基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2007-08-18; 15(23): 2477-2481
在线出版日期: 2007-08-18. doi: 10.11569/wcjd.v15.i23.2477
胰岛素样生长因子Ⅱ与胃癌细胞SGC7901 c-fos和c-jun表达的关系
高欣, 邓长生
高欣, 邓长生, 武汉大学中南医院消化内科 湖北省武汉市 430071
高欣, 2007届武汉大学中南医院硕士研究生, 主要从事胃癌基础与临床研究.
通讯作者: 邓长生, 430071, 湖北省武汉市武昌区东湖路169号, 武汉大学中南医院消化内科. kate112@163.com
收稿日期: 2007-06-09
修回日期: 2007-08-09
接受日期: 2007-08-28
在线出版日期: 2007-08-18

目的: 探讨胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin-like growth factor-Ⅱ, IGF-Ⅱ)与胃癌细胞SGC7901 c-fos和c-jun表达的关系.

方法: 体外细胞培养, 分别用MTT法和免疫组织化学以及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测不同浓度IGF-Ⅱ(0, 10, 50, 100 mg/L)作用胃癌细胞后细胞的增殖率和c-fos和c-jun蛋白及mRNA的表达情况.

结果: IGF-Ⅱ作用于细胞SGC7901的增殖效应呈浓度和时间依赖性; 随着药物浓度的升高, c-fos和c-jun蛋白, mRNA表达均增加. 在IGF-Ⅱ10, 50, 100 mg/L时, c-fos和c-jun蛋白分别为41.32±1.28 mg/L, 50.43±0.57 mg/L, 64.22±1.76 mg/L; 52.00±0.67 mg/L, 63.20±0.95 mg/L, 76.31±1.16 mg/L; c-fos, c-jun mRNA与GAPDH mRNA比值分别为0.316±0.021, 0.392±0.0357, 0.478±0.028; 0.379±0.006, 0.412±0.022, 0.494±0.048, 均与相应对照组(30.00±1.01 mg/L, 41.14±2.02 mg/L, 0.220±0.037, 0.290±0.064)相比有统计学意义(P<0.05, P<0.01).

结论: 胰岛素样生长因子Ⅱ可能通过旁分泌上调c-fos和c-jun的表达而诱导胃癌细胞增殖.

关键词: 胃癌细胞SGC7901; 胰岛素样生长因子Ⅱ; 逆转录聚合酶链反应
引文著录: 高欣, 邓长生. 胰岛素样生长因子Ⅱ与胃癌细胞SGC7901 c-fos和c-jun表达的关系. 世界华人消化杂志 2007; 15(23): 2477-2481
In vitro relationship of c-fos and c-jun expression with insulin-like growth factor-Ⅱ in SGC7901 gastric cells
Xin Gao, Chang-Sheng Deng
Xin Gao, Chang-Sheng Deng, Department of Gastroenterology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China
Correspondence to: Chang-Sheng Deng, Department of Gastroenterology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 169 Donghu Road, Wuchang District, Wuhan 430071, Hubei Province, China. kate112@163.com
Received: June 9, 2007
Revised: August 9, 2007
Accepted: August 28, 2007
Published online: August 18, 2007

AIM: To study the effects of c-fos and c-jun expression in the SGC7901 gastric cancer cell line with insulin-like growth factor (IGF)-Ⅱ.

METHODS: Proliferative activity was determined by the MTT assay. c-fos and c-jun expression was detected by immunohistochemistry and reverse transcriptase-polymerase chain reaction.

