修回日期: 2007-02-10
接受日期: 2007-03-06
在线出版日期: 2007-04-28
目的: 利用正常肝细胞和肝癌细胞表面转铁蛋白受体以及亲和力的差异, 用转铁蛋白修饰脂质体, 使脂质体具有导向肝癌细胞的靶向性, 分析其对肝癌细胞系的杀伤作用.
方法: 超声法制备阿霉素脂质体, 暴露脂质体上的巯基, 然后用双功能交联剂N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)交联HTf(Fe)2和脂质体, 制备成HTf(Fe)2-阿霉素脂质体. 用MTT法分析HTf(Fe)2-阿霉素脂质体对人肝癌细胞系SMMC-7721的杀伤力.
结果: 实验检测HTf(Fe)2与脂质体的交联率为73.5%, 电镜观察修饰后的脂质体呈单层状, 平均直径56±38 nm, 未用HTf(Fe)2修饰的脂质体直径平均为54±30 nm, 两者无显著差异. SPDP修饰和脂质体交联不影响HTf(Fe)2的活力. MTT法分析发现, 当浓度为0.10 mg/L时HTf(Fe)2阿霉素脂质体、无HTf(Fe)2阿霉素脂质体及游离阿霉素对肝癌细胞的杀伤率分别为64.52%, 22.12%和37.82%, 前一组与后两组之间有显著差异(P<0.05).
结论: HTf(Fe)2阿霉素脂质体体外杀伤肝癌细胞系SMMc-7721具有用药量小、高效、特异性强等优点, 为体内应用治疗肝癌提供了实验依据.
引文著录: 秦历杰, 刘占举. 转铁蛋白阿霉素脂质体的制备及其对人肝癌细胞系的杀伤活性. 世界华人消化杂志 2007; 15(12): 1441-1445
Revised: February 10, 2007
Accepted: March 6, 2007
Published online: April 28, 2007
AIM: To modify the adriamycin (ADM) liposome with transferrin HTf(Fe)2 according to the difference of receptor or antigen expression between tumor cells and normal cells, and study its efficacy of anti-tumor activities on human hepatoma cell line SMMC-7721.
METHODS: Cross-linking reagent (SPDP) reacting with human transferrin HTf(Fe)2 was utilized, and liposomes coupled with transferrin [named as HTf(Fe)2-ADM-liposome] were prepared. Then human hepatoma cell line SMMC-7721 was treated with different concentrations of HTf(Fe)2-ADM-liposome and MTT assay was used to the killing effect on SMMC-7721 cells.
RESULTS: The success rate of HTf(Fe)2 coupling with liposomes was 73.5%. Electron microscopy showed no significant difference in the diameters between HTf(Fe)2-ADM-liposome and ADM-liposome (56 ± 38 nm vs 54 ± 30 nm, P < 0.05). Modification and coupling didn't affect the activity of HTf(Fe)2. The specific cytotoxicities of HTf(Fe)2-ADM-liposome, ADM-liposome and free ADM on SMMC-7721 cells were 64.52%, 22.12% and 37.82%, respectively, and there were marked difference between the former and the latter two (P < 0.05).
CONCLUSION: The anti-tumor activity of HTf(Fe)2-ADM-liposome on SMMC-7721 cells in vitro shows a high potency and specificity and a minimal dosage is able to achieve this effect.
- Citation: Qin LJ, Liu ZJ. Preparation of adriamycin liposome coupled with HTf(Fe)2 and its anti-tumor activity on human hepatoma cell line SMMC-7721. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 15(12): 1441-1445
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v15/i12/1441.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v15.i12.1441
近年来发现转铁蛋白受体(transferrin receptor, TfR)在消化道肿瘤如肝癌、食管癌、胃癌及结肠癌[1-3]组织中表达升高. TfR为肿瘤细胞生长所必需, 不易发生抗原调变和基因丢失, 且血液中几乎无游离成份, 故TfR在消化道肿瘤靶向性治疗是一种理想的靶抗原[4]. 转铁蛋白(transferrn, Tf)是TfR的配体, 利用正常细胞和癌细胞表面TfR的差异, 用Tf修饰脂质体, 使脂质体具导向癌细胞的高度靶向性. 通过受体介导的胞吞作用[8]能特异性导向药物到细胞内发挥生物效应. 本文制备转铁蛋白脂质体同时加入抗肿瘤药物阿霉素, 合成转铁蛋白阿霉素脂质体, 进行抗人肝癌细胞系SMMC-7721的实验研究, 旨在为转铁蛋白阿霉素脂质体的临床应用提供理论依据.
