基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2007-03-28; 15(9): 953-959
在线出版日期: 2007-03-28. doi: 10.11569/wcjd.v15.i9.953
大肠癌细胞系Lovo中亚群(SP)细胞的分离培养和鉴定
王锡山, 刘彦龙, 杨艳梅
王锡山, 刘彦龙, 哈尔滨医科大学附属肿瘤医院腹外科 黑龙江省哈尔滨市 150040
杨艳梅, 黑龙江省肿瘤研究所 黑龙江省哈尔滨市 150040
王锡山, 教授, 博士生导师, 主要从事腹部肿瘤的基础研究和外科治疗.
通讯作者: 王锡山, 150040, 哈尔滨市南岗区哈平路150号, 哈尔滨医科大学附属肿瘤医院腹外科. wxshan1208@yahoo.com.cn
电话: 0451-86298898
收稿日期: 2007-01-23
修回日期: 2007-01-04
接受日期: 2007-01-31
在线出版日期: 2007-03-28

目的: 应用无血清培养液(SFM)培养Lovo细胞系, 克隆分离具有干细胞样特性SP细胞.

方法: 应用SFM培养Lovo细胞, 分离成球样生长的细胞群作为SP细胞, 并通过有限稀释, 分化, 自我更新, 含血清培养基(SSM)和SFM交替培养及Musashi-1化学染色方法来鉴定SP细胞.

结果: Lovo细胞中约含有0.54%-0.62%的SP能够在无血清培养基中能够存活、增殖, 形成悬浮的肿瘤细胞球; 在SFM中加入血清可促使SP细胞分化; SP细胞可以连续传代, 并可交替培养于SSM和SFM中, 细胞形态无明显变化; SP细胞Musashi-1染色阳性.

结论: 应用SFM可从Lovo细胞中分离出极少量的具有干细胞特性的SP细胞.

关键词: Lovo大肠癌细胞系; 细胞亚群; 肿瘤干细胞; 悬浮培养; 无血清培养基
引文著录: 王锡山, 刘彦龙, 杨艳梅. 大肠癌细胞系Lovo中亚群(SP)细胞的分离培养和鉴定. 世界华人消化杂志 2007; 15(9): 953-959
Isolation and identification of side population in Lovo colon cancer cell line
Xi-Shan Wang, Yan-Long Liu, Yan-Mei Yang
Xi-Shan Wang, Yan-Long Liu, Department of Abdominal Surgery, the Affliliated Tumor Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150040, Heilongjiang Province, China
Yan-Mei Yang, Institute of Tumor research, Harbin 150040, Heilongjiang Province, China
Correspondence to: Xi-Shan Wang, Department of Abdominal Surgery, the Affiliated Tumor Hospital of Harbin Medical University, 150 Haping Road, Nangang District, Harbin 150040, Heilongjiang Province, China. wxshan1208@yahoo.com.cn
Received: January 23, 2007
Revised: January 4, 2007
Accepted: January 31, 2007
Published online: March 28, 2007

AIM: To investigate whether colon cancer cell line Lovo contains side population (SP) with cancer stem cell-like properties.

METHODS: Lovo cell line was cultivated in serum-free medium and SP cells reforming into floating spheres were isolated. The isolated SP cells were identified by limiting-dilution assay, differentiation assay, self-renewal assay, alternative cultivation assay and immunocytochemical staining with anti-Mus-1 assay.

RESULTS: In the absence of serum, a minority (0.54%-0.62%) of SP cells in Lovo cells survived, proliferated and assembled into the suspended tumor cell spheres. Lovo SP cells possessed proliferative, self-renewal and differentiation potential, which were responsible for the floating tumor clone. Serum addition into SFM resulted in the proliferation of SP cells; after several generations and alternated cultivation in SSM and SFM, SP cells maintained their characters. The stem cell surface marker Mus-1 was observed in Lovo SP cells after Musashi-1 staining.

CONCLUSION: Lovo cell line contains a tiny minority of SP cells with stem cell properties that can be maintained in SFM using a floating-culture method for a long time.

