修回日期: 2007-04-15
接受日期: 2007-04-18
在线出版日期: 2007-05-18
目的: 检测Th1类细胞因子IL-12, IFN-γ在溃疡性结肠炎(UC)中的表达, 从分子水平上探讨UC的发病机制.
方法: 选取通过结肠镜诊断并经病理证实的患者UC 30例, 正常对照者20例.用RT-PCR方法检测Th1类细胞因子IFN-γ和IL-12 mRNA表达, 用双抗体夹心ELISA法检测血清IL-12, IFN-γ的水平.
结果: UC组(轻、中、重度)IL-12 mRNA表达较正常对照组显著增加(0.51±0.09, 0.59±0.07, 0.66±0.06 vs 0.25±0.03, P<0.05), 而IFN-γ与正常对照组相比, 表达无显著差异(P>0.05). UC组和正常对照组IL-12的血清浓度差异没有显著性(P>0.05), IFN-γ未达到可检测浓度.
结论: IL-12在UC的发病中可能起重要作用
引文著录: 庞艳华, 郝建宇, 关玉盘, 郑长青, 张文杰. 溃疡性结肠炎患者Th1类细胞因子的表达. 世界华人消化杂志 2007; 15(14): 1665-1667
Revised: April 15, 2007
Accepted: April 18, 2007
Published online: May 18, 2007
AIM: To explore the expression of Th1 type cytokines, interleukin-12 (IL-12) and interferon-γ (IFN-γ ), in ulcerative colitis (UC), and to investigate the mechanism of UC at molecular level.
METHODS: Thirty UC patients diagnosed with colonoscopy and mucosal biopsy were enrolled in this study and 20 healthy volunteers were used as controls. IL-12 and IFN-γ mRNA expression were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The serum levels of IL-12 and IFN-γ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
RESULTS: The expression of IL-12 mRNA in UC patients (light, moderate and severe degree) was significant higher than that in controls (0.51 ± 0.09, 0.59 ± 0.07, 0.66 ± 0.06 vs 0.25 ± 0.03, P < 0.05), but no difference was found in IFN-γ mRNA expression between the two groups. The level of serum IL-12 was not markedly different between UC patients and controls (P > 0.05), while IFN-γ were not detectable in both groups.
CONCLUSION: IL-12 may play an important role in the pathogenesis of UC.
- Citation: Pang YH, Hao JY, Guan YP, Zheng CQ, Zhang WJ. Expression of Th1 type cytokines in patients with ulcerative colitis. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 15(14): 1665-1667
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v15/i14/1665.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v15.i14.1665
免疫反应异常在溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)的发病中起重要作用. CD4+T细胞是免疫应答的重要效应细胞, 分为Th1和Th2细胞, Th1细胞表达γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)和肿瘤坏死因子β(tumor necrosis factor-β, TNFβ), 而Th2细胞表达IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10和IL-13[1-2]. 一般而言, Th1细胞因子有促炎作用, 而Th2细胞因子则发挥抗炎作用. 在对UC的免疫学发病机制研究中, 研究者们意见不一. Lakatos[3]认为UC与Th2细胞密切相关, Sawa et al[4]认为UC是Th1和Th2共同作用的结果. UC究竟与Th1或Th2何者更为密切相关还有待研究.我们检测了UC患者结肠黏膜和外周血中Th1类细胞因子IL-12, IFN-γ的表达, 旨在探讨UC的发病机制.
UC患者30例, 经结肠镜检查确诊并经病理证实, 诊断符合2000年成都会议标准[5], 年龄26-69岁. 正常对照组20例, 年龄25-51岁. 取每例患者直肠或乙状结肠部位的活检组织, 置于液氮罐中, 每例抽取全静脉血5 mL, 离心取血清, 均置于-70℃保存备用. 所有引物上海博亚生物技术有限公司合成, ELISA试剂盒购于上海森雄实业有限公司.
1.2.1 提取组织RNA, 用反转录法合成cDNA, RT-PCR法检测IL-12和IFN-γ的表达: PCR反应体系为50 μL, 含cDNA模板2 μL、PCR缓冲液5 μL、50 mol/L dNTP混合物、10 μmol/L上下游引物和Taq DNA聚合酶0.5 μL. PCR反应参数为 94℃ 5 min , 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共30个循环. 72℃延伸10 min, 4℃终止反应. 取5 μL PCR扩增产物以12 g/L琼脂糖进行凝胶电泳, 用图像分析仪进行分析.
