中药提取物人衔草对乙型肝炎病毒的抑制作用

摘要

目的: 观察复方制剂祛毒增宁胶囊(ZL-1)药物有效组分人衔草(JH)与HBsAg蛋白的结合情况, 及其体内外抗乙型肝炎病毒的作用.

方法: HepG2.2.15与不同浓度JH共培养, 采用ELISA法HBsAg和HBeAg的分泌情况. 建立鸭乙型肝炎病毒感染模型, 以不同剂量JH进行治疗, 观察鸭血清乙型肝炎病毒DNA (DHBV-DNA)的变化.

结果: JH作用于HepG2.2.15细胞8 d后, 对细胞的半数毒性浓度(TC₅₀)为1126.01 mg/L, 对HBsAg和HBeAg分泌量的的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为17.52 mg/L和754.26 mg/L, 对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TC₅₀/IC₅₀)分别为64.27和1.49. JH 0.8 g/kg能降低感染鸭血清DHBV-DNA水平, 给药后5、10 d和停药后3 d DHBV-DNA吸光度(A)值分别为0.660±0.07, 0.632±0.03, 0.663±0.05, 与盐水组0.872±0.08比较, 有显著性差异(P<0.05).

结论: JH有抑制乙肝病毒的作用.

关键词: 乙型肝炎病毒; HepG2.2.15细胞; 人衔草; 拉米夫定

Effect of Chinese medicine extract Ren Xian Cao on the replication of hepatitis B virus

Yan-Ling Ouyang, Ze-Lin Li, Yi Zeng

Yan-Ling Ouyang, Ze-Lin Li, Yi Zeng, Laboratory of Viral Pharmacology, College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100022, China

Received: November 24, 2006
Revised: December 1, 2006
Accepted: December 8, 2006
Published online: February 8, 2007

Abstract

AIM: To study the anti-viral effect of Ren Xian Cao (RXC), extracted from compound agent Qiedu Zengning capsule ZL-1, on the replication of hepatitis B virus (HBV).

METHODS: HepG2.2.15 cells were co-cultured with different concentrations of RXC, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to examine the secretion of HBsAg and HBsAg. Duck models of HBV infection was established by intravenous injection of duck HBV, and then treated with different doses of RXC. The changes of duck HBV DNA were observed.

RESULTS: After RXC addition for 8 days, the half toxic concentration (TC₅₀) of RXC was 1126.01 mg/L, and the half inhibitory concentration (IC₅₀) on the secretion of HBsAg and HBeAg was 17.52 and 754.26 mg/L, respectively. The value of therapeutic index (TC₅₀/IC₅₀) for HBsAg and HBeAg was 64.27 and 1.49, respectively. RXC at a dose of 0.8 g/kg significantly lowered the level of serum duck HBV DNA at the 5^th, 10^th day of treatment and 3 days after the end of treatment as compared with normal saline did (absorbency: 0.660 ± 0.07, 0.632 ± 0.03, 0.663 ± 0.05 vs 0.872 ± 0.08, P < 0.05).

CONCLUSION: RXC has inhibitory effect on the replication of HBV.

Key Words: Hepatitis B virus; HepG2.2.15; Ren Xian Cao; Lamivudine

0 引言

全球大约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒[1], 慢性携带者有可能发展为原发性肝癌[2]. 尽管有有效的乙肝疫苗可以预防, 在许多国家乙肝病毒感染仍然是一个影响健康的主要因素, 尤其是在中国. 临床上较为常用的药物有干扰素和核苷类似物如拉米夫定[3]、阿得福韦[4-5]、恩替卡韦[6], 由于有效率不高和耐药性及价格昂贵使其临床应用受限. 因此对中药及其提取组分、有效成分的抗HBV作用研究受到关注. 1980年代用HBsAg作为乙型肝炎病毒模型对我国的中草药进行筛选, 随着新的乙肝模型的出现, 如HepG2.2.15细胞、鸭乙型肝炎病毒感染雏鸭模型等, 人们对中药的筛选更加深入[7-8].

