CHFR基因与消化道肿瘤关系的研究进展

摘要

CHFR (checkpoint with FHA and ring finger), 一种在人类癌症中灭活的新的细胞周期检查点基因, 在有丝分裂应激时, 延迟染色体的浓集、阻止细胞进入有丝分裂中前期. 研究表明, CHFR在爪蟾中是Plk1的泛素连接酶, 在哺乳动物细胞中主要通过抑制Cyclin B1进入细胞核、调节Aurora-A的水平及与P38应激激酶相互作用, 阻止细胞进入有丝分裂前期. USP7介导的CHFR去泛素化致其累积可能对于CHFR激活是一个关键的调节步骤. 在消化道肿瘤中, CHFR表达由于CPG岛甲基化而沉默. 本文对CHFR基因的结构、编码蛋白的功能及其与消化道肿瘤关系的研究进展作一综述.

关键词: 有丝分裂前期; 细胞周期检查点; CHFR基因; 消化道肿瘤

Advance in the relationship between checkpoint with fork head associated and ring finger gene and carcinomas of digestive tract

Yu-Jia Gao, Yan Xin

Yu-Jia Gao, Doctor from China Medical University, the Sixth Department of Internal Medicine, Cancer Hospital of Liaoning Province, Shenyang 110042, Liaoning Province, China

Yan Xin, the Fourth Laboratory of Cancer Institute, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shengyang 110001, Liaoning Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30371607, and the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Education Ministry, No. 20040159021.

Correspondence to: Professor Yan Xin, the Fourth Laboratory of Cancer Institute, the First Affiliated Hospital, China Medical University, 155 Nanjing North Street, Heping District, Shengyang 110001, Liaoning Province, China. yxin@mail.cum.edu.cn

Received: April 1, 2007
Revised: April 10, 2007
Accepted: April 13, 2007
Published online: May 28, 2007

Abstract

CHFR (checkpoint with fork head associated and ring finger), a novel checkpoint gene, was frequently inactivated in human cancers. In response to mitotic stress, it causes a delay in chromosome condensation during prophase. Studies have showed that the direct target of the CHFR pathway was Plk1. In vitro-translated Plk1 is ubiquitinated, in a CHFR-dependent manner, both in Xenopus interphase extracts as well as in a purified system reconstituted with recombinant proteins. In addition, by excluding Cyclin B1 from the nucleus, regulating Aurora-A level and acting with the P38 stress kinases, CHFR blocks entry to mitosis prophase in mammalian cells. Besides, USP7 can remove ubiquitin moiety from the autoubiquitinated CHFR both in vivo and in vitro, which results in the accumulation of CHFR in the cells. Thus, USP7-mediated deubiquitination of CHFR leads to its accumulation, which might be a key regulatory step for CHFR activation. CHFR expression is frequently silenced by aberrant methylation in the carcinomas of digestive tract. In this article, we reviewed the progress of research on the structure of CHFR gene and effect of CHFR protein as well as its relation to the carcinomas of digestive tract.

Key Words: Mitosis prophase; Cell cycle checkpoint; Checkpoint with fork head associated and ring finger gene; Carcinoma of digestive tract

0 引言

在真核细胞周期的演进中存在一些关键过渡点, 当其受到外界压力时会限制细胞周期转变,被称为细胞周期检查点(cell cycle checkpoints). CHFR是一个新的有丝分裂前期检查点基因, 微管抑制剂诱发有丝分裂应激时, CHFR延迟染色体凝集、阻止细胞由有丝分裂早前期进入中前期, 增强细胞对应激的生存能力[1]. 研究证实, CHFR基因在人正常组织中普遍表达, 而在人肿瘤组织中表达缺失[2-4], CHFR的异常甲基化是导致其转录沉默的主要原因. 这与肿瘤密切相关[5-6]. 本文对CHFR的作用机制及其与消化道肿瘤发生之间关系的研究进展作一综述.

1 CHFR基因的定位和结构

CHFR基因定位在染色体12q24.3, 其编码产物为664个氨基酸的蛋白质, 含3个结构域: N-端有叉头相关(forkhead-associated, FHA)区和环指(ring finger, RF)区, 羧基端有半胱氨酸富集区(cysteine-rich, CR). 根据诱变分析, FHA和CR区对检查点功能是必需的. 许多包含FHA区的蛋白质是细胞周期检查点, 因此命名为CHFR (checkpoint with FHA and ring finger). CHFR的FHA区能识别并结合磷酸化蛋白质[7-9]. 他在中心体附近并影响微管结合[10]. RF区对有丝分裂检查点的活性和泛素化底物如Plk1和CHFR本身是至关重要的.