1.2.2 采用双抗体夹心ELISA法测血清IL-12和IFN-γ的水平: 具体检测程序如下: 建立标准曲线: 设标准孔8孔, 每孔中各加入样品稀释液100 μL, 第1孔加入标准样品100 μL, 混匀后用加样器吸出100 μL, 移至第2孔. 如此反复作对倍稀释至第7孔, 最后, 从第7孔中吸出100 μL弃去, 使之体积均为100 μL. 第8孔为空白对照. 加样: 待测样品孔中每孔各加入样品稀释液及待测样品各50 μL. 将反应板置37℃ 2 h. 洗板: 用洗涤液将反应板充分洗涤4次, 在滤纸上印干. 每孔中加入第一抗体工作液50 μL. 将反应板充分混匀后置37℃ 1 h, 洗板.每孔加酶标抗体工作液100 μL. 将反应板置37℃1 h, 洗板.每孔加入底物工作液100 μL, 置37℃暗处反应5-10 min. 每孔加入1滴终止液混匀. 在492 nm处测吸光值A492. 用标准物浓度与A492值计算出标准曲线的直线回归方程, 将样品的A492值代入方程式求出样品浓度.
统计学处理: 采用单因素方差分析, 用SPSS10.0统计软件分析, P<0.05为差异有显著性.
UC组IL-12的表达较正常对照组增加(P<0.05), 而IFN-γ与正常对照组相比, 差异无显著性(P>0.05), IL-12和IFN-γ在轻中重度UC中差异都无显著性(P>0.05, 表1).
UC组和正常对照组, IL-12的浓度分别为23.32±7.86 ng/L和27.97±10.75 ng/L, 两者差异没有显著性(P>0.05). IFN-γ在两组中都未达到可检测浓度.
在正常状态下, 体内的Th1和Th2处于动态平衡, 两者相互制约, 从而维持机体内环境的稳定. 如果由于某种原因导致Th1/Th2失衡, 比如Th1反应亢进或Th2反应减弱, 组织器官就可能发生炎症. IL-12是细胞免疫中非常重要的因子[6], 由活化的单核-巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞产生, 能促进Th1细胞的分化和增殖, IL-12还可刺激自然杀伤细胞(NK细胞)和T细胞产生包括IFN-γ在内的多种细胞因子. IL-12和IFN-γ作为前炎症因子都对Th1反应提供了重要信号. 我们的实验结果表明UC组肠黏膜IL-12 mRNA的表达较正常对照组增加, 这与Nielsen et al[7]的研究结果一致, 说明IL-12参与了UC的发病. IFN-γ主要由T细胞和NK细胞产生, 有广泛的免疫调节作用, Th1是产生IFN-γ的主要细胞. IFN-γ主要通过两种途经促进Th1分化: (1)通过阻止Th2的分化而使Th1的分化占优势; (2)在抗原致敏过程中, IFN-γ和IL-12直接调节Th1的分化[8]. Stevceva et al[9]用类似人类UC的IL-4缺乏小鼠模型检测IFN-γ, 认为IFN-γ在急性炎症结肠组织的含量高. Camoglio et al[10]用免疫组化法检测UC患者IFN-γ和IL-4的表达, 结果二者均未有显著性升高. Watanabe et al[11]Northern杂交及定量PCR法在CD组织中检测到IFN-γ, 而未受刺激的自身外周血单核细胞(PBMC)、正常对照及炎症对照组肠黏膜固有层单个核细胞(LPMC)未能检出IFN-γ. 对于IFN-γ在Th1细胞的发展中是否必需这个问题一直有争论. Bot et al[12]发现在完全缺乏IL-4时, T细胞在IL-12存在的情况下开始向Th1分化, 此时不需要IFN-γ. 我们的实验结果提示IFN-γ在UC的发病中的作用不明显, IL-12可能在IFN-γ不升高的情况下诱导了Th1细胞.
近年来, 对Th细胞的研究进展迅速, 人们已经认识到细胞因子、T细胞受体、转录因子等共同调节着Th1/Th2分化方向. 但是, Th1/Th2整个通路的调节是很复杂的过程, 对整个通路的初始调节和最重要的调节以及对UC免疫机制的最终阐明都有待进一步研究.
Th细胞的研究近来进展迅速, 而有研究发现免疫反应异常在溃疡性结肠炎的发病中起重要作用, 主要效应细胞为Th1和Th2细胞, 关于他们的具体作用, 研究者意见不一.
本文研究思路清晰, 结合分子水平来研究临床疾病, 对进一步探讨UC的发病机制有很大意义.
电编:郭海丽 编辑:程剑侠
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10. | Camoglio L, Te Velde AA, Tigges AJ, Das PK, Van Deventer SJ. Altered expression of interferon-gamma and interleukin-4 in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 1998;4:285-290. [PubMed] |
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