双铁人转铁蛋白[HTf(Fe)2]; 二硫代苏糖醇(DTT); 异型双功能交联剂N-羟琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)均为Sigma产品; 柱层析用硅胶100-140目, 上海五四化学试剂厂产品; 薄层层折用硅胶GF254, 德国Merk公司产品; 葡聚糖凝胶Sepharose 4B, Sephadex G-50为Pharmacia产品进口分装; RPMI1640培养基, 德国Gibeco公司产品; 小牛血清(FCS), 杭州四季青生物工程材料研究所产品; 阿霉素(adriamycin, ADM), 意大利Farmitalia Carlo ER-BA产品; 层析柱(j1×30 cm), 郑州大学玻璃仪器厂制; Beckman DU Series-70型紫外分光光度计(美国); 二氧化碳培养箱, 日本Alsco公司. 人肝癌细胞株SMMC-7721引自北京大学第一临床医学院消化研究室; 小鼠B12黑色素瘤细胞系, 引自河南省医学科学研究所.
1.2.1 薄层层析(TLC)板的制作和色谱柱的装填: 取GF254硅胶10 g加蒸溜水20 mL, 调成糊状物, 手摆法平铺在5张载玻片上室温凉干, 在烘箱中渐渐升温, 维持105-110 ℃活化30 min, 放置干燥器中备用. 用时取出在离一端1 cm处画线, 在画线上点样, 放置于展开剂中展开, 记下展开剂前沿位置, 凉于后用三用紫外灯在254 A处观察样本移动位置, 计算Rf值.
硅胶柱层析制作: 取一支j1×30 cm的色谱柱, 在底部平铺一层玻璃丝棉, 在丝棉上盖一张滤纸, 将溶剂装入柱内约为柱高四分之三, 将柱层析用硅胶和溶剂调成糊状慢慢倒入柱中, 打开柱下端活塞, 控制流出速度为1滴/s. 当装入量约为柱高四分之三时, 再在上面加盖一层滤纸, 然后加样洗脱.
1.2.2 蛋白质含量的测定: 配制标准蛋白质溶液, 制作标准曲线求回归方程, 测定样品蛋白质含量.
1.2.3 有机磷测定法: 配制磷标准液制作标准曲线, 求回归方程, 由标准曲线求出样本含量.
1.2.4 HTf(Fe)2阿霉素脂质体的制备及其特性[6]: (1)SPDP修饰DOPE 36 mg DOPE(0.048 mmol)用氮气除去有机溶剂, 加3 mL含5 μmol三乙胺, 25 mg SPDP(0.095 mmol)的无水甲醇, 吹氮气去氧, 25 ℃反应5 h. 经TLC木工检测后, 减压蒸馏除去甲醇, 然后溶于5 mL氯仿. 上硅胶柱层析, 先用120 mL氯仿洗脱, 然后依次用20 mL 40:1, 30:1, 20:1, 15:1的氯仿: 甲醇, 100 mL 10:1的氯仿: 甲醇和50 mL 5:1的氯仿: 甲醇洗脱液洗脱, 合并, 减压蒸馏浓缩得DOPE-PDP, 定磷, -80 ℃保存. (2)SPDP修饰HTf(Fe)2 HTf(Fe)2 (1 mol)溶于2 mL含0.15 mol/L NaCl的PBS中(pH7.4). 取1.065 mg SPDP(4 mmol)溶于80 mL无水乙醇. 在搅拌下, 将SPDP滴加入HTf(Fe)2溶液中, 23 ℃反应40 min离心超滤4次除去未反应SPDP和其他小分子物质, 得HTf(Fe)2-PDP. 定蛋白量, 4 ℃保存. (3)阿霉素脂质体制备 取10 mg卵磷脂(PC), 4 mg胆固醇(Chol)和0.6 mg DOPE-PDP于灯炮瓶中氮气吹干一部分有机溶剂, 在旋转蒸发器上蒸去剩余溶剂, 使均匀形成一层脂膜. 加入1 mL 2 g/L阿霉素溶液, 旋涡震荡30 min, 再在CSF-1A型探头或超声仪上超声粉碎30 min, 直至形成均匀的上清液. 