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世界华人消化杂志. 2008-01-08; 16(1): 94-97
在线出版日期: 2008-01-08. doi: 10.11569/wcjd.v16.i1.94
胃癌及癌前病变中微卫星不稳定性的变化
李异玲, 周立平, 王轶淳, 付宝玉
李异玲, 付宝玉, 中国医科大学附属第一医院消化内科 辽宁省沈阳市 110001
周立平, 中国医科大学附属第一医院检验科 辽宁省沈阳市 110001
王轶淳, 中国医科大学附属第一医院内窥镜中心 辽宁省沈阳市 110001
基金项目: 辽宁省自然科学基金资助项目, No. 2006225007-4.
通讯作者: 李异玲, 110001, 沈阳市和平区南京北街155号, 中国医科大学附属第一医院消化内科. lyl-72@163.com
收稿日期: 2007-08-28
修回日期: 2007-12-17
接受日期: 2007-12-25
在线出版日期: 2008-01-08

目的: 探讨胃癌及癌前病变中微卫星不稳定(MSI)的变化. 

方法: 饱和氯化钠法提取组织DNA, PCR-SSCP变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测MSI, 根据规定标准来判定microsatellite stable(MSS), low frequency MSI(MSI-L)和high-frequency MSI(MSI-H), 计算总MSI率. 

结果: MSI在萎缩性胃炎, 肠上皮化生, 不典型增生, 早期胃癌和进展期胃癌中检出率分别为13.3%、16.7%、23.3%、30%和40%, 三种癌前期病变和早期胃癌之间有显著差异(2值分别为4.364、2.522、3.089, P<0.05), 早期胃癌与进展期胃癌没有显著差异(2值为0.071, P>0.05), 高分化腺癌中MSI的阳性率明显高于低分化腺癌(2值为4.022, P<0.05).

结论: MSI是胃癌发生中的早期分子标志, 其阳性的胃癌恶性程度相对较低.

关键词: 胃癌; 微卫星不稳定; 饱和氯化钠法
引文著录: 李异玲, 周立平, 王轶淳, 付宝玉. 胃癌及癌前病变中微卫星不稳定性的变化. 世界华人消化杂志 2008; 16(1): 94-97
Changes in microsatellite instability in gastric cancer and precancerous lesions
Yi-Ling Li, Li-Ping Zhou, Yi-Chun Wang, Bao-Yu Fu
Yi-Ling Li, Bao-Yu Fu, Department of Gastroenterology, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Li-Ping Zhou, Department of Laboratory, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Yi-Chun Wang, Department of Endoscopy, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of Liaoning, No. 2006225007-4.
Correspondence to: Dr. Yi-Ling Li, Department of Gastroenterology, the First Hospital of China Medical University, 155 Nanjing North Street, Heping District, Shenyang 110001, Liaoning Province, China. lyl-72@163.com
Received: August 28, 2007
Revised: December 17, 2007
Accepted: December 25, 2007
Published online: January 8, 2008

AIM: To investigate the changes in microsatellite instability (MSI) in gastric cancer and pre-cancerous lesions.

METHODS: DNA was extracted by the method of saturated sodium chloride. MSI was detected by PCR-SSCP denaturing PAGE and silver staining, microsatellite stability (MSS), low-frequency MSI (MSI-L) and high-frequency MSI (MSI-H) were evaluated following the international MSI workshop-recommended standard.

RESULTS: According to the international MSI workshop recommended standard, the total positive rate of MSI was 13.3% for atrophic gastritis, 16.7% for intestinal metaplasia, 23.3% for atypical hyperplasia, 30% for early stage gastric cancer, and 40% for advanced stage gastric cancer. There were differences between three kinds of precancerous lesions and gastric cancer (χ2 was 4.364, 2.522 and 3.089, respectively, P < 0.05). There was no difference between early and advanced stage gastric cancer (χ2 was 0.071). The positive rate of MSI in well-differentiated adenocarcinoma was higher than that in poorly differentiated adenocarcinoma (χ2 was 4.022, P < 0.05).

CONCLUSION: MSI is an early molecular marker in the pathogenesis of gastric cancer. The malignant degree of MSI positive gastric cancer may be low.

Key Words: Gastric cancer; Microstaellite instability; Method of staturated sodium chloride
0 引言

胃癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一, 居我国消化道恶性肿瘤之首, 其发病率男性为39.2-62.0/10万, 女性为19.1-24.8/10万, 死亡率为17.3/10万, 因此研究其发病机制, 提供有效的早期诊断和治疗策略具有重大意义. 在胃癌的发生中, 从正常胃黏膜上皮转化成癌是一个多步骤的过程, 他涉及到多种癌基因、抑癌基因、端粒及端粒酶、细胞黏附因子和DNA错配修复基因等的异常和积累, 其中错配修复基因功能的失活会导致微卫星小体(MS)重复序列的不稳定, 即微卫星不稳定(MSI). 本研究旨在探讨胃癌及癌前期病变中微卫星不稳定性的变化.

