h; 再离心去上清, PBS洗2次, 加入200 µL的二甲基亚砜(DMSO), 振荡10 min, 充分溶解. 用酶标仪在检测波长为570 nm, 参比波长450 nm, 测定吸光度值(A值). 每株细胞的药敏实验重复3-4次.

1.2.2 体内抑瘤实验和生命延长率实验: 将生长良好的H22肝癌腹水细胞于昆明鼠右腋皮下或腹腔接种, 每只鼠接种细胞数为2×106. 接种后, 将动物随机分为5组, 每组10只; 分组后称体质量, 次日给药, 每次试验用同一种性别. 榄香烯脂质体注射液按20、40、80 mg/kg尾静脉注射给药, 每日1次, 连续7-10 d; 阳性对照组榄香烯乳剂给药浓度为40 mg/kg, 使用方法和天数同榄香烯脂质体组. 对照组给同体积的50 g/L葡萄糖注射液. 于停药后次日处死动物, 分别称体质量和瘤质量、计算抑瘤率[4]: 抑瘤率(%) = (1-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%. 在生命延长实验时, 停药后每日继续观察, 详细记录每组的死亡情况, 并测量死亡动物的体质量; 实验以开始日计算, d 60结束; 生命延长率(%) = (给药组平均存活天数/葡萄糖对照组平均存活天数-1)×100%.

统计学处理 数据用mean±SD表示, 将药物浓度及其抑制率用MicroCal Origin软件作图, 并用该软件中的四参数Logistic程序拟合β-榄香烯脂质体和乳剂对肿瘤细胞生长的抑制曲线, 求出半数抑制浓度(IC50). 用t检验比较瘤质量及生存时间的差异, 以P<0.05为有统计学差异.

2 结果
2.1 体外药敏结果

除β-榄香烯脂质体对胰腺癌BXCP-3的IC50值基本等于榄香烯乳剂外, 另4株癌细胞株的β-榄香烯脂质体IC50值均明显地低于榄香烯乳剂, 约为后者的0.5倍左右, 而对人胚胎肺纤维细胞的IC50值均等于和大于240 mg/L(表1).

表1 β-榄香烯脂质体和乳剂对人癌细胞株的IC50值(mg/L).
药物BEL7402BXCP-3SGC7901MG803CX-1WI83
乳剂80.1±3.241.5±4.772.5±6.882.3±8.862.5±4.1240
脂质体34.1±4.538.2±4.034.8±3.551.4±4.232.9±3.7>240.0
比值10.50.90.50.60.5>1.0
1为脂质体组IC50值/乳剂组IC50值.
2.2 β-榄香烯脂质体对荷肝癌H22昆明鼠的抑瘤作用

实验共进行了3次, 均为独立实验, 表2给出了1次的实验结果. 尾静脉注射榄香烯脂质体给H22荷瘤昆明鼠, 均有明确的抗肿瘤作用, 高、中、低剂量的抑瘤率分别是: 47.4%-50.8%、38.2%-45.0%、23.2%-28.2%, 乳剂组抑瘤率为21.8%-43.0%. 将高、中、低剂量脂质体组和乳剂组平均瘤质量与葡萄糖组相比, t值分别为9.27、10.60、18.85和4.09, 各治疗组平均瘤质量均明显低于葡萄糖组(P<0.01或P<0.05). 进一步将高、中、低剂量脂质体组与乳剂组平均瘤质量相比, t值为0.62-1.24, 两组间未见统计学差异(P>0.05). 榄香烯各治疗组与葡萄糖组相比, 体质量未见明显减轻, 但在尾静脉注射过程中, 榄香烯乳剂组动物呈现明显的刺激症状, 鸣叫、撕咬、活动过于活跃, 尾部末稍在注射3-4 d后即明显地坏死, 未坏死处也明显肿胀. 实验过程中无动物死亡.

