大肠癌发展与肝转移的差异蛋白质组研究

摘要

近年来大量统计资料表明, 大肠癌作为临床最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率和死亡率呈逐年增高. 肝脏是大肠癌最常见、最易发生的转移器官. 肝转移是大肠癌根治性切除后死亡的主要原因. 所以, 早期预测和诊断肝转移对于提高大肠癌患者生存率, 改善预后有重要意义. 差异蛋白质组研究(又称功能蛋白质组研究)利用蛋白质组研究技术, 对正常大肠黏膜组织、大肠癌原发灶、大肠癌邻近组织、大肠癌肝转移灶、血浆或血液、组织液和尿液进行蛋白分子代谢产物的定性和定量分析并与正常人蛋白代谢谱进行对照分析, 可以发现大肠癌中特有的小分子代谢物, 进一步探讨大肠癌肝转移的发生机制, 观察由多基因事件引起的多蛋白质组分整体变化, 从整体上寻找潜在的药物靶点并且通过肿瘤标志物进行大肠癌的早期诊断和治疗, 防止其发展与转移.我们主要就大肠癌发展与肝转移的差异蛋白质组研究的理论、方法以及成果进行了初步的回顾和总结.

关键词: 结肠直肠肿瘤; 肝转移; 蛋白质组

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: August 29, 2005
Revised: November 2, 2005
Accepted: November 26, 2005
Published online: February 18, 2006

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

Proteome(蛋白质组)这一概念源于"Protein"与"Genome"的杂合, 是1994 年Wilkins 和Williams提出的, 指"一种基因组所表达的全套蛋白质". 目前定义为由单个细胞、器官或组织类型所表达的全部蛋白质. 蛋白质组学作为一门应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的学科, 是对基因组所表达的整套蛋白质的分析. 其内容包括识别各种蛋白质, 确定他们在细胞内外的定位、修饰、相互反应、活性以及功能, 并对由此获取的数据进行数据库构建, 以及进行相关分析技术的研究. 主要分为三个方向: (1)建立蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群; (2)以重要生命过程或重大疾病为对象进行重要生理病理体系或过程的差异蛋白质组学研究(又称功能蛋白质组研究); (3)蛋白质组学支撑平台和生物信息学的研究. 其中差异蛋白质组不仅对于细胞增殖、分化、异常转化、肿瘤形成的研究, 肿瘤生物学标志物的筛选鉴定, 肿瘤的早期诊断和分类有重要意义, 还将促进肿瘤发展和转移的机制的探索、为进一步筛选治疗肿瘤的药物提供有效的靶蛋白, 因此差异蛋白质组学已成为肿瘤研究的最前沿领域[1].

1 大肠癌肝转移概况

大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一, 是导致癌症死亡的第三位疾病, 由于术后局部复发和转移, 其整体治疗水平仍不尽人意, 术后5 a生存率仍在50-55%之间. 治疗失败的主要原因即为大肠癌肝转移[2].

肝脏是大肠肿瘤最常见、最易发生的转移器官. 据报道: 美国每年新发现的大肠癌中1/4-1/3病例属于晚期, 即TNM分期的IV期. 其中, 发生肝转移者占50-70%. 1990年患结直肠癌死亡的人数为6.1万, 而近4万人死于肝转移. 在初次就诊时, 已转移患者中最主要的转移器官是肝脏. 约60%的患者在第一次确诊大肠癌时就存在有转移灶. 而在原发病灶手术切除后5 a内, 还可以有50%患者发生肝转移.大肠癌肝转移若不经任何治疗, 平均生存期仅为6-10 mo. 上述情况充分说明大肠癌肝转移的预后是较差的. 并且绝大多数患者确诊时肝转移灶已经较大或多发, 与大血管关系密切,仅较少患者适合手术治疗[3].

因此, 进行差异蛋白质组学的研究, 找到影响肿瘤转移的关键分子, 然后针对性地设计药物抑制肿瘤的转移是目前治疗大肠癌的趋势.