1 材料和方法
1.1 材料

收集中国医科大学2006-2007年胃镜中心活检标本, 萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生及对应的正常胃黏膜各30例, 年龄范围38-72(平均年龄58)岁, 男女比例2.21∶1(62/28). 收集同期肿瘤外科术后大体标本, 早期胃癌及进展期胃癌各30例, 所有患者术前均未进行化疗或放疗, 年龄范围36-68(平均年龄54)岁, 男女比例2.33∶1(63/27). 上述标本均经OCT包埋固定, 立即置于液氮罐中, 并置于-70℃冰箱中永久保存.

1.2 方法

1.2.1 饱和氯化钠法提取组织DNA: 取标本组织10 g捣碎, 加入100 mL/L的SDS 50 mL, 20 g/L蛋白酶K 5 mL, TE液(pH8.0)定容至500 mL, 37℃水浴过夜后, 加入1/3体积饱和氯化钠, 4℃静置10 min, 10 000 g离心10 min, 抽取上清液, 加入等体积氯仿混匀抽提, 10 000 g离心10 min, 取上清液, 加入100 mL醋酸钠(3 mol, pH5.6), 70 mL异丙醇沉淀, 弃上清, 保留沉淀出的DNA, 用700 mL/L乙醇洗脱两次, 37℃烤箱中干燥10 min根据沉淀的量, 加入TE液100-200 mL溶解, 置于-20℃冰箱中保存备用.

1.2.2 PCR-SSCP方法检测MSI: 我们选择BAT26, D2S123, D5S346, D17S799和D18S34作为微卫星标志点, 上述引物由北京奥科公司合成, 引物序列见表1. 反应体积为20 mL, 含引物2 mmol, 10×buffer 2 mL(含Mg2+ 1.5 mmol/L), dNTP 200 mmol/L, Taq DNA聚合酶2单位, 基因组DNA 100 ng. 反应条件为: 95℃预变性5 min, 94℃ 30 s, 56℃ 40 s, 72℃ 30 s, 进行32个循环, 72℃延伸10 min. PCR产物按1∶5与变性缓冲液混合(950 mL/L甲酰胺、20 mmol/L EDTA, 2.5 g/L溴酚兰), 97℃变性10 min后立即置于冰水中, 160 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳4 h(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺 29∶1, 含7 mol/L尿素), 电泳后的凝胶置于100 mL/L乙醇中内固定10 min以上, 0.018 mmol/L HNO3处理20 min, 水洗3次, 每次1 min, 12 mmol/L AgNO3染色2次, 每次10 min, 水洗2次, 每次1 min, 2.83 mmol/L Na2CO3, 0.06 g/L甲醛显影液显影10 min, 100 mL/L乙酸固定10 min以上, 水洗3次, 每次5 min, 玻璃纸封胶, 固定, 干燥.

表1 微卫星位点及引物序列.
位点位置引物序列
BAT262p16-2p16p1 TGACTACTTTTGACTTCAGCC
p2 AACCATTCAACATTTTTAACCC
D2S1232p21-2p16p1 AAACAGGATGCCTGCCTTTA
p2 GGACTTTCCACCTATGGGAC
D5S3465q21-5q22p1 ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG
p2 CAGATAAGACAGTATTACTAGTT
D17S79917pter-17pterp1 ATTGCCAGCCGTCAGTT
p2 GACCAGCATATCATTATAGACAA
D18S3418q12.2-18q12.3p1 CAGAAAATTCTCTCTGGCTA
p2 CTCATGTTCCTGGCAAGAAT

统计学处理 应用SPSS软件对实验数据进行统计学分析, P<0.05为有显著差异.

2 结果

与正常组织相比, 胃癌及癌前期病变组织有额外的DNA等位片段或出现等位片段泳动, 即可判断为MSI. 其中1个位点发生MSI为MSI-L, 2个或2个以上位点发生MSI为MSI-H, 没有MSI发生为MSS. 胃癌及癌前期病变中MSI的检出结果见表2, 若将5个位点综合分析, 其MSI阳性率见表3.

表2 胃癌及癌前期病变中MSI的检出(n = 30).
病变BAT26D2S123D5S346D17S799D18S34
萎缩性胃炎11012
肠上皮化生20112
不典型增生32121
早期胃癌76687
进展期胃癌68479
表3 胃癌及癌前期病变中MSI的表达(%).
病例nMSSMSI-LMSI-H总MSI率
缩性胃炎302610(3/30)3.3(1/30)13.3
肠上皮化生302513.3(4/30)3.3(1/30)16.7
不典型增生302313.3(4/30)10(3/30)23.3
早期胃癌301910(3/30)26(8/30)30.0
进展期胃癌301810(3/30)30(9/30)40.0
高中分化腺癌321515.6(5/32)37.5(12/32)53.1
低分化腺癌12816.6(2/12)16.6(2/12)33.3
3 讨论

MS是一种散布于人类全基因组中的简单串联的核苷酸重复序列, 多存在于非编码区内, 通常为1-6个碱基对的15-30个重复单位. 微卫星小体有1, 2, 3和4个重复核苷酸序列等多种形式, 常见的有(A)n和(CA)n重复. MS约占真核基因组的5%, 人类基因组大约有50 000-100 000个CA/GT重复序列, 发生突变的频率为10-3-10-5.