临床观察复方药物祛毒增宁胶囊(ZL-1)对艾滋患者治疗6 mo, 患者CD₄明显上升病毒载量减少[9]. 另有文章报道ZL-1也可降低鸭血清乙型肝炎病毒DNA (DHBV-DNA)水平[10], 具有抗乙型肝炎病毒的作用. 为进一步分析ZL-1复方药物中抗HBV的有效组分, 我们以HBsAg蛋白为靶点, 利用BIAcore技术对ZL-1中的4种主要组分进行筛选, 进而采用HepG2.2.15细胞为模型, 观察人衔草(JH)体外抗HBV活性. 以鸭乙型肝炎病毒感染雏鸭模型, 观察对鸭血清DHBV DNA水平的影响. 进一步肯定有效组分的抗HBV作用及其特点.

1 材料和方法

1.1 材料

1日龄北京鸭(♂♀不分), 体质量40-50 g, 购自北京前进种鸭动物饲养场. JH是一种中药提取的有效部位, 为棕色粉末, 易溶于水, 生理盐水配制. 阳性药物拉米夫定为葛兰素威康制药公司产品, 用生理盐水配制. HepG2.2.15细胞(自人肝癌HepG2细胞转染而来, 分泌HBsAg和HBeAg及HBV颗粒), 细胞购于302医院病毒研究所. 鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性血清, 采自上海麻鸭, -70℃保存. Dulbeccos's Modified Eagle, s Medium(DMEM)培养基为美国Gibco公司, 胎牛血清(FBS)为美国HYclone公司, 胰蛋白酶为Amersco公司, 四甲基偶氮唑蓝(MTT)、G418为Sigma公司, 二甲基亚砜(DMSO)为夏思生物, α-32 P-dCTP购自北京福瑞生物技术工程公司, 缺口翻译药盒购自普洛麦格公司, Sephadex G-50, Ficoll PVP购自瑞典Pharmacia公司, SDS西德Merck公司产品, 鱼精DNA、牛血清白蛋白为中国科学院生物物理所产品, 硝酸纤维素膜0.45 nm为Amersham公司产品.

1.2 方法

1.2.1 生物分子相互作用分析仪(BIAcore)筛选: BIAcore是以表面等离子共振系统为基础, 进行实时分子相互作用分析的仪器. BIAcore 3000 (Uppsala, 瑞典)其中CM5芯片可用于选择中药复方中有效的组分. HBsAg蛋白用10 nm醋酸钠(NaAc)(pH5.0)缓冲液配制, 终浓度为30 mg/L, 固定蛋白时的流速为10 μL/min. 将他耦联到CM5感应片金薄膜表面上, 先用NHS/EDC活化感应片的葡聚糖表面, 再耦联HBsAg蛋白, 获得响应值约为5376.9共振单位(RU). 4种中药提取物溶于PBS, 取100 μL以10 μL/min速度进样, 分别得到他们的响应值.

1.2.2 细胞培养及MTT法测定药物细胞的毒性: HepG2.2.15细胞用DMEM培养液, 培养液中加100 mL/L胎牛血清, 100 mg/L青霉素, 100 mg/L链霉素, G418 200 mg/L, 10 g/L谷氨酰氨. 37℃ 50 mL/L CO₂培养箱中培养. 用2.5 g/L胰蛋白酶, 37℃消化细胞3 min, 稀释HepG2.2.15细胞至3×10⁸个/L, 96孔板每孔100 μL, 37℃ 50 mL/L CO₂培养箱中培养. 用MTT法测定药物的细胞毒性, 96孔板每孔3×10⁸个/L HepG2.2.15细胞100 μL, 37℃ 50 mL/L CO₂培养箱中培养. 1 d后, 换用含药培养液, 每个浓度5孔, JH用DMEM培养液稀释成1000, 500, 100, 20, 4 mg/L, 37℃ 50 mL/L CO₂培养箱中继续培养8 d. 向每孔细胞中加入5 mg/L MTT 10 μL, 每孔存有上清100 μL, 37℃ 50 mL/L CO₂培养箱中培养4 h后, 可见黄黑色甲瓒颗粒, 每孔加入150 μL酸化异丙醇, 吹打并在室温下放置, 甲瓒颗粒完全溶解后. 酶标仪570/630 nm波长测定A值(加入酸化异丙醇1 h内测定)空白对照及细胞对照各5孔. 细胞抑制百分率 = [(细胞对照A值-药物作用组A值)/(细胞对照A值-空白对照A值)]×100%. 用Bliss方法计算半数毒性浓度(TC₅₀).