2 CHFR蛋白的功能及作用机制

2.1 CHFR是Plk1的泛素连接酶和有丝分裂应激激活通路

在有丝分裂应激存在时, CHFR是一种延迟进入有丝分裂期所需的检查点蛋白. 他是一种在有丝分裂早前期到中前期过渡时调控Cdc2激酶活性的泛素化连接酶. 在爪蟾中Plk1以CHFR依赖的方式泛素化, 在一个纯化和重构的体系中, CHFR能直接泛素化和降解Plk1, 导致Cdc25磷酸酶活性下调及Weel激酶活性上调. 因此, CHFR定义为一种新的调控进入有丝分裂期的依赖泛素化的蛋白质水解通路[11]. 早期起始有丝分裂事件, 包括核膜破裂和染色体凝集, 需要有丝分裂激酶的激活, 如Cdc2/Cyclin B. CHFR可能通过控制Cdc2/Cyclin B的底物来调节核膜破裂和染色体凝集. CHFR的FHA区能使蛋白磷酸化, 因此, 蛋白激酶可能充当他的上游并调节他的活性[12-14].

2.2 CHFR有丝分裂检查点蛋白从细胞核中除外Cyclin B1延迟细胞周期进程

Summers et al[15]进行了CHFR对人体细胞影响的研究, 其结果表明CHFR通过保持Aurora-A, Aurora-B, Plk1和Cyclin B1/cdc2灭活, 抑制Cyclin B1进入细胞核使细胞延迟在细胞分裂早前期. 在CHFR延迟的细胞中低Cyclin B1/cdc2活性的分子基础可能归因于细胞质的隔绝Cyclin B1. 通过免疫印迹分析, 在将会显示CHFR直接泛素化Cyclin B1的CHFR延迟的细胞中没观察到Cyclin B1水平或电泳迁移的变化. CHFR很可能间接调节Cyclin B1. 并且Cyclin B1有核定位和核输出顺序, 接近核输出顺序的丝氨酸126, 128, 133和147的磷酸化导致Cyclin B1在细胞核中的累积. 观察还发现, CHFR表达不影响Plk1, Aurora-A的总体蛋白水平或他们在中心体的免疫荧光. 因此, Plk1, Aurora-A均不是CHFR降解的靶目标. CHFR蛋白的直接靶分子仍不清楚.

2.3 CHFR

CHFR是肿瘤抑制基因并调节Aurora-A Yu et al[16]制作了敲除CHFR的鼠, 监测了一段时间肿瘤发生率, CHFR+/-鼠肿瘤发生率是介于CHFR+/+和CHFR-/-之间的发生率. 在CHFR-/-鼠中较高的死亡率和肿瘤发生率表明CHFR是重要的肿瘤抑制基因. CHFR在体内与Aurora-A相互作用并在体内外泛素化Aurora-A. 另外, 发现Aurora-A的降低表达, 不是Plk1的表达, 减少了在CHFR-/-MEFs中的非整倍体和多核细胞数, 表明Aurora-A在控制有丝分裂中是CHFR的关键的下游成分. 很明显, Aurora-A和Plk1的下调在阻止CHFR-/-MEFs染色体不稳定方面是更有效的, 因此推断为确保正常有丝分裂进程Aurora-A和Plk1可能共同起作用.

2.4 在哺乳动物细胞中, CHFR与P38应激激酶相互作用阻止进入有丝分裂期

Matsusaka et al[17]研究表明CHFR蛋白是在哺乳动物细胞中预前期检查点的一个重要成份, 并且P38应激激酶似乎是这个检查点的下游效应物. 作为检查点机制的部分, CHFR要求他的泛素连接酶活性, 但他的底物不需被蛋白酶体降解. 在微管毒素存在的条件下, 这个预前期检查点主要由P38应激激酶所介导并且需要CHFR蛋白. P38α和β激酶抑制剂能废除预前期检查点并且一个P38α激酶的活化形式能返回早前期细胞到间歇期.

2.5 由USP7/HAUSP所致的CHFR去泛素化调节其稳定性和活性

Oh et al[18]鉴定了USP7(也被称为HAUSP), 一种分解多聚泛素链和/或泛素前体并能与CHFR相互作用的蛋白. 他在体内外能去除自动泛素的CHFR的泛素部分. 导致CHFR在细胞内的积累. 这一研究结果表明USP7介导的CHFR去泛素化致其累积可能对于CHFR激活是一个关键的调节步骤, 并且在CHFR介导的细胞周期进程和肿瘤抑制的调解方面可能发挥着重要作用.

