E-钙黏素、MMP2和ICAM-1的表达与胃癌中医证型的关系

摘要

目的: 通过检测E-钙黏素(E-Cad)、MMP2和ICAM-1在胃癌不同证型的表达, 探讨基因表达与胃癌中医证型的关系.

方法: 胃癌标本59例, 其中肝胃不和型10例、脾胃虚寒型10例、胃热伤阴型9例、痰湿凝结型10例、瘀毒内阻型10例和气血双亏型10例; 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测六型胃癌组织E-Cad、MMP2和ICAM-1 mRNA的表达水平, 并对各基因在不同证型的表达情况以及证型与基因的关系进行分析.

结果: 3种目的基因在6种证型中的表达均有很大差异, 其中, E-Cad在胃热伤阴型与气血双亏型中的表达有显著性差异(0.58±0.11 vs 0.89±0.25, P = 0.026), MMP2在肝胃不和型与瘀毒内阻、气血双亏两型有显著性差异(0.78±0.26 vs 1.27±0.44, P = 0.006; 0.78±0.26 vs 1.30±0.59, P = 0.004), 胃热伤阴型与瘀毒内阻、气血双亏两型有显著性差异(0.86±0.22 vs 1.27±0.44, P = 0.024; 0.86±0.22 vs 1.30±0.59, P = 0.016), 脾胃虚寒型与瘀毒内阻、气血双亏两型有显著性差异(0.86±0.22 vs 1.27±0.44, P = 0.020; 0.86±0.22 vs 1.30±0.59, P = 0.013); ICAM-1在各证型间无显著差别, 但已有组间差别的趋势.

结论: 不同证型胃癌的转移机制存在一定的差异, 基因表达的差异可能是形成不同证型的物质基础之一.

关键词: E-钙黏素; 基质金属蛋白酶-2; 细胞间黏附分子-1; 中医证型; 胃癌

Correlations of E-cadherin, matrix metalloproteinase-2 and intercellular adhesion molecule-1 expression with traditional Chinese medicine classifications of syndrome for gastric carcinoma

Long Liu, Ling Xu, Da-Zhi Sun, Pin-Kang Wei

Long Liu, Ling Xu, Da-Zhi Sun, Pin-Kang Wei, Department of Traditional Chinese Medicine, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30271626.

Correspondence to: Dr. Ling Xu, Department of Traditional Chinese Medicine, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, 415 Fengyang Road, Shanghai 200003, China. czzyk@smmu.edu.cn

Received: August 30, 2006
Revised: September 28, 2006
Accepted: October 14, 2006
Published online: December 28, 2006

Abstract

AIM: To investigate the expression of E-cadherin (E-Cad), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in different traditional Chinese medicine (TCM) classifications of syndrome for gastric carcinoma, and explore their relationships with syndromic classifications of gastric cancer.

METHODS: A total of 59 gastric cancer cases, including the types of incoordination between liver and stomach (n = 10), insufficiency of spleen and stomach (n = 10), stomach heat due to yin deficiency (n = 9), stagnation of phlegm-damp (n = 10), retention of blood stasis toxin in the interior (n = 10) and exhaustion of both qi and blood (n = 10). The expression of E-Cad, MMP2, and ICAM-1 mRNA was determined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and the diversities were analyzed between the different syndromic types.

RESULTS: Evident diversity was noted in the different syndromic types. The expression of E-Cad was significantly different between the types of stomach heat due to yin deficiency and exhaustion of both qi and blood (0.58 ± 0.11 vs 0.89 ± 0.25, P = 0.026). The level of MMP2 expression was markedly lower in the types of incoordination between liver and stomach, stomach heat due to yin deficiency, and insufficiency of spleen and stomach than that in the type of retention of blood stasis toxin in the interior (0.78 ± 0.26, 0.86 ± 0.22, 0.86 ± 0.22 vs 1.27 ± 0.44; P = 0.006, P = 0.024, P = 0.020) or exhaustion of both qi and blood (0.78 ± 0.26, 0.86 ± 0.22, 0.86 ± 0.22 vs 1.30 ± 0.59, P = 0.004, P = 0.016, P = 0.013). The expression of ICAM-1 was not evidently diversified between the six syndromic types.

CONCLUSION: The metastasic mechanism of gastric cancer is diversified between the different syndromic classifications, in which the differences of gene expression may play important roles.

