修回日期: 2007-04-01
接受日期: 2007-04-28
在线出版日期: 2007-07-18
目的: 探讨中药半枝莲黄酮类化合物A06对体外肿瘤血管生成的影响.
方法: 分别采用小管形成实验、Transwell小室、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、硝酸还原酶法检测半枝莲黄酮类化合物A06对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)小管形成、迁移及人宫颈癌Hela细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)、一氧化氮(NO)表达的影响.
结果: 与对照组相比, 半枝莲黄酮类化合物A06(50和100 mg/L)都能有效抑制HUVEC细胞的迁移(37.7%±10.7%, 13.7%±6.0% vs 68.0%±8.2%, 均P<0.01), 减少小管样结构形成(9.7%±4.5%, 1.8%±1.2% vs 30.2%±5.4%, 均P<0.05), 以及降低24 h 后Hela细胞VEGF和NO的表达(VEGF: 135.6±14.6 ng/L, 108.3±7.7 ng/L vs 231.1±6.4 ng/L, 均P<0.01; NO: 42.3±2.3 mmol/L, 25.9±5.2 mmol/L vs 70.1±8.1 mmol/L, 均P<0.01).
结论: 半枝莲黄酮类化合物A06有抑制体外肿瘤血管生成的作用, 可能与抑制肿瘤细胞血管生成相关因子的表达, 抑制内皮细胞迁移、形成管样结构有关.
引文著录: 徐敏, 卜平, 李瑶瑶. 半枝莲黄酮类化合物对体外肿瘤血管生成的影响. 世界华人消化杂志 2007; 15(20): 2215-2219
Revised: April 1, 2007
Accepted: April 28, 2007
Published online: July 18, 2007
AIM: To explore the effects of the extract flavonoid A06 from Scutellaria barbatae D.DON on tumor angiogenesis in vitro.
METHODS: Human umbilical venous endothelial cells (HUVECs) were treated with different concentrations of the flavonoid A06 (25, 50 and 100 mg/L). The effect of flavonoid A06 on the formation and migration of tubules in cultured HUVECs was evaluated by tube formation assay and Transwell chambers. The effect of flavonoid A06 on protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and nitric oxide (NO) in human cervical carcinoma Hela cells was detected by enzyme-linked immunosorbent assay and the nitrate reductase method.
RESULTS: Flavonoid A06 extract from Scutellaria barbatae D.DON at two concentrations (50 and 100 mg/L) effectively inhibited migration (37.7% ± 10.7%, 13.7% ± 6.0% vs 68.0% ± 8.2%, both P < 0.01) and tubule formation in HUVECs (9.7% ± 4.5%, 1.8% ± 1.2% vs 30.2% ± 5.4%, both P < 0.05) after 24 h. Flavonoid A06 also decreased the protein expression of VEGF and NO in Hela cells after 24 h (VEGF, 135.6 ± 14.6 ng/L, 108.3 ± 7.7 ng/L vs 231.1 ± 6.4 ng/L, both P < 0.01; NO, 42.3 ± 2.3 mmol/L, 25.9 ± 5.2 mmol/L vs 70.1 ± 8.1 mmol/L, both P < 0.01).
CONCLUSION: Flavonoid A06 inhibits tumor angiogenesis in vitro. Its mechanism may be related to the inhibition of the expression of VEGF and NO, endothelial cell migration and tubule formation.