在4000 g离心机上离心10 min, 上清液即为小单层阿霉素脂质体-PDP, 超声前后立即取样在倒置显微镜下观察脂质体大小、形态、层数变化. 空白脂质体由10 mg PC和4 mg Chol, 用1 mL含0.15 mol/L NaCl的PBS(pH7.4)代替阿霉素溶液按上法制备. (4)HTF(Fe)2阿霉素脂质体制备 0.5 mg阿霉素脂质体-PDP中加入等体积0.1 mol/L DTT(配于含有0.15 mol/L NaCl的PBS液中, pH7.4), 室温反应20 min, 离心, 过Spharose 4B柱, 得脂质体-SH, 再加入0.5 mg等体积的HTf(Fe)2-PDP, 搅拌下室温交联反应过夜. 离心过Spharose 4B柱, 得HTf(Fe)2阿霉素脂质体.
1.2.5 HTf(Fe)2阿霉素脂质体HTf(Fe)2活性检测: 制备125I-HTf(Fe)2和增溶入胎盘TfR[7], 比较HTf(Fe)2阿霉素脂质体上的HTf(Fe)2对125I-HTf(Fe)2与人胎盘TfR结合抑制率同游离HTf(Fe)2对125I-HTf(Fe)2与人胎盘TfR结合抑制率.
1.2.6 HTf(Fe)2阿霉素脂质体中阿霉素含量和包封率测定: 制作阿霉素含量测定标准曲线, 求出回归方程. 根据阿霉素在232 nm处有最大吸收, 选232 nm为测定波长, 取1 mL HTf(Fe)2阿霉素脂质体由标准曲线求出阿霉素含量. 考察脂质体凝胶柱流出曲线, 测定 HTf(Fe)2阿霉素脂质体中阿霉素包封率[7].
1.2.7 HTf(Fe)2阿霉素脂质体体外细胞毒试验: 取人肝癌细胞系SMMC-7721及小鼠B16黑色素瘤细胞系(1×108/L), 加在96孔培养板上, 每孔0.1 mL, 加入HTf(Fe)2阿毒素脂质体、无HTf(Fe)2阿霉素脂质体、游离阿霉素溶液及培养液(作为对照)共4组. 阿霉素浓度每组设6个, 分别为20, 10, 5, 1, 0.1, 0.01 kg/L, 37 ℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养48 h后加MTT(5 g/L)、20 μL/孔过4 h吊篮离心弃上清, 加甲潜溶液(20 g SDS溶于500 g/L DMF溶液100 mL配制)溶解深蓝色结晶物, 每孔100 μL, 振荡10 min, 放置1 h后在DG3022酶标仪上测A值, 计算杀伤率. 按照上述方法使用B16黑色素瘤细胞作对照重复上述试验, 加药物后孵育0.5 h, 用培养液洗去药物后继续培养48 h, 用MTT法计算杀伤率[8].
统计学处理 实验数据以均数加减标准差(mean±SD)表示, 组间采用t或t'检验, 检验水准为a = 0.05.
DOPE与SPDP反应生成DOPE-PDP, TLC检测其Rf = 0.51. 碘蒸气显色呈棕黄色, 该点茚三酮不显色, DOPE Rf值为0.49, 碘蒸气显棕黄色, 茚三酮显色呈紫蓝色. DOPE-PDP中磷含量为0.03 g/g, DOPE磷含量为0.71 g/g. HTf(Fe)2的蛋白质含量为0.98 g/g, 制备小单层阿霉素脂质体电子显微镜下观察, 脂质体为单层状, 其直径大小为54±30 nm, 空白脂质体, 其形态同阿霉素脂质体, 直径大小为52±28 nm. HTf(Fe)2阿霉素脂质体的电镜图, 呈单层状, 大小均匀, 直径约为56±38 nm, 蛋白质含量为0.47 g, HTf(Fe)2与阿霉素脂质体的交联率为73.50%. HTf(Fe)2空白脂质体的交联率为76.50%.