2 大肠癌肝转移形成的机制

大肠癌肝转移的形成是一个复杂连续多步骤的过程, 涉及癌细胞和宿主之间多因素的作用. 主要包括: (1)癌细胞之间的黏附力降低, 癌细胞表面电荷密度增加, 相互排斥力增大, 细胞容易移动, 从而导致癌细胞从原发部位脱落; (2)癌细胞在自身或间质细胞分泌的蛋白水解酶如肝素酶、胞浆素、弹力蛋白酶、尿激酶的作用下降解新生血管的基底膜、基质和正常细胞, 进入门静脉系统并在循环系统中存活; (3)循环中具有高转移潜能的癌细胞在一些运动因子或归巢因子及其受体的作用下, 通过信号转导途径到达新的转移靶器官, 栓塞、滞留于靶器官如肝脏的微血管中, 然后穿出血管.并且在适宜的肝内微环境条件下, 才能存活增殖, 通过膜受体结合基质蛋白, 刺激血管增生, 形成新的转移灶.

大肠癌肝转移的形成与癌细胞的生物学特性、机体的免疫状况及肝脏的微环境有关. 可简单表示为: 大肠癌原发灶-门静脉系-肝脏-肝静脉入肺循环到全身(或入胆汁), 转移的每一步都受到了多个基因或蛋白的调控, 因此要在众多的因素中找出起关键作用的蛋白分子, 以此为依据设计相应的药物, 蛋白质组技术无疑会起到重要作用.

3 大肠癌转移模型的建立

大肠癌转移模型可以通过以下方式进行: (1)将具有不同转移和侵袭能力的细胞株作为研究对象, 通过体内筛选实验和体外筛选实验获得. (2)采用大肠癌转移患者的原发部位和转移灶的癌组织进行蛋白质组分析, 以寻找出与转移相关的蛋白.

4 大肠癌肝转移的差异蛋白质组分析

4.1 制备样品

由于癌组织的异质性: 癌细胞和非癌细胞在标本中的类型和比例不同, 肿瘤内不同组织的损伤、坏死以及凋亡的程度不同, 蛋白质由于不同部位的细胞基因改变而导致的不同, 很难用一种溶解液溶解所有蛋白, 而且经2-DE分离后的蛋白表达谱相关性较差. LCM技术可以克服这个缺点, 但是通量低, 无法满足大规模研究的需要.

体液标本如血液、尿液、脑脊液、滑液中的蛋白质组研究也在不断发展. 有研究应用表面加强激光解析电离飞行时间质谱SELDI-TOF-MS技术分析肝癌血清差异表达蛋白, 对肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎及健康对照组血清蛋白质进行检测, 对蛋白质波谱进行分析. 发现质荷比(m/z)为11 492.92的蛋白质波峰强度仅肝癌组明显增强, 与患者的肝功能、AFP 等均无相关性. 以波峰的信号噪声比(S/N)大于5为标准, 该蛋白质诊断肝癌的灵敏度为50.6%, 特异性为95.6%. 从而得出质荷比(m/z)为11 492.92的蛋白质可能是肝癌的生物学标志物, 对AFP阴性患者的实验室诊断具有辅助作用[4]. 但是血液和脑脊液掩盖了低丰度蛋白的检出, 近年来人们尝试通过亲合纯化及免疫沉淀结合SDS-PAGE的预分离技术集合蛋白群, 可以很好的弥补这个缺点.

4.2 对样品进行2-DE分析并用肽指纹图谱鉴定候选的差异蛋白

经过2-DE分离后的蛋白可通过: (1)质谱鉴定; (2)转印到PVDF膜进行EDMAN降解测序; (3)在真核细胞内瞬时表达; (4)与已知蛋白进行平行电泳; (5)与数据库作比较等方法进行鉴定. 其中以MALDI和ESI-MS/MS结合四极杆、离子阱、或飞行时间检测器联用液相色谱多见. 尤其对临床标本来说MS技术与免疫印记、免疫组化和immunowalking的联合应用更能反映生物样品的情况[5].

4.3 探讨候选蛋白的功能

在采用MS技术的同时应用一些其他的手段来保证候选蛋白的准确性. 如通过蛋白质组技术和cDNA阵列杂交技术可以证实两者获得的差异表达蛋白基本相似, 也可结合冰冻切片的免疫组化分析来鉴别. 在蛋白水平上, 多用Western blot技术, 而在分子水平上多用半定量RT-PCR结合Northern blot技术确认.

一些未被报道的肿瘤转移相关蛋白可以通过蛋白质组技术被发现, 观察这些蛋白在肿瘤转移中发挥作用与否以及如何发挥作用, 以探讨其功能, 为进一步揭示恶性肿瘤的发病机制,进行早期肿瘤临床诊断并寻找新的治疗靶标奠定基础.