RESULTS: IGF-Ⅱ promoted the proliferation of SGC7901 human gastric cancer cells. The rate of proliferation was time and dosage dependent. Increasing concentrations of IGF-Ⅱ increased c-fos and c-jun expression at the protein and mRNA level. IGF-Ⅱ at 10, 50 or 100 mg/L resulted in c-fos and c-jun protein expression of 41.32 ± 1.28, 50.43 ± 0.57 and 64.22 ± 1.76 mg/L; and 52.00 ± 0.67, 63.20 ± 0.95 and 76.31 ± 1.16 mg/L, respectively. The ratios of c-fos and c-jun expression in mRNA level with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA were 0.316 ± 0.021, 0.392 ± 0.0357 and 0.478 ± 0.028; and 0.379 ± 0.006, 0.412 ± 0.022, and 0.494 ± 0.048, respectively. The ratios of the experimental group were significantly different from those of the control group (30.00 ± 1.01 mg/L, 41.14 ± 2.02 mg/L, 0.220 ± 0.037, 0.290 ± 0.064, respectively).

CONCLUSION: IGF-Ⅱ enhances the proliferation of SGC7901 cells. The possible mechanism is that IGF-Ⅱ induces gastric carcinoma cells to proliferate by increasing c-fos and c-jun expression in a paracrine manner.

Key Words: SGC7901; Insulin-like growth factor Ⅱ; Reverse transcriptase-polymerase chain reaction
0 引言

胃癌是一种发病率很高的恶性肿瘤, 尤其是在亚洲国家, 手术切除仍是目前胃癌治疗的首选方法, 其发病机制目前仍尚未明确, 近年来随着分子生物学理论和技术的发展, 胃癌基础研究的深入, 人们对胃癌发病分子机制的认识不断更新. 胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)最初由Rinderkencth于1976年从人的血清Cohn组中分离得到, 目前发现胰岛素样生长因子有2种, 分别为IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ[1]. IGF-Ⅱ是由67个氨基酸组成的单链多肽, 结构与IGF-Ⅰ, 胰岛素原相似, 能促进脂肪和糖代谢, 尤其对机体的生长发育有着重要的调节作用, 但其确切的生理机制尚不清楚. 多种肿瘤均发现有IGF-Ⅱ的异常激活和表达, IGF-Ⅱ的生物学作用主要是由IGF-ⅠR介导的, 可启动PI3K/Akt, Ras/MAPK 2条信号通路, 他们在细胞增殖、分化、凋亡中均起重要作用. c-fos和c-jun作为核内转录因子, 他们是活化MAPK作用的下游分子, 活化的MAPK转导入细胞核并激活c-fos和c-jun基因, 表达的c-fos和c-jun蛋白以异二聚体或c-jun同二聚体形式结合到AP-1启动子结合位点, 诱导cyclinD1和c-myc等癌基因表达. 本实验探讨IGF-Ⅱ与胃癌细胞SGC7901 c-fos和c-jun表达的关系, 对胃癌的发病机制、诊断及治疗都将有重要的指导意义.

1 材料和方法
1.1 材料

胃癌细胞SGC7901(武汉大学实验室提供), IGF-Ⅱ(英国Peprotech公司), c-fos, c-jun抗体(武汉博士德公司), TRIzol试剂(上海华舜生物工程有限公司产品), M-MLV逆转录酶(Promega公司产品), RPMI1640培养基(Sigma公司产品), 胰蛋白酶(Amresco产品), DNA酶(上海丽珠东风制备厂), 人c-fos, c-jun及GAPDH引物(Primer 5.0设计, 由北京奥科生物科技公司合成, 表1).

表1 各引物的碱基序列.
GeneOligoSequenceProduct size (bp)
c-junForword primer5'GCAGGAGGGAGGTTTGTGA3'500
Rerverse primer5'GGAGTATAACCTGACCATAGCAT3'
c-fosForword primer5'GGAGAATCCGAAGGGAAAGG3'367
Rerverse primer5'ATGCTGCTGATGCTCTTGACA3'
GAPDHForword primer5'TGGGTGTGAACCATGAGAAGT3'434
Rerverse primer5'TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC3'
1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 人胃癌细胞SGC7901复苏后于含100 g/L小牛血清、100 kU/L青霉素及100 kU/L链霉素的RPMI1640的培养液中, 37℃, 50 mL/L CO2条件下培养.