- Citation: Xu M, Bu P, Li YY. Effects of an extract from Scutellaria barbatae D.DON on tumor angiogenesis in vitro. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 15(20): 2215-2219
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v15/i20/2215.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v15.i20.2215
半枝莲为唇形科植物半枝莲Scutellaria barbatae D. Don的干燥全草, 药性辛、苦、寒, 归肺、肝、肾三经. 具有清热解毒、散瘀活血之功效. 分布在我国大部分地区, 资源极其丰富. 民间用于肝癌、肺癌、肾癌等的治疗. 有文献报道, 半枝莲提取物对多种肿瘤细胞如S180, W256, 艾氏腹水瘤等具有生长抑制作用. 在临床上, 半枝莲可治疗肝癌、肺癌、乳腺癌、绒毛膜癌等[1]. 目前已经从半枝莲中分离出了一些化合物, 主要是生物碱和黄酮类, 这些化合物表现出促进细胞免疫、抗病毒、解热、保肝、抗肿瘤[2]等作用. 但是对于半枝莲抗肿瘤的药理作用机制、作用方式、有效部位和活性成分等方面的报道极少. 我们前期研究发现, 半枝莲含药血清能够抑制Matrigel栓内微血管的形成, 阻断内皮细胞迁移, 抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达[3]. 现对半枝莲提取物中黄酮类化合物A06对肿瘤血管生成的作用机制进行了研究.
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、宫颈癌Hela细胞株由扬州大学医学院中医系实验室提供; 半枝莲提取物黄酮类化合物A06由扬州大学医学院中医药实验室提供; 成纤维生长因子(bFGF)和Matrigel分别购自Sigma和BD公司; 人VEGF的ELISA试剂盒购自武汉博士德公司; NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所; Annexin-Ⅴ联合PI双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司. 将A06用二甲基亚砜(DMSO)、M199及DMEM培养基配置成1 g/L的母液, 抽滤后-20℃保存, 实验当天取出稀释成实验所需浓度. HUVEC和Hela细胞均在孵箱中常规培养, 以胰蛋白酶消化后进行传代, 取对数生长期细胞用于实验. 在预实验中通过MTT比色法确定半枝莲提取物A06的IC10为104.08 mg/L, 选择与IC10接近的整数浓度并倍数递减作为实验的浓度.
1.2.1 内皮细胞小管形成实验: 将24孔板每孔加预先置4℃过夜的Matrigel 300 μL, 在37℃, 50 mL/L CO2培养箱中聚合1 h, 将HUVEC用胰酶消化后用培养液调为2×108/L浓度的细胞悬液, 并添加10 μg/L bFGF和分别25, 50, 100 mg/L的A06, 另设空白组(孔内加细胞不加药)和溶媒对照组(培养液中含有0.1 g/L DMSO), 混匀放入37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养6 h后在100倍Olympus倒置显微镜下观察小管形成的情况, 每孔取5个视野计数小管形成数, 取平均值.
1.2.2 内皮细胞迁移实验: 将内皮细胞消化后以1×108/L种入24孔板, 在培养基中加入A06, 药物终浓度为25, 50, 100 mg/L, 终体积2 mL, 并设阴性对照组和溶媒对照组共5组. 37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h后消化, 并用无血清M199培养基调整密度为1×108/L. 在Transwell上室的聚碳酸脂膜上加入3 mg/L的Matrigel 20 μL, 37℃聚合30 min, 在Transwell的下室加入600 μL Hela细胞条件培养液, 同时上室分别种入用无血清M199稀释的内皮细胞, 每孔100 μL. 培养18 h后取出小室, 用棉签拭去滤膜上层未迁移的内皮细胞, 固定, 染色, 用刀片取下滤膜, 中性树脂固定于载玻片上, 在显微镜下随机计数中间和周围共5个视野细胞数, 各组计数4个样本, 求出平均值.
1.2.3 对Hela细胞VEGF和NO表达的影响: 将Hela细胞消化后以3×108/L种植6孔板, 培养24 h后, 用PBS清洗2次, 加入100 mL/L NBS的DMEM培养基和药物, 终浓度为25, 50, 100 mg/L, 终体积2 mL. 37℃, 50 mL/L CO2培养箱中分别培养24和48 h后收集培养上清, 12 000 g离心10 min, 取上清0.22 μm滤膜抽滤后, 用ELISA和NO试剂盒测定上清中VEGF和NO含量.