Key Words: Lovo colon cancer cell line; Side population; Tumor stem cells; Serum-free culture medium; Floating-culture system
0 引言

癌症细胞和干细胞一样具有无限增殖的能力. 近年来, 在白血病[1-2]和一些实体肿瘤中, 包括乳腺癌[3]、胰腺癌[4]、头颈鳞状细胞癌[5]、肝癌[6]和脑肿瘤[7-10]中已发现了具有干细胞特征的细胞, 我们称之为癌症干细胞(CSCs). 虽然这种细胞的数量极少, 但能够瘤性克隆生长, 从而产生不同表型的癌细胞亚群[11-12]. 当前认为在经过放化疗后, CSCs是导致肿瘤复发的原因[1,3]. 因此, 研究CSCs有利于更好的理解肿瘤复发、转移和耐药性产生的机制, 从而制定更为合理的治疗方案. 大肠癌是一种常见肿瘤, 其生物学行为较其他消化道肿瘤的恶性度低, 术后5年生存率较高, 但是仍有40%-50%的患者因为复发而需放化疗. 研究CSCs可以提高治疗的针对性和有效性, 具有更为实际的意义. 我们通过无血清培养基培养Lovo细胞系, 克隆分离癌细胞亚群(side-population, SP), 并从形态学、分化、自我更新、交替培养以及细胞化学免疫等方面进行鉴定.

1 材料和方法
1.1 材料

细胞株为大肠癌细胞系Lovo(黑龙江省肿瘤研究所提供). 传统含血清培养基(serum-supplemented medium, SSM)为含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12(1:1, invitrogen-gibco)培养基, 并添加L-谷氨酰胺(Sigma) 2 mL/L, 胰岛素(Sigma) 4 U/L, 青霉素G 105 U/L和链霉素100 mg/L. 无血清培养基(serum-free medium, SFM)为不含牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基, 并添加重组表皮生长因子EGF(20 μg/L, PeproTech)、碱性成纤维生长因子bFGF(20 μg/L, PeproTech)和白血病抑制因子LIF(20 μg/L, PeproTech), 以及1 mg/L胰岛素, 1×10-7 mol/L地塞米松(Sigma), 10 mmol/L尼克酰胺(Sigma), 2 mmol/L L-谷氨酰胺(Sigma), 50 μmol/L 2-巯基乙醇(Sigma), 5 mmol/L HEPES, 105 U/L青霉素G和100 mg/L链霉素.

1.2 方法

1.2.1 SP的培养分离和传代: 先将Lovo细胞系接种于传统SSM中, 在培养瓶中传代. 选择对数生长期的细胞, 用D-Hanks液清洗, 胰酶(2.5 g/L)消化, 重悬于SFM, 台盼兰染色并计数, 以1×105/孔接种于6孔板中, 继续在37 ℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养. 待增殖形成细胞球3-4 d后, 将其收集并机械吹打成单细胞悬液, 重悬于SFM, 按1:4的比例传代于6孔中.

1.2.2 有限稀释法: 有限稀释采用Bellows et al[13], Tropepe et al[14]的方法, 将贴壁生长于SSM中的细胞经胰酶消化, 吹打成单细胞悬液, 计数后重悬于SFM, 按每孔200 μL分别接种320, 160, 80, 40, 20, 10和5个细胞稀释, 接种于96孔板. 以每个浓度未形成肿瘤球的孔的百分比为应变量, 以每孔中接种的细胞数为自变量, 作直线回归分析并用方差分析作拟和优度检测. 回归方程中与以应变量37%相对应的自变量值就是要形成一个肿瘤球所需的接种细胞量, 因为每个肿瘤细胞球均有一个肿瘤干细胞形成, 所以根据这一细胞量求出肿瘤干细胞在细胞系中的比例. 此试验重复5次.

1.2.3 SP细胞的自我更新与诱导分化: 在Lovo细胞培养于SFM的第7天, 分别分离细胞球和单细胞, 并将细胞球机械吹打成单细胞悬液, 分别重悬于SFM液中, 培养于37 ℃, 50 mL/L CO2培养箱中. 在原发肿瘤干细胞球形成的第2天, 吸出肿瘤球, 分别平铺于放有涂有多聚赖氨酸的盖玻片24孔板中, 换成添加100 mL/L FBS的SFM培养液, 7 d后进行免疫荧光化学染色.