表2 榄香烯脂质体对H22荷瘤昆明鼠的抗肿瘤作用 (n = 10).
药物 (mg/kg)体质量(g)
瘤质量(g)抑瘤率(%)
治疗前治疗后
葡萄糖组20.68±1.3220.17±1.732.07±0.81
LP(20)20.15±1.9919.85±2.281.59±0.35b23.2
LP(40)19.99±1.3420.41±2.201.28±0.65b38.2
LP(80)20.60±1.9020.54±3.121.09±0.75b47.4
RP(40)20.58±1.7421.32±2.291.64±0.68a21.8
LP: 脂质体榄香烯; RP: 乳剂榄香烯;
aP<0.05,
bP<0.01 vs 葡萄糖组.
2.3 生命延长率的结果

尾静脉注射低、中、高剂量的脂质体和乳剂均明显地延长了生存期(P<0.05), t值分别为7.92、13.31、16.64和10.77. 与乳剂组相比, 低剂量脂质体组未能延长生存期, 中、高剂量脂质体组明显地延长了生存期(P<0.05和P<0.01), t值分别为4.64和11.2. 体质量和尾部的改变同上述2.2实验(表3).

表3 β-榄香烯脂质体两次对H22腹水瘤昆明鼠生存期的影响.
药物(mg/kg)给药前的 体质量(g)平均生 存天数(d)延长 率(%)
第1次
葡萄糖组18.50±1.7110.0±2.7
LP(20)18.72±1.5416.3±6.5a63.0
LP(40)18.06±1.3719.3±2.7b93.0
LP(80)18.98±1.6725.3±7.4b153.0
RP(40)18.39±1.5518.4±5.8a84.0
第2次
葡萄糖组18.69±1.6111.3±2.1
LP(20)18.52±1.5317.1±8.5a51.3
LP(40)18.24±1.7319.5±2.7a72.6
LP(80)18.79±1.5926.6±10.4b135.4
RP(40)18.92±1.3517.9±7.8a58.4
LP: 脂质体榄香烯; RP: 乳剂榄香烯;
aP<0.05,
bP<0.01 vs 葡萄组瘤质量.
3 讨论

消化系肿瘤在世界各国均为常见的肿瘤, 但除了结肠癌, 因奥沙利铂或伊力替康联用5氟尿嘧啶和醛氢四氢叶酸、再加上抗表皮生长因子受体单克隆抗体治疗, 疗效有明显的提高外[5-7], 其他各种肿瘤包括肝癌、胃癌、食道癌和胰腺癌缺乏有效的化疗药物或方案[8-9]. 目前有多种药物用于消化系肿瘤的治疗, 包括用特殊方法从中药中筛选有效的抗肿瘤药物, 如榄香烯、鸭胆子油、康莱特等. 但总体上来说, 消化系肿瘤的疗效有待于进一步提高[10-12], 研制更为适合消化系肿瘤的药物和方案是当务之急.

榄香烯乳剂被广泛地应用于各种实体瘤、恶性胸、腹水及脑转移瘤等的治疗[13-14]. 从这些国内的研究结果来看, 均有一定的治疗效果, 但是由于大多研究设计上不是随机、多中心的对照研究, 难以进行荟萃分析; 从现有的Meta分析结果, 榄香烯乳剂配合放疗、化疗等能增强治疗效果[15-16]. 但是, 在临床应用过程中, 发热和静脉炎等主要副作用限制了榄香烯乳剂的应用.

榄香烯乳剂主要成分为b-榄香烯, 同时含有γ、δ榄香烯. 乳剂作为传统的药物赋型形式, 具有制备容易、给药方便等特点. 但也有不利的方面, 在热力学上属不稳定的体系, 随着时间的延长, 乳剂会破裂分层; 乳剂颗粒较大, 分布不均, 易致病灶对乳剂的吸收缓慢[17]. 脂质体是磷脂类等分子的自组装体, 是一个或多个脂质双层中间包覆水相结构的微囊, 作为药物载体已经商业化, 也被应用于抗肿瘤制剂的剂型改造, 并提高了疗效[17-22]. 沈阳药科大学邓英学领导的课题组, 用各种脂质体包裹榄香烯[23], 并进行了深入研究; 本文是普通榄香烯脂质体临床前药效研究的部分结果, 这方面的研究尚无文献报道.

