修回日期: 2007-01-13
接受日期: 2007-01-20
在线出版日期: 2007-03-18
目的: 探讨20岁以下慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者血清中HBV DNA、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)定量之间关系.
方法: 用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及时间分辩荧光免疫分析(TRFIA)技术检测339例(1-20岁)慢性HBV感染者血清中HBV DNA、HBeAg含量, 用速率法检测ALT水平.
结果: HBeAg定量>0.3 NCU/mL、HBV DNA定量>105 copies/mL、而ALT水平正常者占总检测病例的92.3%; HBV DNA定量(对数值)与HBeAg定量之间存在正相关关系(r = 0.769, P <0.001)和线性回归关系(b = 0.32, R2 = 0.59, P <0.001).
结论: 20岁以下慢性HBV感染者血清中HBV DNA水平与HBeAg水平存在同时消长的关系, 但是有极少患者例外. HBV DNA定量与HBeAg定量两种检测方法相结合应能够更客观地反映患者HBV感染状况, 二者具有互补性.
引文著录: 吴殿磊, 徐光华, 冯继红, 樊霞, 苗乃周, 刘晓斌, 陈天艳, 张树林. 二十岁以下慢性HBV感染者HBV DNA与HBeAg的定量关系. 世界华人消化杂志 2007; 15(8): 909-912
Revised: January 13, 2007
Accepted: January 20, 2007
Published online: March 18, 2007
AIM: To investigate the relationshipt between hepatitis B virus (HBV) DNA contents and HBeAg quantity in HBV-infected patients under 20 years old.
METHODS: The serum HBV DNA contents and HBeAg quantity in 339 patients (age 1-20) with chronic HBV infection were examined by real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) and time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) respectively, and the level of anine aminotransferase (ALT) was detected by rate method.
RESULTS: The patients with HBV DNA contents more than 105 copies/mL, HBeAg quantity more than 0.3 NCU/mL, and normal ALT level accounted for 92.3% of the total cases. Positive correlation (r = 0.769, P < 0.001) and linear regression (b = 0.32, R2 = 0.59, P < 0.001) existed between HBV DNA contents (on a log scale) and HBeAg quantity in the patients under 20 years old.
CONCLUSION: Serum HBV DNA contents and HBeAg quantity are changed simultaneously in HBV-infected patients under 20 years old, except in quite a few cases, so combined examination of HBV DNA and HBeAg may help to evaluate the state of chronic HBV infection more exactly.
- Citation: Wu DL, Xu GH, Feng JH, Fan X, Miao NZ, Liu XB, Chen TY, Zhang SL. Correlation between hepatitis B virus DNA levels and HBeAg quantity in patients under 20 years old with chronic hepatitis B virus infection. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 15(8): 909-912
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v15/i8/909.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v15.i8.909
乙型肝炎是全球性公共卫生问题, 我国是乙型肝炎高流行区. 随着分子生物学技术, 荧光免疫技术的发展, 乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)及乙肝血清标志物检测已由过去的定性发展到定量. 特别是近年来发展起来的HBV DNA的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及乙肝血清标志物时间分辩荧光免疫分析技术(TRFIA), 以其高度的灵敏性、特异性、精确性以及操作简单, 时间短, 不易污染, 自动化程度高等优点逐步广泛应用于临床. 我们应用FQ-PCR、TRFIA技术, 平行检测339例(1-20岁)慢性HBV感染者血清中的HBV DNA含量, 乙肝血清标志物定量; 并对照患者的肝功能, 以探讨20岁以下慢性HBV感染者血清HBV DNA含量与乙肝血清标志物中HBeAg定量的关系.
本院2005-06/2006-09门诊慢性HBV感染者共339例, 男206例, 女133例, 年龄1-20(平均10.2±6.13)岁. 所有患者无使用抗病毒药物病史, 无合并其他肝炎病毒感染. 诊断符合2005-12北京公布的《乙型肝炎防治指南》中的诊断标准. 美国PE公司Gene AmP5700定量基因检测系统和1235 Auto DELFIA全自动时间分辩荧光免疫分析系统; 日立7600全自动生化分析仪. 乙型肝炎病毒核酸荧光检测试剂盒, 由中山大学达安基因诊断中心提供; 时间分辩荧光免疫分析乙肝血清标志物定量检测试剂盒, 由苏州新波生物技术有限公司提供; ALT相关试剂, 由北京九强生物技术有限公司提供.