1.2.4 SP交替在SSM和SFM培养基中培养: 按照1.2.1的方法, 待Lovo细胞系在SFM中细胞球2 d后, 收集并重悬于SSM液中, 待其呈单层细胞生长后, 再收集并重悬于SFM液中, 呈细胞球样悬浮生长, 如此反复3次.

1.2.5 Musashi-1细胞化学染色: 把SP形成的的肿瘤球吸出, 平铺于放有涂有多聚赖氨酸的24孔板中, 培养于添加100 mL/L FBS的SFM中4 h, 在室温下用40 g/L多聚甲醛-PBS固定20 min. 用冷2 g/L TritonX-100/PBS在4 ℃下透膜10 min, 然后在4 ℃下与Musashi-1 mAb过夜(1:200; Chemicon). 用冷2 g/L TritonX-100/PBS 4 ℃下冲洗5 min, 冲洗3次, 再用含有30 g/L牛血清白蛋白的冷2 g/L TritonX-100/PBS 4 ℃下冲洗5 min. 用FITC抗兔IgG1检测一抗. 然后用含有PI的封固剂复染鉴定细胞核, 在荧光倒置显微镜(Nikon)下观察. 同理在分化的第7天和贴壁培养的第2天进行免疫化学染色.

2 结果
2.1 肿瘤细胞球的形成

Lovo在SFM中培养24-48 h后可产生少量体积较小的悬浮肿瘤球(图1A), 72 h后肿瘤球体积增大, 随着时间的延长, 在1 wk左右所形成的肿瘤球一部分肿瘤球较松散, 此为黏附细胞团, 一部分肿瘤球形态较一致且比较致密(图1B), 3 wk左右均形成致密的形态一致的肿瘤球(图1C), 而且经过传代后肿瘤球的总数量大量扩增. 这部分肿瘤球细胞我们称之为SP细胞. 剩余的大多数肿瘤细胞即N-SP(non-side population)呈现黏附, 不具有增殖和分化的能力. 而用SSM培养的Lovo时, 接种后数小时内开始贴壁, 48 h后形成单层贴壁细胞层, 没有悬浮细胞团产生(图1D).

图1
图1 Lovo中肿瘤细胞球的形成过程. A: 在SFM中培养24-48 h(×100); B: 在SFM中培养1 wk左右(×100); C: 在SFM中培养3 wk左右(×400); D: 在SSM中培养48 h(×100).
2.2 Lovo细胞中含有0.54%-0.62%的具有形成肿瘤球能力的SP细胞

采用Bellows et al[13], Tropepe et al[14]的方法, 经有限稀释、单克隆形成试验和直线回归分析, 在用SFM培养Lovo时, 要形成一个肿瘤细胞球所需的细胞数为173.68±11.02(SD), 这证明了Lovo中有0.58%±0.04%(SD)的能够形成肿瘤细胞球的SP细胞, 而其他大多数细胞不具备这种能力(图2, 表1).

表1 Lovo细胞系中肿瘤球的比例.
试验次数R2形成一个肿瘤球时每孔所需的细胞数肿瘤球的比例(%)
实验10.926175.700.57
实验20.860157.730.63
实验30.897168.730.59
实验40.944179.630.56
实验50.971186.610.54
mean±SD173.68±11.020.58±0.04
每次试验的回归直线见图2, R2为直线回归的决定系数, 接近于1. 每次试验均用方差分析作拟和优度检验(P<0.05).
图2
图2 有限稀释试验单克隆试验的直线回归分析. 以每孔中接种的细胞数为自变量, 以每个浓度未形成肿瘤球的孔的百分比为应变量, 作回归直线, 以应变量37%相对应的自变量的值就是要形成一个肿瘤球所需的细胞数.
2.3 SP细胞的自我更新

我们观察到Lovo细胞在SFM培养形成肿瘤球后, 经机械吹打后培养于SFM中, 1-2 wk后仍可形成肿瘤细胞球和一些单细胞, 其形态与原代相同(图3A), 而单细胞则不具有这种功能, 只能形成单细胞(图3B).

图3
图3 Lovo中SP细胞的自我更新(×100). A: SP; B: 单细胞.
2.4 血清促使SP细胞分化

当SP细胞形成肿瘤球后, 在SFM中滴加FBS, 并隔日补充, 24-48 h内肿瘤球无明显变化, 单细胞黏附生长明显(图4A), 72 h肿瘤球开始变小, 单细胞增多, 第5天时肿瘤球开始裂解成多个小细胞团(图4B), 7 d左右时肿瘤球消失, 均为单细胞, 且多为黏附生长(图4C).