Key Words: E-cadherin; Matrix metalloproteinase 2; Intercellular adhesion molecule-1; Traditional Chinese Medicine types of syndrome; Gastric carcinoma

0 引言

辨证论治是中医理论特色之一, 证作为疾病某一阶段病因、病位、病性以及邪正关系的综合概括, 在中医临床中占有举足轻重的地位. 临床发现, 不同证型的胃癌之间, 转移情况存在着一定的差异. 近年来, 随着分子生物学研究的深入开展, 发现肿瘤转移是一个多步骤、多因素参与的复杂过程, E-钙黏素(E-Cad), MMP2和ICAM-1在此过程中发挥着重要的作用. 有关E-Cad, MMP2和ICAM-1与胃癌的分期、病理分型、浸润转移以及预后的研究已非常深入, 但与胃癌中医证型之间的关系尚鲜见报道, 我们就二者之间的关系进行探讨.

1 材料和方法

1.1 材料

2002-12/2003-12长征医院普外科经确诊为胃癌并于次日手术的患者. 标本于切除后半小时内放入-70 ℃冰箱保存备用, 共收集到胃癌组织标本59例, 男性38例, 女性21例, 平均年龄60.37±9.84岁. DEPC(焦碳酸二乙酯): Sigma公司产品; TRIzol: 上海生工生物工程技术服务有限公司产品; M-MLV Reverse Transcriptase(反转录酶): Promega公司产品; Oligo dT, dNTP和Ribonuclease Inhibitor: TaKaRa公司产品; Taq DNA Polymerase: MBI公司产品.

1.2 方法

患者手术前1 d, 由两名主治以上资历的医师进行床边辨证, 并详细记录与辨证相关的症状、体征、舌苔和脉象等. 辨证标准根据我科前期循证研究结果, 并参照1978年全国第一届胃癌学术会议北京市胃癌协作组制定的6型分法辨证[1-4]. 其中肝胃不和10例、脾胃虚寒10例、胃热伤阴9例、痰湿凝结10例、瘀毒内阻10例、气血双亏10例, 共59例.

采用RT-PCR方法半定量检测: (1)总mRNA提取: 用TRIzol、氯仿、异丙醇等提取癌组织中RNA, 紫外分光光度计测定总RNA, A₂₆₀/A₂₈₀鉴定mRNA纯度, 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA的完整性, 并将RNA稀释至1 g/L; (2) cDNA合成: 总反应体系20 μL, 在微量离心管中加入RNA Sample 1 μL, Oligo dT primer 1 μL, RNAse Inhibitor 0.5 μL, 用DEPC处理过的双蒸水补足体积至11.5 μL, 72 ℃加热2 min, 冰浴2 min, 上述体系内加入5×Buffer 4 μL, 10×dNTPmix 2 μL, M-MLV反转录酶0.5 μL, DTT 2 μL, 42 ℃加热60 min, 冰浴2 min; (3)引物合成: 上海生工生物工程技术有限公司合成引物(表1); (4)PCR扩增: 总反应体系25 μL. cDNA模板6 μL, 10×Buffer 2.5 μL, 12.5 mmol/L dNTP 0.5 μL, 25 mmol/L MgCl₂ 1.0 μL, 顺向、反向引物各0.5 μL, Taq酶0.3 μL(最后加), 双蒸水13.7 μL(表2); (5)图像分析: PCR产物在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳, 0.5 mg/L EB染色, 出现与扩增产物大小相等的电泳条带为阳性, 结果采用Gis凝胶图像处理软件进行分析, 用内参基因的灰度值校正目的基因产物的灰度值, 进行半定量分析.

表1 PCR反应引物设计与扩增片段长度.

扩增基因	引物设计	扩增片段长度
GADPH	顺向: 5'TTAGCACCCCTGGCCAAGG3'	540 bp
	反向: 5'CTTACTCCTTGGAGGCCATG3'
E-Cad	顺向: 5'CTGAAGTGACTCGTAACGACG3'	286 bp
	反向: 5'CATGTCAGCCAGCTTCTTGAAG3'
MMP2	顺向: 5'GGCCCTGTCACTCCTGAGAT3'	477 bp
	反向: 5'GGCATCCAGGTTATCGGGGA3'
ICAM-1	顺向: 5'CGGAAGGTGTATGAACTGAGCA3'	323 bp
	反向: 5'ATTGGCTCCATGGTGATCTCTC3'

表2 PCR反应条件.