5 大肠癌肝转移相关分子标志

大肠癌浸润和转移得益于一些蛋白的参与, 如刺激癌细胞与宿主细胞或细胞外基质黏附, 癌胞对宿主屏障的蛋白水解, 肿瘤细胞的定向移动, 以及在靶器官内的克隆性生长等. 参与的蛋白可能在细胞内和细胞外的不同层面上起作用, 并与其它调节因子一起构成一系列复杂的调节网络, 因此可被作为肿瘤标志而用于诊断和预后. 就大肠癌而言, 一些酶类、抗原类、基因类标志己经被引起关注, 并取得了不同程度的进展[6]. 对于大肠癌转移相关蛋白的研究综合目前文献, 有如下成果: (1)血清蛋白 Roboz等分析大肠癌患者与正常对照组之间的血清蛋白图谱的差异, 其中大肠癌患者高表达8.942士5.3 kU 蛋白质, 而9.3 ku的蛋白质呈低表达, 正常对照组上述两种蛋白质的表达情况与患者组正好相反. 表明8.9 ku和9.3 ku蛋白质可作为检测大肠癌的肿瘤标记物[7]. (2)E-钙黏附蛋白/连接蛋白复合体是维持上皮细胞的极性、形态和组织结构完整的主要黏附分子. 有研究表明大肠癌进展过程中常有复合体功能的丧失, 使癌细胞间黏附性降低, 易于脱离. E-钙黏附蛋白/连接蛋白复合体的缺失与大肠癌的肝转移相关[8]. (3)整合素(integrin)整合素是一类位于细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子, 主要介导细胞与细胞外基质、细胞与细胞间的黏附. 有实验显示整合素在大肠癌肝转移组织中较原发组织表达明显增高, 提示其可能在大肠癌肝转移中起重要作用[9]. (4)癌胚抗原(CEA)CEA作为免疫球蛋白超家族成员之一的一种癌细胞的黏附分子, 是大肠癌去分化过程中表达的重要标志和最有价值的肿瘤标志物之一, 在大肠癌的复发转移中起重要作用, 广泛应用在大肠癌肝转移的早期检测中. Kupfer细胞的CEA受体, 与CEA特异性结合, 诱导分泌细胞因子(IL-10、IL-6, TNF-a), 从而诱导细胞间黏附分子的表达,利于肿瘤黏附并滞留于肝脏[10]. (5)CD44癌细胞表面的黏附因子CD44是一种跨膜透明质酸受体, 介导与内皮细胞的黏附. 其变异体CD44v6, CD44v8-10的高表达被认为与大肠癌肝转移的关系十分密切. 可能通过促进癌细胞与血管内皮细胞和细胞外基质的黏附以及癌细胞向基质侵袭, 影响癌细胞骨架蛋白的聚集和分布, 并在转移过程中逃避宿主免疫系统的识别而免于被清除, 从而影响癌细胞的迁移和运动能力, 影响大肠癌肝转移的形成[11]. (6)骨桥蛋白(OPN)OPN是一种磷酸化糖蛋白, 含有与细胞黏附相关的特异的Arg-Gly-Asp序列(RGD). 在正常大肠黏膜、大肠癌组织和大肠癌肝转移组织中检测了OPN mRNA的表达差异, 发现OPN mRNA表达在大肠癌肝转移组织中最高, 大肠癌原发组织中次之, 正常大肠黏膜中最低, 揭示了OPN与大肠癌肝转移的显著相关性. 影响大肠癌细胞黏附能力的作用可能是大肠癌肝转移发生发展的相关机制之一[11]. (7)唾液酸化的路易斯寡糖-X(sLex)抗原sLex抗原作为肝血管内皮细胞表面E-selectin受体的配体, 介导癌细胞与靶器官血管内皮细胞的黏附促进癌细胞的趋化运动, 从而导致转移高表达sLex抗原的癌细胞更易浸润基底膜黏附于肝血管内皮上生长并形成肝转移癌. 在大肠癌肝转移中起重要作用许多研究也已证实大肠癌转移灶中sLex抗原的表达强于原发灶中sLex抗原的表达[12]. (8)细胞外基质(ECM)降解酶己有充分证据表明, 肿瘤的转移与其产生或诱导产生降解ECM或基底膜的蛋白酶的能力密切相关. 这些蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、弹力蛋白酶和半脱氨酸蛋白酶等. 其中金属蛋白酶家族(MMPs)被认为是一组最重要的蛋白酶, 在肿瘤浸润和转移中发挥重要作用. 是抗肿瘤转移的一个重要靶点[13]. 