1.2.2 四唑盐比色法(MTT法): 取对数生长期细胞, 以107/L的浓度接种于96孔板, 每孔200 μL培养24 h后更换不含血清的培养液, 同时设3个实验组(在不含培养液中分别加入终浓度为10, 50, 100 μg/L的IGF-Ⅱ)和对照组(无IGF-Ⅱ), 每组接种3孔, 在37℃, 50 mL/L CO2条件下, 分别培养24, 48, 72 h, 加入5 g/L MTT 20 μL继续培养4 h, 离心吸尽上清液, 加入150 μL二甲基亚枫(DMSO)于摇床上震荡10 min, 于自动酶标仪测570 nm各孔吸光度值. 计算细胞增殖率: 增殖率% = (B-A)/A×100(A: 对照组, B: 实验组).

1.2.3 免疫组化染色: 取对数生长期细胞, 消化离心后, 将细胞悬液以2×108/L浓度接种到已预置无菌小玻片的24孔板中, 每孔加入1 mL培养基, 培养24 h后去掉上清, 用不含血清的培养液洗2次, 加入含不同浓度的IGF-Ⅱ(0, 10, 50, 100 μg/L)无血清培养基500 μL, 一共4个组, 每组设3孔, 继续培养48 h, 取出盖玻片, PBS洗3次, 4℃无水乙醇固定15 min. 免疫组化方法参照试剂说明书进行, 用计算机图像分析软件计算积分光密度值(IOD), 每组各取片2张, 每张随机观察5个视野, 放大倍数均为200.

1.2.4 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法: 取对数生长期细胞, 消化离心后, 将细胞悬液以2×108/L浓度接种到24孔板中, 每孔加入1 mL培养基, 培养24 h后去掉上清, 用不含血清的培养液洗2次, 加入含不同浓度的IGF-Ⅱ(0, 10, 50, 100 μg/L)无血清培养基500 μL, 共4组(A, B, C, D), 每组3个复孔, 继续培育24 h, 分别收集4组细胞, 提取细胞总RNA, RT-PCR法检测c-fos和c-jun的表达. 按TRIzol试剂一步法提取胃癌细胞总RNA. 经紫外分光光度法定量后, 取2 μg RNA用M-MLV逆转录酶进行逆转录反应合成cDNA. 以GADPH为内参照, 分别取1 μL模板进行PCR反应. c-fos和c-jun的反应条件均为预变性95℃ 5 min, 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 28个循环后72℃延伸5 min. 结果检测: 20 g/L琼脂糖检测, 100 V电压, EB染色. 结果分析: 利用SynGene公司开发的随凝胶成像系统的GeneTools图像软件进行半定量分析, 比较目标基因与内参基因的相对表达量变化, 并将数据转换到Excel表格中, 利用Excel做出相对表达趋势图.

统计学处理 数据以mean±SD表示, 应用SPSS11.5统计软件进行分析, P<0.05为差异有显著性.

2 结果
2.1 MTT法测细胞增殖率

利用吸光度值计算实验组及对照组细胞增殖率, 随着IGF-Ⅱ浓度的增加细胞增殖率逐渐增强, 同样药物浓度的IGF-Ⅱ作用下, 随着时间的延长细胞增殖率逐渐增强(表2).