图4
图4 Lovo中SP细胞在加有血清的SFM中的分化过程(×100). A: 24-48 h内; B: 5 d; C: 7 d左右.
2.5 Lovo在SSM和SFM两种培养基中交替转化

将上述方法获得的肿瘤球重铺于SSM中, 12 h内细胞贴壁, 细胞平贴培养板底(图5A), 24 h左右细胞数量增多并形成小片状细胞岛(图5B), 48 h后细胞岛扩大, 并开始与邻近的细胞岛融合, 并逐渐形成单层的Lovo细胞层, 显微镜下与传统培养形成的单细胞层无明显差异(图5C). 消化单层Lovo细胞, 重新培养于SFM中, 仍可形成肿瘤细胞球, 其形态与原代相同(图5D).

图5
图5 Lovo在SSM和SFM两种培养基中交替转化. A: 将肿瘤球重铺于SSM中, 12 h内(×200); B: 24 h左右(×200); C: 48 h后(×200); D: 消化单层Lovo细胞, 重新培养于SFM中, 仍可形成肿瘤细胞球(×100).
2.6 SP细胞Musashi-1染色

我们首先对SSM培养下的Lovo细胞进行染色, 我们发现在Lovo中只有极少量的细胞表达Musashi-1, 细胞核较圆, 并且比较小(图6A), 而Musashi-1阴性的肿瘤细胞核呈长椭圆形, 核较大(图6B). SP细胞形成的肿瘤细胞球表达Musashi-1(图6C), 而SP细胞经分化7 d后则不表达(图6D).

图6
图6 SP细胞Musashi-1染色结果(×400). A: Lovo细胞在SSM中培养24 h后, 只有极少量的细胞表达Musashi-1, 细胞核较圆, 并且比较小; B:Lovo细胞在SSM中培养24 h后, Musashi-1阴性的肿瘤细胞核呈长椭圆形, 核较大; C: Lovo中SP细胞在SFM中培养形成的肿瘤球表达Musashi-1; D: SP细胞分化培养7 d后, Musashi-1呈阴性表达.
3 讨论

SP细胞的分离最初主要应用于鉴定造血干细胞, 并且通常认为在不同的组织和器官中均富含有干细胞[15-16]. 目前认为在癌细胞中也存在着干细胞样肿瘤细胞, 富含于SP细胞中[17-18]. Haraguchi et al[19]指出, 在不同的胃肠道癌症细胞系中鉴定出含有0.3%-2.2%的SP细胞, 在干细胞培养基中一般呈悬浮的肿瘤球样生长. 在国内, 我们首次把Lovo细胞系培养于干细胞培养基中, 分离呈悬浮肿瘤球生长的SP细胞, 利用有限稀释试验计算出SP细胞大约占0.54%-0.62%, 并进一步通过自我更新、分化能力、交替生长和Musashi-1免疫化学染色试验来鉴定其是否具有干细胞特性.

为了有效的分离SP细胞, 我们首先优化配制肿瘤干细胞培养基. 无血清培养基能够使胚胎干细胞处于未分化状态, 有助于培养人类胚胎干细胞[20]. 在SFM中额外加入bFGF和EGF能够诱导神经干细胞的多能增殖、自我更新和扩张[21-22]. Kondo et al[7]指出了胶质瘤C6 SP细胞生长在加有bFGF和PDGF的无血清培养液中, 10 d以后呈现悬浮和神经样细胞集落生长现象; 并进一步说明了bFGF能够维持C6 SP细胞的生长和扩增, 但是PDGF刺激这些细胞进行增殖. Haraguchi et al[19]指出在加有bFGF和EGF的无血清培养基中额外加入LIF能够有效的扩增HuH7 SP细胞. 通过论证, 我们在无血清培养基中加入EGF, bFGF和LIF, 可以有效的从Lovo中培养分离呈悬浮细胞球样生长的SP细胞.