另有研究表明ECM降解在肿瘤的增殖、肿瘤的免疫逃逸和肿瘤新生血管的生成中都起很大作用. (9)原肌球蛋白(tropomyosin), 波形纤维蛋白(vimentin)和热休克蛋白70(HSP70) 这些蛋白质参与了细胞骨架构成、蛋白质折叠和相互作用. 利用蛋白质组学方法发现, 在肝癌转移亚细胞M2H7402中, 原肌球蛋白、波形纤维蛋白和热休克蛋白70表达明显上调, 揭示它们在大肠癌肝转移中具有重要的作用[14]. (10)Apo A1研究证实了Apo A1在原发大肠癌的微弱表达以及在转移肝脏和淋巴结的强烈表达, 在原发肿瘤中表达在深层中比在表层中强烈些, 同时在正常肠黏膜上皮细胞中表达很少见. 进一步的研究揭示了Apo A1在没有转移的大肠癌患者中表达, 但发生和表达的水平比转移的大肠癌患者低, 因此Apo A1是大肠癌浸润的潜在标志[15]. (11)Puma是一种线粒体凋亡前体蛋白, 通过Bax和线粒体依赖途径诱导快速凋亡. 研究证明了其诱导凋亡具有时间和剂量依赖性. Puma的过度表达通过蛋白酶介导的降解使得peroxiredoxin1上调、stathmin下调; 阻碍了细胞微管网络, 加剧了蛋白突变, 诱导大肠癌肝转移的发生[16]. (12)癌基因编码的相关蛋白包括①p53, p21, p27蛋白: 研究表明这三种蛋白的表达与大肠癌的预后与转移有密切关系. p27蛋白为细胞生长传递持续性促有丝分裂信号, 导致细胞不断增殖, 从而诱发肿瘤的发生. 已发现其缺陷和大肠癌肝转移潜能密切相关[17,18]. ②C-erbB-2蛋白: 由胞外区、跨膜区、胞内区组成, 具有酪氨酸激酶活性. 人类癌细胞的c-erbB-2蛋白的激活主要通过基因点突变和基因扩增导致上述刺激使得激酶功能区并排, 从而导致酪氮酸蛋白激酶的激活并特异性使得酪氨酸磷酸化, 使之与底物发挥作用, 同时也使得胞浆内的C-src蛋白(第二信使)被磷酸化, 导致胞浆信号传递机制的激活, 影响细胞的生长和分化.有文献表明在大肠癌肝转移组织中, C-erbB-2蛋白产物亦呈过度表达[19]. ③Rho蛋白Rho蛋白对细胞骨架网络的构成发挥调节作用, 通过调节胞浆中微丝上肌动蛋白的聚合或解离, 从而影响细胞形态. 研究表明在大肠癌肝转移组织中能够检出Rho蛋白的过度表达[20]. Cdc42蛋白即属小G蛋白Rho家族的GTP结合蛋白. 其增强表达, 可促进细胞分裂, 加速结直肠癌细胞的生长增殖, 对抗和阻断癌细胞凋亡信号转导途径并通过对细胞骨架蛋白的调控影响癌细胞黏附和运动功能, 增强其侵袭性. 此外还可诱导肿瘤血管的生成, 进一步促进结直肠癌肝转移的形成. ④c-met蛋白: 即肝细胞生长因子(HGF)受体. 是由原癌基因c-met编码的具有酪氨酸激酶活性, 参与细胞信息转导、细胞骨架重排调控的蛋白, 是细胞增殖、分化和运动的重要因素. 通过比较转移灶组织中c-met蛋白表达水平, 分析其与大肠癌病理分化程度, 淋巴结转移及肝转移的关系, 并同时比较大肠癌肝转移中原发灶与转移灶表达水平的差异, 表明c-met蛋白在大肠癌发生、发展、肝转移中起重要作用[21]. 此外还有转移抑制基因nm23以及DPC4基因, 在抑制大肠癌肝转移中可能发挥作用[22]. (13)肿瘤坏死因子(TNF)TNF是一类能直接造成癌细胞死亡的细胞因子, 在高转移大肠癌细胞株中高表达, 可能通过"免疫逃逸"使大肠癌细胞在血液循环过程中逃脱免疫系统的监测, 从而引起肿瘤转移[23]. (14)细胞膜磷脂蛋白和蛋白激酶C同工酶 通过大肠癌原发灶、癌旁肠黏膜及肝转移灶组织细胞膜磷脂检测结果可知, PI、PE、PC3种膜磷脂含量在原发灶、肝转移灶中有不同程度的增加, 表明膜磷脂代谢与结直肠癌的发生及肝转移有关. 其含量增加对膜融合、离子跨膜运送、膜蛋白的功能均有影响, 特别是PE分子对PKC具有更强的激活能力, 从而促进癌细胞在肝脏的生长和增殖[24].