339例慢性HBV感染者中, HBV DNA定量(取对数值下同)>5 copies/mL(6.83±0.68 copies/mL), 同时HBeAg定量>0.3 NCU/mL(1.37±0.33 NCU/mL), 而ALT水平于正常范围的病例为313例, 占总病例数的92.3%; 12例ALT值>80 U/L(142.9±46.4 U/L); 3例患者: ALT水平正常, HBV DNA检测是阴性, 而HBeAg定量>0.5 NCU/mL(1.03±0.105 NCU/mL); 2例ALT水平正常, HBeAg定量在正常范围, 而HBV DNA检测值>5 copies/mL(6.05±0.113 copies/mL); HBV DNA定量<3 copies/mL, 同时HBeAg, 定量<0.03 NCU/mL, 且ALT水平于正常范围的有9例(表2).
n | HBV DNA(copies/mL) | HBeAg(NCU/mL) | ALT(U/L) | % |
313 | >5 | >0.3 | <80 | 92.3 |
3 | <3 | >0.5 | <80 | 0.88 |
2 | >5 | <0.03 | <80 | 0.59 |
12 | >5 | >0.3 | >80 | 3.53 |
9 | <3 | <0.03 | <80 | 2.65 |
患者血清HBV DNA含量与HBeAg定量, 二者存在正相关关系(r = 0.769 P<0.001)和线性回归关系(b =0.32, R2 = 0.59 P<0.001)(图1).
FQ-PCR是一种新的基因检测技术, 本技术是在定性PCR基础上增加了一条荧光探针, 标记有荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q), 当荧光探针保持完整时, R的荧光信号被Q所淬灭, 在PCR反应中, Taq酶将探针切断时, R释放出荧光信号, 每切断一条探针, 相应就有一条核酸链复制, 同时释放出一个单位的荧光集团, 通过计算机采用光电技术将荧光信号强弱量化, 从而反映分析物HBV DNA的含量[1]. FQ-PCR的整个操作过程仅需开盖一次, 克服了定性PCR易污染, 假阳性率高等不足. 检测的灵敏性、特异性、精确性高, 可以客观准确的反映机体HBV的感染及复制状况[2]. 目前已广泛应用于临床实践, 并成为病毒学、细菌学、病因病理学等基础研究的重要工具.
TRFIA是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物, 如铕(Eu3+)、铽(Te3+)、及钐(Sm3+)、镝(De3+)等代替传统的荧光物质, 放射性同位素, 酶和化学发光物质, 来标记抗体、抗原、多肽、激素、核酸探针及生物素. 待反应体系发生后, 用时间分辩荧光仪测定最后产物中的荧光强度, 根据荧光强度和相对荧光强度比值, 判断反应体系中分析物的浓度, 达到定量分析的目的[3]. 稀土离子螯合物具有荧光衰变时间长; 激发光与发射光的Stokes位移(激发光与发射光波相差)大及被激发的荧光光谱极窄; 荧光激发波长范围宽; 为原子标记, 体积很小等特点. 使TRFIA集酶标记, 同位素标记技术的优点于一身, 具有灵敏度高[4], 特异性强, 稳定性好, 标记制备简便, 储存时间长, 无放射性污染, 检测重复性好, 操作流程短, 标准曲线范围宽和应用范围广泛等优点[5-6], 其灵敏度大大的超过了放射免疫分析技术, 是目前配基结合分析中最有发展前途的一项超微量检测手段. 已逐步在临床实践中推广.
HBV DNA是乙型肝炎病毒的分子生物学标记, HBV DNA的存在是HBV复制和传染性的直接标志[2,7-8]. HBeAg同样被视为HBV复制与传染的标志而且是重要的免疫耐受因子[7-8], 大部分情况下血清中HBeAg中、高浓度存在表示患者处于高感染低应答期. HBeAg消失而抗HBe产生称为血清转换. 转换过程通常意味着机体由免疫耐受转为免疫激活. HBeAg致机体的免疫耐受作用是HBV适应、生存及繁衍的一种重要保护手段. 我们的研究表明: 青少年和小儿慢性HBV感染者血清中HBV DNA含量与HBeAg定量之间存在正相关关系和线性回归关系. 本研究结果与Hussain et al[9]研究报导基本一致. 不同的是以往研究未将研究对象按年龄区分[10]; HBeAg研究方法多是定性而非定量; 未用线性回归关系分析进一步阐明二者间量的关系. 我们发现, HBV DNA定量对数值每升高1 copy/mL, HBeAg定量随之平均升高0.32 NCU/mL.