扩增基因	预变性	变性	退火	延伸	循环数
GADPH	95 ℃ 5 min	94 ℃ 30 s	55 ℃ 30 s	72 ℃ 40 s	28
E-Cad	95 ℃ 5 min	94 ℃ 30 s	57 ℃ 30 s	72 ℃ 20 s	33
MMP2	95 ℃ 5 min	94 ℃ 30 s	56 ℃ 30 s	72 ℃ 30 s	33
ICAM-1	95 ℃ 5 min	94 ℃ 30 s	55 ℃ 30 s	72 ℃ 20 s	35

统计学处理 应用SPSS11.5软件包, 计量资料结果皆以均数±标准差(mean±SD)表示, 采用方差分析ANOVA, 组间两两比较.

2 结果

2.1 各基因在不同证型中的表达

内参在各证型中的表达无差别, E-Cad在6种证型中的表达为气血双亏型>肝胃不和型>脾胃虚寒型>痰湿凝结型>瘀毒内阻型>胃热伤阴型, 其中胃热伤阴型与气血双亏型有显著性差异(P<0.05); MMP2在6种证型中的表达为气血双亏型>瘀毒内阻型>痰湿凝结型>脾胃虚寒型 = 胃热伤阴型>肝胃不和型, 其中, 肝胃不和型与瘀毒内阻型、气血双亏型均有显著性差异(P<0.01), 胃热伤阴型与瘀毒内阻型、气血双亏型均有显著性差异(P<0.05), 脾胃虚寒型与瘀毒内阻型、气血双亏型有显著性差异(P<0.05); ICAM-1在6种证型中的表达为瘀毒内阻型>胃热伤阴型>痰湿凝结型>气血双亏型>脾胃虚寒型>肝胃不和型, 各证型间无显著性差异, 但已有组间差异的趋势(表3, 图1). 由于各目的基因在转移的不同步骤发挥作用, 结合实验结果, 提示同一基因在不同证型中发挥的作用不同, 不同证型的转移机制存在着一定的差异.

图1 各证型胃癌组织中GADPH, E-Cad, MMP2, ICAM-1的mRNA表达. A: GADPH; B: E-Cad; C: MMP2; D: ICAM-1; M: Mark; 1: 肝胃不和; 2: 胃热伤阴; 3: 脾胃虚寒; 4: 痰湿凝结; 5: 瘀毒内阻; 6: 气血双亏.

表3 目的基因mRNA在不同证型的表达情况(mean±SD).

辨证分型	肝胃不和	胃热伤阴	脾胃虚寒	痰湿凝结	瘀毒内阻	气血双亏
E-cad	0.84±0.31	0.58±0.11c	0.79±0.29	0.67±0.17	0.63±0.45	0.89±0.25
MMP-2	0.78±0.26b	0.86±0.22a	0.86±0.22a	0.98±0.35	1.27±0.44	1.30±0.59
ICAM-1	0.49±0.30	0.72±0.35	0.57±0.23	0.70±0.25	0.74±0.28	0.63±0.28

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 瘀毒内阻组与气血双亏组;

^cP<0.05 vs 气血双亏组.

2.2 各证型中不同基因的表达

肝胃不和型中各基因的表达为E-Cad>MMP2>ICAM-1; 胃热伤阴型中各基因的表达为MMP2>ICAM-1>E-Cad; 脾胃虚寒型中各基因的表达为MMP2>E-Cad>ICAM-1; 痰湿凝结型中各基因的表达为MMP2>ICAM-1>E-Cad; 瘀毒内阻型中各基因的表达为MMP2>ICAM-1>E-Cad; 气血双亏型中各基因的表达为MMP2>E-Cad>ICAM-1; 不同证型3种基因的表达情况既有相同之处, 又存在一定差异, 提示, 目的基因在mRNA水平表达的差异可能是形成不同证型的内在物质基础之一.

3 讨论

肿瘤的浸润转移过程大致分为以下几个步骤: (1)癌细胞间黏附能力下降, 从原发瘤脱落, 这是肿瘤转移的先决条件[5]; (2)脱落的癌细胞黏附于细胞外基质(ECM), 释放多种水解酶类, 使ECM降解; (3)癌细胞以主动方式侵入循环管道, 形成栓子; (4)在特定器官的毛细血管滞留并黏着, 再次穿过血管壁并定居、增殖, 形成转移灶, 肿瘤转移是这样一个多步骤、连续的主动过程, 受多种因素的影响.