表2 不同浓度IGF-Ⅱ作用于SGC7901的细胞吸光度值及细胞增殖率(mean±SD, %).
分组0 mg/L
10 mg/L
50 mg/L
100 mg/L
A值增殖率A值增殖率A值增殖率A值增殖率
24 h0.374±0.04600.396±0.0465.880.405±0.0228.290.446±0.03019.25
48 h0.418±0.01900.449±0.0277.420.496±0.01818.660.559±0.02033.73
72 h0.515±0.02000.601±0.04416.700.651±0.04326.410.703±0.03336.50
2.2 IGF-Ⅱ对胃癌细胞SGC7901中c-fos和c-jun蛋白表达的影响

免疫细胞化学及图像分析结果显示, c-fos, c-jun阳性颗粒均位于胞核, 胃癌细胞SGC7901经IGF-Ⅱ作用后c-fos, c-jun蛋白的表达增加, 不同浓度的IGF-Ⅱ组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05), 随着IGF-Ⅱ浓度的升高, c-fos, c-jun蛋白的表达增加更甚, 在IGF-Ⅱ终浓度为100 mg/L时, c-fos, c-jun蛋白的表达最多(表3).

表3 不同浓度的IGF-Ⅱ对c-fos和c-jun蛋白表达IOD值的影响(mean±SD).
分组IOD (10-2)
c-fosc-jun
IGF-Ⅱ组(mg/L)1041.32±1.28a52.00±0.67a
5050.43±0.57a63.20±0.95a
10064.22±1.76a76.31±1.16a
对照组30.00±1.0141.14±2.02
aP<0.05 vs 对照组.
2.3 IGF-Ⅱ对胃癌细胞SGC7901中c-fos

mRNA和c-jun mRNA表达的影响 对电泳结果进行激光密度扫描得到c-fos, c-jun, GAPDH mRNA表达的光密度, 以GAPDH为内参照, 计算出c-fos, c-jun mRNA表达量的相对值. 结果显示: 10, 50, 100 mg/L的IGF-Ⅱ刺激SGC7901后的c-fos mRNA与GAPDH mRNA比值分别为0.316±0.021, 0.392±0.0357, 0.478±0.028与对照组0.220±0.037相比, 差异有统计学意义(P<0.01). c-jun mRNA与GAPDH mRNA比值分别为0.379±0.006, 0.412±0.022, 0.494±0.048与对照组0.290±0.064相比, 差异有统计学意义(P<0.01).

3 讨论

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤, 起源于上皮, 在胃的恶性肿瘤中, 腺癌占95%, 他是一种全球性疾病, 但两性间、不同年龄间、各国家地区间、各种族间、甚至同一地区不同时期的发病率都有较大差异. 癌症是多种因素的调控作用, 共同参与发病, 癌基因激活、抑癌基因失活、一些生长因子和受体的调节作用、基因突变和DNA修复系统功能的缺陷等在胃癌发生、发展中起着重要的作用. 有研究证明, 一些生长因子的上调能促进胃癌的发展[2-3].

