血管紧张素原基因T174M变异与肝硬化的相关性

摘要

目的: 研究血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)基因T174M分子变异与肝硬化的关系. 

方法:  提取正常人64例和肝硬化患者65例白细胞基因组DNA, 通过PCR、限制性片段长度多态性和测序等技术, 观察AGT基因型在肝硬化组和正常组分布的差异. 

结果: AGT基因T174M位点MT和TT基因型的频率在正常组和肝硬化组分别为82.8%、17.2%和84.6%、15.4%, 两组之间不存在差异(χ² = 0.077, P>0.05).

结论:  血管紧张素原基因T174M变异与肝硬化没有显著关系.

关键词: 血管紧张素原; 遗传多态性; 肝硬化; 聚合酶链式反应

Association analysis of T174M variants of the angiotensinogen gene with hepatocirrhosis

Fan Xiao, Hong-Shan Wei, Wen-Mei Fan, Guo-Li Li

Fan Xiao, Hong-Shan Wei, Wen-Mei Fan, Guo-Li Li, Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China

Correspondence to: Fan Xiao, Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, 13 Ditan Park, Anwai Street, Beijing 100011, China. cindy2358@163.com

Received: August 21, 2007
Revised: November 2, 2007
Accepted: November 11, 2007
Published online: December 18, 2007

Abstract

AIM: To detect the relationships between variants in the T174M polymorphism of the angiotensinogen gene and hepatocirrhosis.

METHODS: Genomic DNA from leukocytes was analyzed for genetic variants at the T174M polymorphism of the AGT gene by polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP) and automatic sequencing.

RESULTS: The distributions of MT and TT genotypes were not different between the hepatocirrhosis group (84.6%, 15.4% ) and the control group (82.8%, 17.2%) (χ² = 0.077, P > 0.05).

CONCLUSION: T174M polymorphism in the AGT gene is not likely to be involved in hepatocirrhosis.

Key Words: Angiotensinogen; Genetic polymorphism; Hepatocirrhosis; PCR

0 引言

魏红山 et al报道组织局部肾素-血管紧张素系统的激活与肝纤维化的发生有关[1-2]. 血管紧张素原基因(angiotensinogen, AGT)是存在于血清中的球状糖蛋白, 主要在肝脏合成, 是肾素-血管紧张素系统的唯一初始底物[3]. 人AGT全长13 kb, 含5个外显子和4个内含子[4]. 已有研究证实AGT基因多态性与多种疾病相关, 包括高血压、脑梗塞、冠心病, 肝纤维化等[5-8]. 我们的前期工作也证实AGT基因核心启动子区的变异与乙肝感染后的肝硬化相关[9]. 现在我们通过对人AGT基因第二外显子的T174M分子变异分析, 探讨慢性HBV感染后, AGT基因突变与肝硬化发生的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

收集2005-06/2005-12在北京地坛医院住院的慢性HBV感染后转换成的肝硬化患者全血标本64份, 男25例, 女39例, 年龄40±5岁; 正常人全血标本62份, 男29例, 女33例, 年龄35±5岁. 病例的诊断标准符合2000年西安第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议制定的《病毒性肝炎防治方案》中的相关标准.

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取: 人基因组DNA样品取自实验对象外周血. 采用全血基因组DNA提取试剂盒(北京华美生物公司)提取白细胞基因组DNA, -20℃放置, 备用.

1.2.2 DNA片段的扩增: 5'引物TGGCACCCTGGCCTCTCTCTATCT, 3'引物CAGCCTGCATGAACCTGTCAATCT(上海生物工程有限公司合成). 扩增体系含各引物1 μmol/L, dNTP浓度各为200 μmol/L, Mg²⁺浓度为2.0 mmol/L, Taq DNA聚合酶2.5 U, 10×缓冲液2.5 μL(深圳晶美生物工程有限公司), 模板DNA约0.1 μg, 加灭菌去离子水补足体积为25 μL. 按下述程序进行DNA扩增反应: 94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 63.5℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 循环35次后于72℃继续延伸7 min. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察扩增结果.

1.2.3 PCR产物的RFLP分析:NcoⅠ酶切反应(针对T174M变异), PCR扩增产物8 mL, 10×缓冲液2 mL, NcoⅠ内切酶12 U, 加灭菌去离子水补足体积至20 mL, 酶切反应在37℃进行12 h. 酶切产物在30 g/L琼脂糖凝胶电泳后在凝腔成像系统仪下观察并保存结果.

统计学处理 分析计数资料组间差异采用χ²检验分析, P<0.05认为组间有显著差异.

2 结果

2.1 PCR扩增结果

PCR扩增片段约为311 bp, 与理论设计片段大小基本一致.

2.2 RFLP酶切分析及测序结果

126个样品经NcoⅠ酶切, 电泳结果显示出现3种带型. 带型311 bp为TT纯合型, 带型311 bp、140 bp为MT杂合型; 带型140 bp为MM纯合型, 本次实验中未检测出MM纯合型(图1). PCR直接测序结果进一步验证了此结果.

图1 PCR/RFLP电泳结果. 1: DNA Marker; 2-5: TT纯合型; 6: MT杂合型.

2.3 AGT T174M变异与肝硬化相关性分析

统计分析表明, 实验样本基因型分布符合Hardy-Weiberg平衡. 采用χ²统计, 对62例正常人样品和64例肝硬化样品AGT基因T174M多态性进行分析, 发现携带AGT基因T174M位点MT、TT基因型的样品数目分别为55(84.6%)、10(15.4%)和53(82.8%)、11(17.2%), 基因型分布差异没有显著性意义(χ² = 0.077, P>0.05).

3 讨论

越来越多的研究证明肾素-血管紧张素系统的激活与肝纤维化的发生有关. AGT主要在肝脏合成, 是肾素-血管紧张素系统的唯一初始底物. 其合成不仅受多种激素调节, 更主要的是受基因转录水平的调控. AGT基因的基因变异与人类多种疾病相关[10-12]. 我们的前期工作证实AGT基因5'核心启动子区的变异(A-20C和A-6G)与乙肝感染后的肝硬化相关. 而位于第二外显子的T174M也已被证实与多种疾病相关, 如高血压、肾病、心血管疾病等[13-15]. 因此本课题研究AGT基因T174M多态性是否与慢性乙肝感染后的肝硬化相关.

我们采用PCR、PCR/RFLP、测序等方法分析64个肝硬化血液标本, 62个正常人血液标本. AGT基因T174M位点MT、TT基因型的频率在慢性HBV感染后的正常组和肝硬化组分别为 82.8%、17.2%和84.6%、15.4%, 两组之间不存在差异(χ² = 0.077, P>0.05). 分析表明, HBV感染后肝硬化的形成可能与AGT基因T174M分子变异无关.

评论

背景资料

已有研究证实AGT基因多态性与多种疾病相关, 包括高血压、脑梗塞、冠心病, 肝纤维化等. 本课题组的前期工作也证实AGT基因核心启动子区的变异与乙肝感染后的肝硬化相关.

研发前沿

最新的研究表明AGT基因核心启动子区的变异与乙肝感染后的肝硬化相关, 暂无ATG基因外显子的变异与肝硬化的关系.

名词解释

血管紧张素原基因(AGT): 是存在于血清中的球状糖蛋白, 主要在肝脏合成, 是肾素-血管紧张素系统的唯一初始底物.

同行评价

本文选题较好, 方法成熟, 结论有些简单, 建议作进一步的研究.

备注

编辑: 程剑侠 电编: 何基才

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