HTf(Fe)2及HTf(Fe)2阿霉素脂质体以含HTf(Fe)2 0.05 g/L时对125I-HTf(Fe)2与人胎盘TfR结合抑制率分别为75.00%±2.17%和75.19%±1.91%, HTf(Fe)2阿霉素脂质体与HTf(Fe)2组相比P>0.05(t = 0.15), 表明SPDP的修饰和与脂质体交联不影响HTf(Fe)2的活性.
阿霉素含量测定的回归方程为Y = 0.51+107.53X, 相关系数r = 0.99, Y为阿霉素微克数, X为A值. 以2 g/L阿霉素浓度配制的HTf(Fe)2阿霉素质体阿霉素含量为0.12 g/L. 阿霉素脂质体中阿霉素的包封率为6.89%; HTf(Fe)2阿霉素脂质体中阿霉素的包封率为6.10%.
HTf(Fe)2阿霉素脂质体, 阿霉素脂质体和游离阿霉素对肝癌细胞株SMMC-7721的杀伤率, 随着浓度的降低, 杀伤率随之降低, 当浓度为0.10 mg/L时3组杀伤率分别为64.52%, 22.12%和37.82%, 表明HTf(Fe)2阿霉脂质体组对肝癌细胞的杀伤力明显优于后两组的杀伤力(P<0.01). 上述3组对B16黑色素瘤细胞的48 h细胞毒试验结果, 在相同浓度下对细胞杀伤力无显著性差异. 0.5 h预处理细胞毒试验: HTf(Fe)2阿霉素脂质体组, 阿霉素脂质体和游离阿霉素组对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤率, 当浓度较低时, 如0.01 mg/L, HTf(Fe)2阿霉素脂质体组仍保持较强杀伤肝癌细胞能力(杀伤率为32.41%), 而阿霉素脂质体和游离阿霉素组仅为8.16%和4.80%, 从杀伤力结果看前者是后二者的3.97倍和6.75倍; 3组对B16黑色素瘤细胞0.5 h细胞毒作用检测结果, 游离阿霉素具有较强杀细胞作用, HTf(Fe)2阿霉素脂质体组和阿霉素脂质体杀伤作用无明显差异.
脂质体包裹抗肿瘤药物较游离抗肿瘤药物具有明显的缓释作用和靶向作用, 穿越细胞膜屏障, 降低抗肿瘤药物的毒性作用, 保护肿瘤药物免受酶、免疫及其他生理环境破坏和增加耐药细胞的敏感性等优点. 最显著特点是以脂质体作为载体后, 在保持甚至增加抗肿瘤药物临床疗效前提下, 由于改变了药物的药代动力学及药物在组织中分布, 使药物的毒性作用, 特别对生命器官的毒性作用显著降低, 这就为进一步扩大用药的范围提供了可能. 影响脂质体在体内靶向性因素主要有脂质体大小、成份、表面电荷、流动性等. 目前研究最多是使脂质体表面结合上某些识别分子, 提高靶向治疗[9-10].
我们采用异型双功能交联剂SPDP, 发现HTf(Fe)2与脂质体交联率达73.5%, 测得HTf(Fe)2活性不受影响, 且操作方便, 重复性好, 故SPDP是一种理想的交联剂. 选择卵磷脂作为脂质体主要成份, 可减低脂膜流动性, 这种固相脂质体可最大限度保证HTf(Fe)2插入脂双层的效率, 加入胆固醇可显著增加脂质体在生物体内稳定性, 减少脂膜流动性, 防止脂质体内包裹物的渗漏[11]. 比较游离HTf(Fe)2和HTf(Fe)2-脂质体对125I-HTf(Fe)2与人胎盘TfR结合的竞争抑制发现, HTf(Fe)2-脂质体中的HTf(Fe)2与游离HTf(Fe)2比较无显著差异, 表明SPDP的修饰和与脂质体交联不影响HTf(Fe)2的活力. 阿霉素是由放射菌发酵液中提取的一种具有广谱抗癌作用的糖甙类抗生素. 用脂质体作为他的载体后, 不仅能增强抗肿瘤活力, 而且可改变其药代动力学和体内分布, 从而显著的减少心脏毒性作用, 扩大治疗范围[12-13].