IGF-Ⅱ是一种非常强的丝裂原, 可促进多种细胞的增殖, 抑制细胞凋亡. 人类IGF-Ⅱ基因位于染色体11p15.5, 内含9个外显子(EI-E9)、4个启动子(P1-P4), 前6个外显子编码5'-UTR, 外显子7, 8编码成熟IGF-Ⅱ肽链和E肽N端, 外显子9编码其余E肽及3'-UTR, 由于IGF-Ⅱ基因转录受4个启动子调控, 在人生长发育及病理生理的不同时期, 启动子的激活各不相同, 产生的mRNA具有多种形式, 一共有5种. 在启动子P2, P3, P4作用下形成胚胎型IGF-Ⅱ mRNA, 这种IGF-Ⅱ mRNA在出生后消失, 由P1启动子作用取代形成成年型IGF-Ⅱ mRNA. 以上各种IGF-Ⅱ mRNA虽长短不同, 但差别只在非翻译区外显子El-E3的有无, 而其编码蛋白质的外显子El-E4却都相同. 所以最终翻译成的蛋白成分也相似[4]. IGF-Ⅱ在血液中不单独存在, 而是与其结合蛋白结合. 无论是游离的或是以结合形式存在的IGF-Ⅱ, 均必须与IGF-Ⅰ或IGF-Ⅱ受体结合才能发挥作用. IGF-ⅠR由2个α和2个b亚单位所构成的四聚体来介导细胞内的效应[5]. α亚单位是完全位于膜外侧的肽链, 含有激素结合位点; b亚单位跨膜穿行, 通过双硫键与α亚单位连结, 其膜内结构域含有酪氨酸蛋白激酶(PTK)的活性[6]. 多数学者认为, IGF-Ⅱ的生物学作用主要是由IGF-ⅠR介导的[7-8], 可启动2条信号通路, 1条是受体-磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)-Akt(又叫蛋白激酶B)信号通路; 另1条是受体-Ras-Raf-丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路, 这2条通路在细胞增殖、分化、凋亡中均起重要作用[9-10]. IGF-ⅡR为果糖-6-磷酸受体, 只有1条肽链, 也跨膜穿行, 膜外侧肽链较长, 但膜内结构域短且无PTK活性, 可能通过G蛋白在细胞内传递信息, 他通过与IGF-Ⅱ配体结合、细胞内摄取促使IGF-Ⅱ配体降解而限制IGF-Ⅱ介导的生长刺激作用, 因此IGF-ⅡR的存在影响细胞外IGF-Ⅱ的水平[11-12], IGF-Ⅱ受体基因缺失会引起血清中IGF-Ⅱ水平的升高, 过度激活IGF-Ⅰ受体, 导致胚胎过度生长最终死亡, IGF-ⅡR基因缺失与肿瘤的发生、发展有着重要的关系[13-15].

近年来研究表明, IGF-Ⅱ与肿瘤关系密切, 多种肿瘤如肝癌、结直肠癌、前列腺癌、脂肪肉瘤、胚源性肿瘤和肺癌等, 均发现有IGF-Ⅱ的异常激活和表达[16-21], IGF-Ⅱ能促进肿瘤细胞分裂和分化, 抑制肿瘤细胞的凋亡. 他在胃癌的发生和发展中也具有重要的作用. Lee et al[22]通过放射免疫测定法和免疫印迹法测定胃癌患者手术前后血清中IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ, IGFBP3的表达情况发现, 3者在手术后的表达明显降低, 尤其以IGF-Ⅱ最为显著, 随后国内也有相关报道. Yi et al[23]利用RT-PCR、竞争性PCR的方法检测5种不同的胃癌细胞株以及胃癌组织、正常对照组织发现, 均有不同程度的IGF-Ⅱ mRNA表达, 尤其在胃癌组织中呈过度表达. Pavelic et al[24]从蛋白和mRNA水平研究肠型和弥散型胃癌中IGF-Ⅱ及其受体的表达情况, 发现IGF-Ⅱ蛋白水平的表达在弥散型胃癌组织中明显高于肠型, 而IGF-1R蛋白的表达无差别. Zhao et al[25]应用原位杂交和免疫组织化学方法检测105例胃癌组织中IGF-Ⅱ和HGF mRNA及CD34的表达, 结果得出胃癌的侵袭深度、侵犯脉管、淋巴结及远处转移均与IGF-Ⅱ和HGF mRNA的表达水平均有关(P<0.05). 以上研究表明, 胃癌患者血清及胃癌组织中IGF-Ⅱ均呈过度表达. 本次实验是以胃癌细胞为研究对象, 来探讨IGF-Ⅱ诱导胃癌细胞发生恶性增殖的可能机制.