3 CHFR在消化道肿瘤中的表达及特点

3.1 食管癌

Shibata et al[4]的研究表明15个食管癌细胞株中的4个(26.7%)和43例原发癌中的7例(16.3%)CHFR检测点基因启动区的异常超甲基化. 因用甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理后诱导CHFR基因表达的恢复, 表明CHFR启动区的异常甲基化与mRNA表达丢失密切相关. Hamilton et al[19]的研究发现CHFR被甲基化在对食管癌放化疗没反应的患者中占32%, 但在有反应的患者中只有8%, 这种甲基化的差异很可能是由于灭活CHFR的肿瘤细胞使细胞增殖失调, 变得较难被放化疗的毒素作用杀灭所致.

3.2 胃癌

已有研究发现, CHFR在人正常组织中普遍表达, 而在人肿瘤组织中表达缺失. Kang et al[20]用RT-PCR、重亚硫酸盐PCR和序列分析方法对人胃癌细胞株和原发胃癌组织中CHFR的甲基化状态及CHFR表达进行了研究, 发现在12个胃癌细胞株中的8例(66.7%)和43例原发性胃癌中的19例(44.2%)显示CHFR甲基化, 而正常组织中没有检出CHFR甲基化, 表明CHFR甲基化在人胃癌中是频发事件. 有CHFR甲基化的胃癌细胞株显示其mRNA表达下调或缺失. 在几个胃癌细胞株中被抑制的CHFR表达经5-aza-dc处理后可恢复. 联合5-aza-dc和TSA, 可协同提高CHFR的表达, 提示CHFR表达的丟失是由DNA甲基化改变和组蛋白脱乙酰作用所调节. 此外发现TSA独自并不足以诱导CHFR表达, 表明异常甲基化是导致CHFR转录沉默的主要原因. Milne et al[21]研究结果显示, 在174例胃癌中CHFR蛋白表达缺失率为33%, 且弥漫型胃癌表达缺失率显著高于肠型胃癌(P = 0.001). Morioka et al[22]研究发现, 53例胃癌中出现CHFR基因异常甲基化16例(30%), 而正常组织中没有检测到异常甲基化. Koga et al[23]发现, 9个胃癌细胞株中有3个启动子异常甲基化致CHFR表达沉默. CHFR mRNA的表达水平与用微管抑制剂作用的胃癌细胞系的50%抑制浓度密切相关, R = 0.889, P = 0.005. 并且, 在46例胃癌患者中, 24例(52%)呈现CHFR异常甲基化, 有CHFR甲基化的患者对微管抑制剂治疗有反应的为7例(占29%), 其中6例(86%)显示一些消退或不进展, 而没有CHFR甲基化的5例肿瘤患者中有4例(80%)显示进展恶化, 提示CHFR甲基化有望在临床上作为一个预测微管抑制剂治疗效果的新标志物. 但Yoshida et al[24]发现, 41例胃癌标本中15例(36.6%)显示CHFR的DNA甲基化. 在单独用泰素治疗的12例患者中, CHFR的甲基化状态与对泰素的反应没有联系. 有CHFR甲基化的5例患者中, 仅1例(20.0%)对泰素治疗显示部分缓解(PR), 而没有甲基化的7例患者中3例(42.9%)显示PR. 在29例用多西他赛和S-1联合治疗的患者中, CHFR甲基化状态与对联合治疗的反应没有明确的联系. 其中19例显示PR, 然而哪个抗肿瘤药物有效并不清楚. 而在无效的10例患者中, 有CHFR甲基化, 这被认为是与对多西他赛高度敏感有关, 在10例患者中6例(60%)被检测到. 结果表明CHFR的DNA甲基化状态在胃癌中对预测多西他赛或泰素的反应不是一个好的标志物. 其与以前研究结果不一致的原因可能是: (1)Satoh et al[25]检测CHFR是在胃癌细胞株中; (2)他们在原发胃癌中调查CHFR甲基化, 但在许多病例的转移灶中对化疗的反应进行了评估. 在转移胃癌病变中, CHFR可能被再次活化. 12例单独用泰素治疗的患者中4例达PR, 其中3例没有DNA甲基化占75%, 这表明即使CHFR被表达, 泰素也是有效的. Homma et al[26]观察发现 CHFR超甲基化在L-NIN中比H-NIN的频率低(P<0.05). CHFR甲基化和hMLH1甲基化同时发生(P<0.01); CHFR和hMLH1二者的超甲基化与年龄显著相关. CHFR超甲基化在小凹型和普通型胃肿瘤中分别占50%(2/4)、40%(40/16), 而在肠化生型胃肿瘤中占0%(0/8). 胃癌发生的分子通路取决于组织的背景, 并且由于先天和后天改变, 胃癌显示了不同的生物学行为[27]. 总之, 研究表明尽管CHFR甲基化与CIN没有联系, 但某些小凹型和普通型的胃肿瘤是由于在正常的胃黏膜或不完全的肠化生黏膜中与老年人有关的CHFR和hMLH1超甲基化的产生.