1.2.3 药物对HBsAg和HBeAg分泌的抑制: 96孔板每孔3×10⁸个/L HepG 2.2.15细胞100 μL, 37℃ 50 mL/L CO₂培养箱中培养. 1 d后, 换用含药培养液, 每个浓度4孔, JH用DMEM培养液稀释成200 100, 20, 4 mg/L, 37℃ 50 mL/L CO₂培养箱中培养. 每3天换同浓度药液培养, 第9天收集培养上清, -20℃冰冻保存. ELISA检测试剂盒测定HBsAg和HBeAg, 酶标仪540/630 nm波长测定A值. 空白对照及细胞对照各4孔. 抑制百分率 ＝ [(细胞对照A值-给药组A值)/(细胞对照A值-空白对照A值)]×100%. 用Bliss方法计算半数有效浓度(IC₅₀). 治疗指数TI = TC₅₀/IC₅₀, 可评价药物临床应用前景, TI<1为有毒无效, TI = 2为有效有毒, TI>2为有效低毒. TI值越高, 药物的治疗效果就越好.

1.2.4 鸭乙型肝炎病毒感染及药物治疗: 1日龄北京鸭, 经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清, 每只0.2 mL, 在感染后7 d取血, 分离血清, -70℃保存待检. 待DHBV感染雏鸭7 d血清检测为阳性后, 将雏鸭随机分组, 逐只用脚环给动物编号记录, 每组6只, 进行药物治疗实验, JH给药组分3个剂量组, 分别为每天0.8 g/kg, 0.4 g/kg, 0.2 g/kg组, 分2次灌胃给药, 共10 d. 设病毒对照组(DHBV), 以生理盐水代替药物. 阳性药用拉米夫定, 口服给药每天50 mg/kg, 分2次给药, 共10 d. 在感染后第7天即用药前(T0), 用药第5天(T5), 用药第10天(T10)和停药后第3天(P3), 从鸭腿胫静脉取血, 分离血清, -70℃保存待检. 最后颈静脉取血, 分离血清, -70℃保存. 剪断气管, 处死动物, 剖腹取肝, 预冷的生理盐水冲洗肝脏, 剪成小块分装, 置-70℃保存.

1.2.5 血清DHBV-DNA斑点杂交: 取上述待检鸭血清50 μL加入96孔板, 加100 μL变性液混匀, 室温10 min. 加150 μL中和液混匀, 室温10 min. 取200 μL上述样品, 每批同时点膜, 测定鸭血清中DHBV-DNA水平的动态. 按缺口翻译试剂盒说明书方法, 用³²P标记DHBV-DNA探针, 做鸭血清斑点杂交, 放射自显影膜片斑点, 在酶标检测仪测定A值(滤光片为490 nm), 计算血清DHBV-DNA密度, 以杂交斑点A值作为标本DHBV-DNA水平值.

1.2.6 鸭肝组织DNA提取和Southern印迹及核酸杂交检测: 鸭肝中DHBV-DNA 取冰冻肝组织样品, 称取300 mg, 在冰上剪碎、电动匀浆器匀浆总体积为3 mL. 传统方法提取总DNA[11]. DNA溶于TE, -20℃保存. 检测时取少量进行凝胶电泳. DNA琼脂糖凝胶电泳及转膜, 制备HBV探针, 使用Promega随时引物试剂盒(大片段酶)进行探针标记, 操作过程按说明书进行. 核酸杂交显影. 利用美国Media Cybernetics公司生产的计算机辅助软件Gel-pro Analyzer version 3.0进行相片分析, 读取条带的A值. 计算每组鸭不同时间血清DNA A值的平均值(mean±SD), 并将每组鸭用药后不同时间(T5, T10)和停药后第3天(P3)血清DHBV-DNA水平与同组给药前(T0) A值比较, 计算每组鸭用药后不同时间血清DHBV-DNA的抑制率, 比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率. DNA抑制率(%) = [给药前A值给药后A值]/给药前A值×100%.

2 结果

2.1 HBsAg蛋白与药物相互作用

首先将HBsAg蛋白耦联到CM₅感应片上, 100 μL的JH及独尾(HQ)、青蒿素(QHS)、红绣球(Cd)溶液以10 μL/min速度进样, 与蛋白结合, JH与HBsAg蛋白结合的响应值为183.7 RU. HQ, QHS, Cd分别为162.1, 66.6, 39.1 RU, 在ZL-1 4种组分中JH响应值最高.