在肿瘤发生、发展的基因调控中, 即刻早期应答基因c-fos和c-jun尤为重要. 他们在正常细胞中表达量很少, 辐射、高血压和应激反应等均可诱导这些基因的早期过度表达. 作为核内转录因子, 他们是活化MAPK(mitogen activated protein kinases)作用的下游分子, 活化的MAPK转导入细胞核并激活c-fos和c-jun基因, 表达的c-fos和c-jun蛋白以c-fos/c-jun杂合二聚体或c-jun同二聚体形式构成活化蛋白-1(AP-1), AP-1作为转录因子与特定的DNA序列结合, 在转录水平调控基因的表达, 激活cyclin D1和c-myc等多种致癌基因表达, 在细胞的恶性转化以及肿瘤的形成中起一定的作用[26-27]. c-fos和c-jun作为AP-1的重要组成部分, 其表达量及活化直接影响AP-1结合DNA的能力. 本研究将IGF-Ⅱ直接作用于胃癌细胞株SGC7901, 根据文献报道IGF-Ⅱ的生物学特性, 选择10, 50, 100 mg/L的IGF-Ⅱ作为实验组用药浓度, 运用MTT, 免疫组化和半定量PT-PCR的方法观察分析, 结果显示, IGF-Ⅱ有着促进胃癌细胞增殖的能力, 一定浓度时IGF-Ⅱ单独作用于SGC7901的增殖效应随时间延长而增强, 一定时间下这种增殖效应随浓度增加而增强. 随着药物浓度的升高, c-fos和c-jun蛋白及mRNA表达量增加. 其机制系IGF-Ⅱ可能通过旁分泌上调c-fos和c-jun的表达, 诱导胃癌细胞发生恶性增殖.

目前, 恶性肿瘤的治愈率很低, 很重要的一点是就诊时患者已处于晚期, 肿瘤已经发生了浸润、转移. 大量研究发现IGF-Ⅱ的过表达不仅与胃癌有关, 而且是胃癌发生、发展过程中影响着其分子生物学行为的重要元素之一, 这为我们在其治疗道路上提供了新的思路. 最近有报道反义基因IGF-Ⅱ转染胃癌细胞株可抑制细胞的恶性表型, 诱导细胞的凋亡. 那么对胃癌患者应用反义RNA靶向治疗或阻断IGF-Ⅱ转导通路的任一环节都可能有潜在的应用前景, 需要进一步探讨.

评论
背景资料

胃癌是一种发病率很高的恶性肿瘤, 其发病机制目前仍尚未明确, 近年来随着分子生物学理论和技术的发展, 胃癌基础研究的深入, 人们对胃癌发病分子机制的认识不断更新. 研究表明, IGF-Ⅱ与肿瘤关系密切, 多种肿瘤均发现有IGF-Ⅱ的异常激活和表达, 已经成为研究的热点, 本文通过检测胰岛素样生长因子Ⅱ与胃癌细胞SGC7901 c-fos和c-jun表达的关系来探讨其可能机制.

研发前沿

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一, 是多因素共同作用的结果. 胰岛素样生长因子 Ⅱ与胃癌的关系是目前研究的热点之一.

应用要点

本文是以胃癌细胞为研究对象, 得出IGF-Ⅱ有着促进胃癌细胞增殖的能力, 对其治疗道路提供了一定的思路. 对胃癌患者应用反义RNA靶向治疗或阻断 IGF-Ⅱ转导通路的任一环节都可能有潜在的应用前景.

研发前沿

如何降低少见病因急性肠梗阻的病死率是当前研究的热点和重点,也是亟待研究的问题.

名词解释

1 酪氨酸蛋白激酶(PTK): 是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质, 能催化蛋白质的酪氨酸残基发生磷酸化反应, 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是细胞信号传递的关键变化,PTK通过激活信号转导系统, 调控基因表达、细胞生长和增殖, 影响细胞功能.2 放射免疫法: 是利用同位素标记的与未标记的抗原, 同抗体发生竞争性抑制反应的方法, 研究机体对抗原物质反应的发生、发展和转化规律.

同行评价

本文采用RT-PCR等分子生物学方法, 探讨了胰岛素样生长因子Ⅱ与胃癌细胞系SGC7901 c-fos和 c-jun表达的关系,研究内容较新颖, 所得出的结果对阐明胃癌的发生机制有一定的意义, 有较好的学术价值.

编辑:程剑侠 电编:张敏

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