在本研究中, β-榄香烯脂质体显示出良好的抗肿瘤活性. 在体外的药敏实验中, 除了胰腺癌β-榄香烯脂质体的IC50值等于榄香烯乳剂外, 其他癌细胞株的β-榄香烯脂质体IC50值均明显地低于榄香烯乳剂, 约为后者的0.5倍, β-榄香烯脂质体显示出更高的细胞毒性, 但两者对人胚胎肺纤维细胞细胞的IC50值均等于和大于240 mg/L, 说明这些药物对肿瘤细胞有较高的选择性, 对正常细胞的伤害作用较小. 在昆明鼠的体内动物实验中, 3次独立实验证明尾静脉注射榄香烯脂质体给H22荷瘤昆明鼠, 均有明确的抗肿瘤作用, 高、中、低剂量的抑瘤率分别是: 47.4%-50.8%、38.2%-45.0%、23.2%-28.2%, 呈现出剂量相关性; 而且高于乳剂组抑瘤率. 但是, 从平均瘤质量上, 两组未见明显的统计学差异. 实验组与葡萄糖对照组相比, 体质量未见明显减轻. 而且, 特别要强调的是在尾静脉注射过程中, 榄香烯乳剂组动物呈现明显的刺激症状, 如鸣叫、撕咬、活动过于活跃, 尾部末稍在注射3-4 d后即明显地坏死, 未坏死处也明显肿胀. 相比较, β-榄香烯脂质体组上述这些副作用明显减少. 同样, 在生命延长率的2次独立实验中, 证明尾注射β-榄香烯脂质体给H22腹水瘤昆明鼠, 均能明显地延长生存期, 尤以低、中剂量组为明显, 延长了92.3%-104.3%, 统计学处理有显著差异(P<0.01), 这些结果进一步证明了β-榄香烯脂质体疗效和优势, 有可能经过脂质体包封后毒性明显减低, 从而可以给更高的剂量, 取得更为满意的疗效.

榄香烯的作用机制呈现出多样性, 可直接杀伤肿瘤细胞, 可通过抑制c-myc基因和Bcl-2基因的活性、端粒酶活性, 使肿瘤细胞凋亡[24-28]; 可抑制细胞从S期进入G2/M期, 进而抑制细胞分裂[29-30]; 榄香烯单独或联合疫苗, 有增强机体免疫功能, 包括T淋巴细胞和红细胞免疫功能等作用[31]. 榄香烯有逆转肿瘤细胞多药抗药的作用[32-35], 也能抑制肿瘤血管的形成和转移[36]等.

总之, β-榄香烯脂质体无论在体内还是体外, 均增加了药物的作用, 降低了副作用, 是一种良好的剂型, 有望进入临床试验治疗.

评论
背景资料

榄香烯乳注射液主要成分为中药莪术中提取的β-榄香烯, 在临床上应用于各种肿瘤的治疗. 但乳剂对血管的刺激及发热等不良反应影响临床应用. 为增加疗效和减少副作用, 本研究将β-榄香烯用脂质体包裹后研究其疗效和副作用.

同行评议者

万军, 主任医师, 中国人民解放军总医院消化内科

研发前沿

如何从复合方剂中找到和提纯抗肿瘤药物成分, 并采用合适的剂型, 使提纯成分稳定、有效, 且副作用少, 是亟待解决的问题.

创新盘点

本研究将β-榄香烯用脂质体包裹, 提高药物的体外细胞毒性作用, IC50约为乳剂的1/2. 动物实验证明β-榄香烯脂质体抑瘤作用增强, 小鼠生存期明显延长, 对静脉刺激作用也较乳剂明显减轻.

应用要点

本文为β-榄香烯脂质体进入临床试验提供直接的依据, 药效高, 毒、副作用少, 此剂型将会替乳剂, 在抗肿瘤治疗中得到更为广泛的应用.

名词解释

脂质体: 是磷脂类分子的自组装体, 是一个或多个脂质双层中间包覆水相结构的微囊, 作为药物载体也被应用于抗肿瘤制剂的剂型改造, 能显著提高疗效.

同行评价

本文研究方法得当, 有一定的科学性和可读性.

编辑:程剑侠 电编:何基才

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