2.2 MTT法测定药物的细胞毒性

JH半数毒性浓度为1126.01 mg/L, JH对HepG2.2.15细胞有低毒作用(表1). JH对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制效果见表2. 200 mg/L JH对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分别为78.9%和35.58%, 有显著性作用. JH对HBeAg的抑制率为35.58%, 在同样浓度下黄芪多糖的抑制率为9.74%. JH对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的半数有效浓度(IC₅₀)分别为17.52 mg/L和754.26 mg/L. 治疗指数分别为64.27和1.49, HBsAg治疗指数>2, 提示JH在体外有较好的抗HBV作用.

表1 JH在2.2.15细胞培养中对细胞的毒性.

浓度(mg/L)	A	抑制率(%)	TC50
1000	0.286	60
500	0.554	22.5
100	0.593	17.1	1126.01
20	0.687	3.92
4	0.701	1.96
对照组	0.715

表2 JH在2.2.15细胞中对HBsAg和HBeAg活性的抑制作用.

浓度(mg/L)	HBsAg		HBeAg
	A	抑制率(%)	A	抑制率(%)
200	0.065	78.9	0.735	35.58
100	0.098	68.18	0.829	27.34
20	0.147	52.27	1.001	12.27
4	0.298	32.47	1.062	6.92
对照组	0.308		1.141

2.3 JH对DHBV感染鸭体内血清DHBV-DNA的影响

实验感染雏鸭30只第7天血清DHBV- DNA全部阳性. 3TC阳性对照组, 给药第5, 10天(T5, 10) A值为0.421±0.03和0.513±0.08与给药前(T0)的A值0.742±0.15比较, 鸭血清DHBV-DNA水平明显下降, 差异具有显著性意义(P<0.01, P<0.05, 表3). 对鸭血清DHBV-DNA抑制率与病毒对照组比较, 成组分析, 给药第5天, 差异具有显著性(P<0.01, 表4). 实验结果表明, JH 0.8 g/kg组, 在给药第3天, 死亡1只(灌胃不当所致). 给药后第5天(T5)和第10天(T10)和停药后3天(P3) DHBV-DNA A值分别为0.660±0.07, 0.632±0.03, 0.663±0.05, 与盐水组0.872±0.08比较对鸭血清DHBV-DNA有显著性意义(P<0.05). 0.4 g/kg组, 给药后第5天(T5)和10天(T10)和停药后3天(P3)对鸭血清DHBV-DNA有一定作用. 0.2 g/kg组, 给药后第5天(T5)、10天(T10)和停药后第3天(P3)对鸭血清DHBV-DNA无统计学意义.

表3 JH治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA A值比较.

组别	剂量(g/kg)	鸭数(n)	鸭血清DHBV-DNA A490值 (mean±SD)
			T0	T5	T10	P3
生理盐水		6	0.991±0.10	0.986±0.06	0.945±0.07	0.938±0.06
JH	0.8	5	0.872±0.08	0.660±0.07a	0.632±0.03a	0.663±0.05a
	0.4	6	0.858±0.12	0.705±0.10a	0.803±0.14	0.666±0.06a
	0.2	6	0.775±0.07	0.731±0.13	0.708±0.09	0.707±0.11
3TC	50	6	0.742±0.15	0.421±0.03b	0.513±0.08a	0.641±0.09

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 病毒对照组.

表4 JH治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较.

药物	剂量(g/Kg)	鸭数(n)	抑制率(%)
			T5	T10	P3
生理盐水	6	0.50	4.64	5.35
JH	0.8	5	24.31a	27.52a	23.97a
	0.4	6	17.83	6.41	22.38a
	0.2	6	5.68	8.65	8.77
3TC	0.05	6	43.26b	30.86a	13.61

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 病毒对照组.