MSI是肿瘤常见的遗传改变之一, 在肿瘤的形成中起重要作用, 是肿瘤形成的一个机制. 从基因水平看, MS做为基因变异和重排的来源, 可能在肿瘤-基因调控中起重要作用[1-3]. 目前研究结果表明, MSI与肿瘤的早期诊断、浸润、分期、转移、病理类型和预后等有关. MSI阳性表达见于肺癌, 乳腺癌, 胃癌, 结肠癌, 泌尿系统肿瘤, 白血病, 子宫内膜癌, 卵巢癌和胶质瘤等多种肿瘤中[4-7]. 由于应用PCR-SSCP技术检测MSI的方法简单, 结果可靠, MSI目前已经成为基因领域预测肿瘤发生, 早期诊断, 判定分期及预后的有效手段. 但由于不同研究选择标志物的数量及位点的不同, MSI-H和MSI-L判定标准的不同, 使得研究结果有很大的差异. 目前国际MSI工作站推荐一组检测微卫星标志物至少应为5个, 其中有≥2个标志物发生MSI时为MSI-H, 1个标志物发生MSI时为MSI-L, 没有MSI发生为MSS[8]. 随着对不同肿瘤标志物选择及判定标准的统一, MSI与肿瘤发生的关系也将进一步明确. 目前研究表明, MSI阳性与MSI阴性的肿瘤可能存在不同的机制, 其中胃癌发生MSI变异频率是最高的, 高于其他任何一种散发性癌, 具体原因不清[9]. 关于MSI与胃癌的关系国内外研究的较多, 结果也很不一致. Vauhkonen et al[10]研究认为MSI阳性的胃癌具有低浸润、预后好的特点, 并且在肠型胃癌的阳性率高于弥漫型胃癌. Hasuo et al[11]研究发现早期胃癌行内镜下切除术后, MSI的检测可作为评判肿瘤复发的标志. 关于MSI与癌前病变的关系, 国内外相关研究较少. Hamamoto et al[12]通过9个微卫星位点的研究, 结果表明, 胃癌组织中MSI阳性率为46.7%, 癌旁肠化组织MSI阳性率为26.7%. Roa et al[13]研究表明在慢性胃炎无癌变的肠化组织中MSI的表达率为59%, 我们根据国际MSI工作站的推荐选择5个MSI标志物, 根据上述的标准进行判定, 其结果表明, 萎缩性胃炎MSI总的阳性率为13.3%,其中10%为MSI-L; 肠上皮化生中MSI阳性率为16.7%, 13.3%为MSI-L; 不典型增生组MSI总的检出率为23.3%, 其中13.3%为MSI-L; 在胃癌患者中, MSI总的阳性率为40%, 10%为MSI-L, 30%为MSI-H. 上述研究结果表明: MSI在萎缩性胃炎及肠上皮化生等癌前期病变阶段就开始出现, 并且其在癌前期病变的表达阳性率与胃癌比有显著差异(P<0.05), 说明MSI是胃癌发生的早期事件之一. 关于MSI与胃癌分化的关系, 文献报道不尽一致, Tajima et al[14]研究发现MSI的表达与HGM, MUC6相一致, 在高分化腺癌中的阳性率显著高于低分化腺癌. Mizoshita et al[15]发现低分化腺癌MSI发生率高于高分化腺癌, MSI与胃癌的浸润转移关系密切. 本研究结果表明, 高分化腺癌中MSI的阳性率明显高于低分化腺癌(P<0.05), 提示MSI阳性胃癌恶性程度可能相对较低.

本研究结果提示MSI是胃癌发生过程中常见的改变, 因此检测MSI有可能成为胃癌早期诊断以及判断预后的有效手段.

评论
背景资料

MSI是肿瘤常见的遗传学改变之一, 在肿瘤的形成中起重要作用, 目前研究表明, MSI与肿瘤的早期诊断, 浸润, 分期, 转移, 病理类型和预后等有关.

创新盘点

本文应用PCR-SSCP方法, 选用同样的微卫星标志物, 同样的判定标准, 探讨胃黏膜癌变过程中MSI的动态变化, 结果表明MSI是胃癌发生中的早期分子标志, 其阳性的胃癌恶性程度相对较低.

应用要点

通过检测MSI, 可以早期诊断胃癌, 判断预后.

同行评价

本文应用方法先进, 科学性强, 结论明确, 对临床工作具有一定参考价值.

编辑:李军亮 电编:何基才

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