统计学处理 采用SPSS10.0统计软件分析, 实验结果以mean±SD表示, 行方差分析和t检验.
低浓度(25 mg/L)A06作用后对小管形成数无明显影响. 当A06浓度达到50 mg/L时对小管形成有明显影响, 不仅小管数目减少, 而且管腔不完整, 与空白组相比有差异(P<0.05), 浓度达到100 mg/L时, 很少有完整小管形成(表1, 图1). HUVEC经50, 100 mg/L A06作用后, 内皮细胞的迁移数明显减少(P<0.01)且迁移的内皮细胞数随着A06浓度的增加而减少(表1, 图2).
A06作用24, 48 h后能抑制Hela细胞VEGF的表达(P<0.01), 但是作用24 h后各组之间比较没有差异, 作用48 h后, 中、高浓度组(50, 100 mg/L)之间比较有差异, 且经中、高浓度组作用后的Hela细胞VEGF表达24和48 h之间比较有差异(P<0.05). 50, 100 mg/L A06作用细胞24 h后能明显抑制肿瘤细胞的NO的表达, 具有显著差异(P<0.01), 且各浓度组之间比较有差异; 作用48 h后各浓度均能抑制Hela细胞NO的表达, 有显著差异(P<0.01). 各组同一浓度体系, 24与48 h相比在50, 100 mg/L时对NO表达影响具有显著差异(P<0.01), 其他浓度相比没有显著差异(表2).
血管生成是指从组织中既存的成熟血管形成新的毛细血管网络的过程. 1970年代, Folkman et al[4-6]通过一系列实验证实了实体瘤的生长必需要有血管供应, 并提出了实体瘤生长时相(无血管期和血管期)的概念和血管生成开关机制学说. 大量实验证明, 多种肿瘤的生成、转移、复发和预后均与肿瘤血管生成密切相关, 与传统的肿瘤治疗相比, 抗肿瘤血管生成治疗的最大特点在于他不但具有良好的特异性, 而且克服了药物达到肿瘤组织的不足和肿瘤耐药性等问题. 因此, 以肿瘤血管生成为靶点开发血管生成抑制剂, 在抗肿瘤研究中形成了一个新的十分活跃的研究领域.
VEGF是在促进肿瘤血管生成中起主要作用的细胞因子, 促肿瘤血管生成的其他因子如人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF), 血小板源性生长因子(PDGF), 肿瘤坏死因子α(TNF-α), 表皮生长因子(EGF)等, 这些生长因子其作用主要通过诱导VEGF表达实现促进肿瘤生长、浸润和转移的作用. 另外部分癌基因和抑癌基因也影响VEGF的表达, 如野生型p53能够抑制VEGF的表达, 而p53突变或缺失则通过引起VEGF的上调, 促进肿瘤血管生成; c-fos蛋白等也是通过上调VEGF的蛋白表达来促进肿瘤生长的. 此外, 在肿瘤生长过程中NO也起到重要的作用. Chin et al[7]报道VEGF与其受体结合可增加细胞内NO的生成. 而NO又可促进VEGF的表达, 并增进其血管通透和扩血管作用, 从而起到促进肿瘤血管生成的作用.