也有研究表明钙调蛋白联合体、核糖核酸酶-6-前体蛋白、α-甘露糖昔酶I表达缺失、前阿朴脂蛋白增强表达、p-珠蛋白表达均与大肠癌发生和肝转移有关.C-4, M-7, M-9蛋白可能是与大肠癌发生和肝转移相关的新蛋白，有待进一步研究.

6 存在的局限性与发展方向

由于蛋白质组技术的快速发展和研究者的不懈努力, 越来越多的大肠癌肝转移相关的差异蛋白质标记正被揭示. 这无疑表明深层次的蛋白质组分析在大肠癌肝转移机制研究的价值以及以其为核心的综合研究方法对转移学说进一步发展的重要性. 但我们也应该看到蛋白质组技术在样品制备和鉴定上的缺陷, 在重复性、高通量性、自动化的不足, 对低丰度蛋白、极碱性蛋白、高分子量蛋白分离, 对蛋白翻译后修饰的鉴定的瓶颈制约着蛋白质组技术的完善. 同时肝转移的发生涉及多个基因和蛋白的相互协同或拮抗作用, 给研究工作带来了难题和挑战. 尤其是目前还没有一种潜在蛋白标志被临床医师系统地用于诊断和治疗. 这就迫切要求我们发展快速系统地鉴别差异蛋白的技术, 建立高效的蛋白数据库并推广其在大肠癌肝转移的早期诊断、分类、判断预后、选择药物靶标以及治疗中的应用.

相信随着技术的迅猛发展, 研究的进一步深入, 蛋白质组技会为干预大肠癌的发展及转移这一过程的发生发展提供有效的手段和理论基础.

评论

背景资料

大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一, 由于术后局部复发和转移, 其整体治疗水平不尽人意. 肝转移是大肠癌根治性切除后死亡的主要原因. 所以, 早期预测和诊断肝转移对于提高大肠癌患者生存率,改善预后有重要意义. 自1994 年Wilkins和Williams提出蛋白质组(Proteome)后, 以其为核心的技术的快速发展使大肠癌患者的早期预测和诊断成为可能.

研发前沿

蛋白质组学作为一门应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的学科, 是对基因组所表达的整套蛋白质的分析, 主要分为三个方向: (1)建立蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群; (2)以重要生命过程或重大疾病为对象进行重要生理病理体系或过程的差异蛋白质组学研究; (3)蛋白质组学支撑平台和生物信息学的研究. 其中差异蛋白质组学已成为肿瘤研究的最前沿领域.

创新盘点

利用蛋白质组研究技术, 对正常组织、癌组织、转移灶及组织液等进行蛋白分子代谢产物的定性和定量分析, 并与正常人蛋白代谢谱进行对照分析, 不仅对于细胞增殖、分化、异常转化、肿瘤形成的研究, 肿瘤生物学标志物的筛选鉴定, 肿瘤的早期诊断和分类有重要意义, 还将促进肿瘤发展和转移的机制的探索、为进一步筛选治疗肿瘤的药物提供有效的靶蛋白.

应用要点

观察由多基因事件引起的多蛋白质组分整体变化, 从整体上寻找潜在的药物靶点, 并且通过肿瘤标志物进行大肠癌的早期诊断和治疗, 防止其发展与转移.

名词解释

差异蛋白质组学研究: 又称功能蛋白质组研究, 以重要生命过程或重大疾病为对象进行重要生理病理体系或过程的差异蛋白质组学研究, 对正常组织、癌组织、转移灶及组织液等进行蛋白分子代谢产物的定性和定量分析, 并与正常人蛋白代谢谱进行对照分析, 发现特有的小分子代谢物, 进一步探讨癌转移的发生机制及临床应用.

同行评价

该文重点对大肠癌发展与肝转移的蛋白质组研究现状进行了详尽的综述, 阐述了差异蛋白质组鉴定在肿瘤转移机制及其靶基因治疗药物研发等方面的可能价值, 有一定指导意义 .

备注

电编:李琪 编辑:菅鑫妍 审读:张海宁

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