Singh et al[23]通过原代培养分离出的SP细胞具有快速增殖和自我更新的能力, 并论证了SP细胞在无血清培养基中呈悬浮球样生长, 并且随着时间的延长, SP所占的比例增加. 本实验Lovo中的SP细胞具有以下特征: 在SFM中呈悬浮样生长, 并能形成克隆性的细胞球-肿瘤干细胞球, 并能连续传代; 随着时间的延长, 其肿瘤细胞球的数量增加, 体积增大, 体现出SP细胞的快速增殖性; SP形成的肿瘤细胞球制备成单细胞后仍可以形成肿瘤细胞球, 但是N-SP不具有这样的能力. Lovo细胞能够在传统的含血清培养基中长期培养, 也能在无血清培养基中长期增殖、传代, 使细胞系得以长期维持; 并且观察到随着培养基和培养方式的更换, 能在悬浮的肿瘤细胞球和贴壁的单细胞层之间转换. 这样, 我们可以根据需要进行培养.

Musashi-1是种RNA连接蛋白, 可以标记增殖神经祖细胞包括中枢神经系统的干细胞[24]. Musashi-1通过抑制特异的mRNAs转录来维持干细胞状态、分化和肿瘤发生, 在哺乳动物中, Musashi-1则主要是通过抑制m-Numb激活Notch信号[25]. 目前, 越来越多的证据显示Musashi-1可以作为肠道干细胞的标记[26-29]. 朱永良et al[30]从人胚肠中分离正常大肠干细胞, 用RT-PCR检测示该细胞株表达Musashi-1 mRNA, 存在非对称性有丝分裂. 在本实验里, 我们发现, 在SFM培养的细胞中, 并非所有的细胞球均染色阳性, 这种细胞球可能为细胞黏附团, 也可能是肿瘤细胞球并非均含有肿瘤干细胞; 部分悬浮的单个细胞染色也可阳性, 这可能是因为肿瘤干细胞正处于不同的生长周期, 也可能说明了SP细胞中富含有干细胞, 但并不是唯一所在[31]. 但是, 在SFM中额外加入FBS后, 可以促使单细胞黏附, 肿瘤细胞球逐渐分裂、变小, 直至最后变为没有增殖、分化以及自我更新能力的N-SP细胞, 其Musashi-1染色阴性. 这与Tomita et al[32]观察结果相似.

总之, 我们通过形态、分化、自我更新、交替培养和细胞化学染色试验说明了Lovo细胞系中含有少量的能够在无血清培养基中存活、增殖, 自我更新并呈悬浮肿瘤细胞球生长以及Musashi-1阳性的SP细胞. 我们应该进一步纯化SP细胞, 以便更好的研究癌症干细胞的特性.

评论
背景资料

肿瘤细胞与干细胞具有许多相似的特殊特性. 他们均为不死细胞, 并具有良好的分化能力. 而且, 器官形成和癌发生具有相似的过程. 最近, 越来越多的证据显示肿瘤是一种干细胞疾病, 是由具有成瘤能力的肿瘤细胞增殖发育而成的异常组织. 目前在白血病、乳腺瘤、脑肿瘤和胰腺癌中已经论证了肿瘤干细胞的存在.

研发前沿

目前尚不能从形态学来鉴定肿瘤干细胞, 而是用功能学方法, 即对其自我更新能力和分化潜力两个主要特征进行评价. 当今研究主要集中在耐药性、基因表达差异以及表型鉴定等方面.

创新盘点

本文优化配制了胃肠道肿瘤干细胞培养基, 成功分离培养出悬浮样生长的肿瘤干细胞球, 并首次鉴定出这种细胞球表达Musashi-1, 这被认为是胃肠道肿瘤干细胞的标记物.

应用要点

本试验优化配置了干细胞培养基, 并鉴定出肿瘤干细胞球表达Musashi-1, 为胃肠道肿瘤中是否存在干细胞提供了证据, 可以为癌症的诊断和治疗提供更为有效的方法.

名词解释

肿瘤干细胞: 肿瘤细胞中仅有极少数的细胞具有成瘤潜能, 他们数量虽少, 但具有干细胞特征, 可无限增殖, 并可以不对称分裂. 他们在肿瘤的形成和生长过程中起到了决定性作用.

同行评价

本文进行了大肠癌细胞系Lovo中亚群(SP)细胞的分离培养和鉴定, 内容新颖, 结果可信, 有较高的科学价值.

编辑:王晓瑜 电编:张敏

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