传统中药有着几千年的实际应用经验, 因而从中寻找新药和先导化合物有着更高的命中率, 特别是与现代分子生物学的进展结合起来, 有着良好的应用前景. 近年来对中药在血管生成抑制方面的研究逐渐兴起, 如姜黄素能抑制CAM血管生成, 并能诱导肿瘤细胞凋亡[8]; 人参皂甙Rg3可通过下调肿瘤VEGF的mRNA及蛋白的表达量来抑制肿瘤生长和转移[9]; 薏苡仁注射液能抑制大鼠动脉环上的新生血管生成, 加快血管进入衰退期[10]等. 半枝莲是传统的活血化瘀类中药, 临床上常用于治疗肺癌, 消化系统癌症, 乳腺癌等, 取得较好的疗效, 但是其作用机制鲜见相关报道. 我们将半枝莲提取出的黄酮类化合物A06作用于HUVEC及肿瘤细胞中, 观察半枝莲黄酮类化合物A06对内皮细胞迁移、形成小管样结构的影响, 并观察了A06对于肿瘤细胞分泌血管生成相关因子VEGF和NO的影响, 初步探讨其抑制血管生成的机制. 研究结果表明, 半枝莲黄酮类化合物A06能抑制内皮细胞小管样结构形成和肿瘤细胞条件培养液刺激下的内皮细胞迁移, 实验表明其作用机制可能与A06能抑制肿瘤细胞分泌VEGF, NO这些血管生成促进因子有关, 为进一步探讨半枝莲在肿瘤治疗方面的前景奠定基础, 使后期实验有据可依.
尽管中药在抑制肿瘤血管生成方面的研究工作起步较晚, 在具体机制等方面的研究与已进入临床实验的西药相比也有一定的差距, 但中药的毒副作用较小, 且有一定程度的辅助治疗作用(调节机体的免疫功能等), 相信随着研究的深入, 中药半枝莲的抗肿瘤血管生成作用将会逐渐受到重视, 其作用机制也会不断的被挖掘出来.
临床上半枝莲是具有清热解毒、散瘀活血作用的常用中药, 在抗癌方中常配伍使用, 但对其抗肿瘤有效成分及作用机制, 目前仍缺乏清楚的认识. 本文从抗肿瘤血管生成的的角度出发, 研究了半枝莲中的 黄酮类化合物对血管内皮细胞迁移、形成管样结构及对肿瘤细胞分泌血管生成相关因子的影响.
血管生成是近年来研究抗肿瘤方面的热门项目, 肿瘤生长需要血管供应营养, 因此阻断肿瘤血管生成, 切断肿瘤组织获得营养的途径已经成为新的抗肿瘤治疗的靶点而且也成为抗肿瘤治疗中热门的研究内容.
半枝莲临床上多用于治疗肝癌、肺癌等, 许多报道表明半枝莲提取物能够抑制多种肿瘤细胞如S180、W256等的生长, 其提取出的生物碱和黄酮类的一些化合物具有促进细胞免疫、抗病毒、抗肿瘤的作用.
目前对于中药抗肿瘤作用的研究多停留在粗提物的水平, 缺乏对其确切成分和抗癌机制的深入研究, 本文采用半枝莲提取出的黄酮类化合物在研究抗血管生成的环节上进行深入, 研究了药物对于血管生成的一系列过程, 包括细胞迁移, 形成管样结构的影响, 以及产生这些影响的可能机制, 具有一定的新意.
本研究发现半枝莲黄酮类化合物 A06 能够抑制内皮细胞迁移和小管样结构形成, 实验表明其作用机制可能与A06 能抑制肿瘤细胞分泌VEGF、NO这些血管生成促进因子有关, 这将为进一步探讨半枝莲在肿瘤治疗方面的作用提供重要的实验依据, 使后期实验有据可依.
本文就中药半枝莲提出物黄酮类化合物A06 对体外肿瘤血管生成的影响进行研究, 课题的切入点新颖, 对进一步阐明中药对肿瘤的作用机制有一定的意义.
编辑:程剑侠 电编:张敏
| 4. | Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheu-matoid and other disease. Nat Med. 1995;1:27-31. [PubMed] |
| 5. | Folkman J. Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Clinical applications of research on angiogenesis. N Engl J Med. 1995;333:1757-1763. [PubMed] |
| 6. | Thompson WD, Li WW, Maragoudakis M. The clinical manipulation of angiogenesis: pathology, side-effects, surprises, and opportunities with novel human therapies. J Pathol. 2000;190:330-337. [PubMed] |