2.4 JH对DHBV感染鸭肝组织中DHBV-DNA的影响

Southern杂交法检测药物治疗鸭肝组织中的DHBV-DNA, 结果显示, 肝组织中总DHBV-DNA量没有明显减少. 拉米夫定组感染鸭肝组织中总DHBV DNA量虽有所减少, 但A值结果比较显示, 拉米夫定组与盐水组比较鸭肝组织中总DHBV-DNA量无显著性差异. 盐水组鸭肝组织中总DHBV-DNA量无明显变化

3 讨论

BIAcore技术能实时检测生物分子与化学分子间的相互作用[12], 我们的相关实验初步结果显示: 药物与HBsAg蛋白的结合力与细胞体外实验呈正相关性, JH与HBsAg蛋白结合而与HBeAg蛋白没有结合. 根据上面结果我们通过BIAcore技术, 从ZL-1的四种主要组分中筛选出与HBsAg蛋白结合最强的JH. HepG2.2.15细胞由人肝癌细胞HepG2细胞转染完整的乙型肝炎病毒基因而来, 可稳定的分泌HBsAg和HBeAg及病毒颗粒, 是体外筛选抗HBV药物和药物评价的较好细胞模型, 被广泛用于抗乙型肝炎病毒药物的体外筛选[13-16]. 本实验结果表明JH对2.2.15细胞的半数毒性浓度为1126.01 mg/L,对HBsAg和HBeAg的半数抑制浓度分别为17.52 mg/L和754.26 mg/L. 提示JH体外有较好的抗乙型肝炎病毒作用.

鸭乙型肝炎病毒模型是国家认可的评价抗肝炎药物疗效的一种模型. 本实验在细胞实验的基础上, 利用鸭乙型肝炎病毒模型对JH的抗HBV作用进行研究, 结果显示JH可降低鸭血清中DHBV-DNA, 停药后没有明显反弹, 肝组织中总DHBV-DNA的量无明显变化. 拉米夫定可显著抑制血清中DHBV-DNA, 但停药后出现反弹, 肝组织中总DHBV-DNA的量虽有所减少, 但与盐水组比较无显著性差异. 说明JH可以抑制病毒颗粒在外周血中的释放, 与BIAcore技术结果相一致, 但其作用机制有待进一步研究. JH给药后对鸭血清中DHBV-DNA的抑制率为27.52%, 牛巍 et al[10]报道ZL-1给药4 wk后, 鸭血清中DHBV-DNA的抑制率为75%, 分析其原因: 一方面是由于我们的实验时间只有10 d, 延长用药时间是否可提高抑制率; 另一方面是由于ZL-1中的组分有协同作用. 以上结果值得进一步深入研究.

评论

背景资料

目前抗乙型肝炎药物由于效率不 高、价格昂贵, 临床治疗仍是难题之一. 有目的的从现在已知的中药中筛选有活性的抗乙型肝炎药物, 则可以缩短研究时间, 具有更强的实用性,显示出巨大的潜力.

研发前沿

近年来对乙型肝炎药物的研究有很大进展, 但是仍存在不少问题有待解决. 乙型肝炎病毒引起的体内免疫的分子机制还不完全清楚, 如何将各种新技术和试验模型合理结合起来用于评价抗乙型肝炎病毒药物需要进一步的研究探讨.

创新盘点

以乙型肝炎病毒生命周期中起关键作用的蛋白为靶点, 利用Biacore技术有目的地在药中筛选有效成分, 这是快速、高通量筛选和鉴定天然产物体系有效成分的有效途径.

应用要点

利用Biacore技术有目的地在中药中筛选抗乙型肝炎药物, 不必使用荧光标记和同位素, 从而保持了生物分子的天然活性, 而且他能实时检测分子间的相互作用. 在此基础上进一步进行细胞的体外研究和动物体内的实验 研究, 可以缩短研究时间, 提高研究的效率. 但Biacore技术筛选结果与细胞及动物实验 结果的相关性有待继续研究.

名词解释

BIA技术: 生物分子相互作用分析技术是基于物理光学现象, (即表面等离子共振)来监测传感片表面体的折射率变化, 而这一变化和传感片表面所结合生物分子的质量成正比. 因此可在非标记的情况下实时监测生物分子间的相互作用. 当进行分子间相互作用分析时, 将其中一个反应物偶联在传感片上, 含有另一个反应物的样品通过体输送系统以恒定的流速通过传感片表面, 分子间有结合反应而导致传感片表面分子浓度的变化将由等离子共振信号的改变而得到测定, 并以共振单位(RU)作表达.

备注

电编:李琪 编辑:王晓瑜

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