TfR在肝癌的导向冶疗中是一种理想的靶抗原治疗[14-15], 我们用HTf(Fe)2修饰的脂质体杀伤肝癌细胞的能力明显优于无HTf(Fe)2阿霉素脂质体和游离阿霉素, 对非靶细胞B16黑色素瘤细胞三者接近. 因此TfR在肝癌的导向治疗中是一种理想的靶抗原. HTf(Fe)2阿霉素脂质体体外杀瘤作用特点是减少用药剂量, 48 h细胞毒试验表明HTf(Fe)2阿霉素脂质对人肝癌细胞系7721的杀伤力较无HTf(Fe)2阿霉素脂质体和游离阿霉素明显提高. HTf(Fe)2与受体的结合引起细胞内化作用, 从而促进阿霉素进入细胞, 增强其对细胞的杀伤力, 对含TfR较少的B16黑色素瘤细胞的杀伤力(IC500.0.71ug/Ml)明显低于对SMMC-7721细胞的杀伤力, HTf(Fe)2阿霉素脂质体与无HTf(Fe)2阿霉素脂质体及游离阿霉素比较对B16细胞杀伤力无明显变化, 表明HTf(Fe)2阿霉素脂质体对表面较多TfR的肝癌细胞具有靶向性.
本研究提示, HTf(Fe)2脂质体作为药物导向载体具有以下特点: (1)分子大小适中, 可通过肝脏内一系列生物学屏障, 把药物送到肝细胞; (2)选择性较高, 具有靶向TfR的肿瘤特异性和主动转运入细胞能力; (3)载药量比较大, 可以把有效治疗量的药物带到靶细胞而不丧失配体特异性; (4)没有免疫原性, 自身无毒, 可生物降解, 不影响药物的作用; (5)稳定性较好, 可大量制备. 因此, HTf(Fe)2修饰的药物脂质体具有广泛的临床前景.
脂质体作为抗肿瘤药物的载体治疗肿瘤研究较多, 近年来研究发现, 肿瘤组织尤其消化道肿瘤转铁蛋白受体的含量较高. 应用转铁蛋白修饰脂质体表面用脂质体作为载体使抗肿瘤药物更好的靶向肿瘤研究尚未见报道. 用交联剂交联蛋白质和脂质体方法很多, 但传统方法导致蛋白质活性受影响, 且交联率低, 这一难题亟待解决.
由于带双铁的HTf(Fe)2在酸性条件下铁离子易失去, 无铁转铁蛋白与受体的结合力降低, 本试验先暴露脂质体上的巯基, 用双功能交联剂SPDP交联HTf(Fe)2制成HTf(Fe)2-脂质体, 保证了HTf(Fe)2完整性以便更好的导向.
本试验研究通过转铁蛋白阿霉素脂质体的制备, 以及对肝癌细胞系SMMC-7721的细胞毒试验, 表明HTf(Fe)2阿霉素脂质对表面有较多TfR的人肝癌细胞具有靶向杀伤性, 为肿瘤的治疗提供了一条有效途径.
N-琥珀酰亚胺-3- (2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP): 是一种双功能交联剂, 交联蛋白和脂质体, 可提高HTf(Fe)2与脂质体的交联率, 操作方便, 重复性好, 是一种理想的交联剂.
本试验设计合理, 结果正确, 探索了新功能交联剂SPDP交联蛋白质和脂质体, 制备了具有靶向性的HTf(Fe)2阿霉素脂质体, 使抗肿瘤药物能有效的靶向肿瘤细胞.
电编:张敏 编辑:张焕兰
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