3.3 大肠癌

Bertholon et al[28]报道, 21个结肠癌细胞株中有12个(57%)显示CHFR表达完全缺失. 22例原发性结肠癌中有8例(36%)可检测到CHFR基因启动子区CpG岛异常甲基化, 提示CHFR基因异常甲基化和表达缺失在结肠癌中是频发事件. Derks et al[29]观察发现在18例结直肠癌中CHFR基因异常甲基化占55.6%, CHFR的启动子甲基化与许多染色体异常不相关. Brandes et al[30]报道, 在61例原发性结肠癌标本中, 19例(31%)可检出CHFR启动子异常甲基化. 此外, MSI表型阳性的大肠癌细胞株均伴有CHFR基因启动子甲基化. Hibi et al[31]观察了58例人结直肠癌组织CHFR基因的甲基化状态. 发现25例(43.1%)显示CHFR基因异常甲基化, 且低分化结直肠癌CHFR基因甲基化检出率较高分化结直肠癌多见(P = 0.0041). Morioka et al[32]研究发现, 在98例原发性结直肠癌中25例(26%)显示CHFR基因异常甲基化. 且早期结直肠癌CHFR甲基化出现率(30.7%, 23/75)显著高于进展期(8.7%, 2/23)(P = 0.035), 提示CHFR可能至少与部分结直肠癌的发生有关, CHFR甲基化可能是结直肠癌发生、发展早期阶段的一种特殊现象.

3.4 肝癌、胆管癌和胰腺癌

Sakai et al[33]研究发现, 在原发性肝癌中35%(22/62)发现CHFR基因启动子甲基化, 而在对应的正常肝组织中没有发现, 提示CHFR甲基化在肝细胞癌中是一个频繁的事件. 另外, CHFR的甲基化与肝细胞癌侵袭性的生长模式(P = 0.047)和临床病理分期(P = 0.037)显著相关. CHFR甲基化状态可能是一个新的评估肝细胞癌恶性程度的分子标志物. Tozawa et al[34]报道, 在原发性胆管癌中CHFR甲基化频率为16.2%(6/37). Takahashi et al[35]检测了胆囊癌中24个已知或怀疑为抑癌基因的异常甲基化状况, 发现其甲基化频率为0%-80%, 其中CHFR甲基化属低频率组(2%-14%). 迄今关于CHFR基因异常甲基化与胰腺癌发生、发展的关系尚未见报道.

4 结语

有丝分裂前期检查点基因CHFR是一个抑癌基因, 在消化道肿瘤发生过程中由于频繁甲基化导致CHFR mRNA表达沉默, 对细胞周期的正常调控功能失活, 最终导致肿瘤发生. 迄今尽管在阐释CHFR基因表达的调控机制、明确其泛素连接酶活性的下游靶目标等方面的研究已取得很大进步, 但这些发现的生物学意义还需进一步深入探讨. CHFR基因甲基化可作为消化道肿瘤早期诊断、判断肿瘤对化疗药物反应的新分子标志物. CHFR基因为进行抗肿瘤药物联用和寻找特异性甲基化酶抑制剂等肿瘤治疗研究提示了新的方向.

评论

背景资料

CHFR是一个新的有丝分裂前期检查点基因. 有丝分裂应激时, 延迟染色体凝集、在爪蟾中是Plk1的泛素连接酶, 在哺乳动物细胞中, 通过抑制Cyclin B₁进入细胞核、调节Aurora-A的水平及与P38应激激酶相互作用, 阻止细胞进入有丝分裂前期. 在消化道肿瘤中, CHFR mRNA表达由于CpG岛甲基化而沉默.

同行评价

本文通过对CHFR基因与消化道肿瘤的关系进行综述, 收集了大量理论依据来阐述CHFR基因的结构、CHFR蛋白的功能及其与消化道肿瘤的关系, 立题新颖, 是一篇很好的综述.

备注

电编:张敏 编辑:程剑侠

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