研究发现, 339例总样本中, HBV病毒复制活跃, (HBV DNA定量升高, HBeAg定量升高), 而ALT水平正常的病例为313例占总病例数的92.3%. Lok et al[11]认为, 慢性乙肝自然史分为4个不同时期: 免疫耐受期、免疫清除期、非活动期、复发期. 免疫耐受期的特点是: HBV DNA滴度较高, HBeAg(+), 而ALT水平正常, 组织学无明显异常. 我们的研究发现与上述观点是一致的. 青少年和小儿免疫系统发育尚未完善, 加上HBeAg免疫耐受因子的作用, HBV感染时机体处于免疫耐受状态, 而乙肝的发生与免疫清除损害明显相关(Ishikawa et al[12]、Chisari et al[13]研究认为, 乙型肝炎的发生与患者自身的免疫清除损害明显相关, 与HBV的直接作用无明显相关性. 如: 致敏T细胞清除机体HBV的同时也损伤了肝细胞[14]). 此时肝脏无损害或损害轻微尚达不到肝炎水平, 称为HBV携带状态, 通常具有较强的感染性. 这一时期, 目前尚缺乏有效的治疗药物与治疗方法, 需动态监测, 在ALT升高>正常值上限两倍时(排除 劳累、熬夜、饮酒, 损害肝脏药物及其他因素或疾病所至ALT升高, 也应排除因应用降酶药物后ALT暂时性正常)、即视为其免疫清除发动(激活)的开始. ALT持续或间断升高, 超过6 mo, 在其自身不能自发进行HBeAg到抗HBe的血清转换过程的情况下, 尤其ALT升高至正常值的5-10倍时, 对其(此类患者)进行外源性药物干预或增强其免疫力[15-16], 对其预后是有益的.
本次研究中发现有9例患者(HBV DNA定量 <5 copies/mL, 同时HBeAg, 定量<0.03 NCU/mL, 且ALT水平于正常范围)已3/4过HBeAg血清转换处于非活动期. 有极少数病例HBeAg定量阳性、而HBV DNA阴性或HBV DNA定量阳性、而HBeAg定量阴性. 这可能是病情复发、引物及探针对应的HBV DNA序列变异所致或与HBV前C区基因变异相关[17-19]. 因此, HBV DNA定量与乙肝血清标志物定量检测需互补[20-22], 且结合肝功能生化指标[23], 肝脏影像学, 甚至组织学或原位PCR应该能够更客观综合评价乙型肝炎患者HBV感染状况.
关于HBVDNA与HBeAg关系研究的学术文章非常多, 得到的结论基本上都是: 慢性乙肝病毒感染者血清中HBVDNA与HBeAg之间存在良好的相关性, 随着对慢性乙肝病毒感染自然史的不断深入了解及对HBeAg阴性慢性乙肝病毒感染研究的深入, HBeAg研究方法已由定性发展到定量, 对于上述结论有必要重新探讨认识.
本文在慢性乙肝病毒感染自然史的背景下, 分不同年龄段采用定量分析技术, 分别阐明不同年龄阶段检测结果特点的分布构成状况, 并对不同年龄段HBVDNA定量与HBeAg定量进行直线相关分析.
研究发现, 20岁以下慢性HBV感染者血清中HBVDNA与HBeAg定量之间存在正相关关系, 而20岁以上慢性乙型肝炎患者血清中HBVDNA与HBeAg定量之间不一定存在明显正相关关系. 本文发现20岁以上小三阳的慢性乙型肝炎患者中HBVDNA定量明显升高者超过30%, 必将为以后的研究提供新的思路和方法.
本文进行了不同年龄阶段慢性乙肝病毒感染者血清中HBVDNA与HBeAg相关关系的量化研究, 立题合理, 检测方法先进, 具有一定科学性.
编辑:张焕兰 电编:李琪
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