E-Cad是介导同质细胞间黏附的一组跨膜糖蛋白, 与细胞骨架蛋白、肌动蛋白等结构黏附连接, 是建立与保持上皮细胞极性与细胞间紧密连接的关键分子. 当其表达减少或功能障碍时将无法相互黏连, 这对于肿瘤来说意味着浸润生长与转移[6]. 近年来, 从分子水平上对肿瘤细胞的黏附功能进行了较深入的研究, 显示多种癌细胞系或癌组织在早期常有E-Cad表达的下降和功能障碍存在, 癌细胞因此获得一定的自由, 向癌肿周围浸润性生长, 到后期更为明显, 癌细胞可以完全脱离癌组织, 呈游离状态, 随血流播散形成转移癌, E-Cad介导的黏附系统已被公认为"浸润抑制系统"[7], E-Cad表达的下调还与胃癌的生长方式、浸润深度及转移有关[8-14]. 结合本实验结果, 提示E-Cad表达的减少在胃热伤阴、痰湿凝结和瘀毒内阻3型的转移过程中作用更重要. 癌细胞在穿过基底膜和ECM的过程中, 基质金属蛋白酶(MMPs)发挥了重要的作用, 其中, 又以MMP2在肿瘤侵袭转移中的作用最为重要[15]. MMP2以前酶原的形式由结缔组织细胞产生, 降解Ⅳ, Ⅴ型胶原及明胶等, 在体内主要的作用是在炎症细胞迁移和肿瘤浸润中降解ECM和基底膜. 胃癌细胞MMP2主要表达于细胞膜, 其前体在细胞表面的激活主要参与了局部基质的降解, 这种局部降解对于癌细胞的迁移具有决定性作用, 即胃癌细胞扩散与血管侵犯的关键环节. MMP2不仅通过降解ECM促进肿瘤侵袭转移, 还通过刺激毛细血管内皮细胞增生、新生血管形成等促进肿瘤生长和扩散[16-17]. 研究发现, MMP2表达的增高与胃癌侵袭、淋巴结转移以及分化密切相关[18-21]. 本实验中我们发现瘀毒内阻与气血双亏两型的表达明显增加, 提示MMP2表达的增加与此两型的转移关系密切.

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成员之一, 是白血球整合黏蛋白受体及淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)拮抗受体[22], 通过促进异源细胞间的相互黏附, 从而导致肿瘤的转移. 肿瘤细胞通过ICAM-1表达的增加与白细胞黏附, 进而黏附到血管内皮并渗出血管外, 播散到其他部位[23]. 而且, 可溶性ICAM-1(s ICAM-1)还可通过促进肿瘤血管的生成和伪装癌细胞使其逃避机体的免疫监视, 而促进肿瘤的转移[24]. 研究发现, ICAM-1的表达与胃癌淋巴结转移和TNM分期有显著相关性[25-30]. 本实验中, 各证型之间ICAM-1的表达无显著性差异, 但胃热伤阴、痰湿凝结和瘀毒内阻三型的表达有增高趋势, 说明胃热伤阴型、痰湿凝结型和瘀毒内阻型发生转移与ICAM-1表达增加关系更密切一些. 通过本实验我们发现, 在mRNA水平, E-Cad, MMP2与ICAM-1在6种证型中的表达都有一定的差异, 而且各基因分别在肿瘤转移的不同步骤发挥作用, 因而本结果可以提示, 不同证型, 其转移机制可能存在一定的差异. 由于各基因在转移过程的不同步骤、不同部位发挥作用, 因此, 临床中可以有的放矢的针对不同靶点进行治疗, 而这恰恰从基因水平验证了中医辨证施治理论的正确性, 而且为其他治疗方法的研究也提供了新的依据.

证本质的研究是目前中医现代化研究中的热点和难点, 随着分子生物学的飞速发展, 证本质的研究内容不断被充实, 通过本实验我们还发现, 每个证型之间, 基因的表达情况既有相同之处, 同时也存在一定的差异, 根据中医"有诸内者必形诸外"的理论, 各基因在mRNA层次表达的差异可能也是形成不同证型的内在物质基础之一.

评论

背景资料

证本质的研究是目前中医现代化研究中的热点和难点, 临床发现, 不同证型的胃癌之间, 转移情况存在着一定的差异. 近年来, 随着分子生物学研究的深入开展, 发现肿瘤转移是一个多步骤、多因素参与的复杂过程, E-钙黏素(E-Cad), MMP2和ICAM-1在此过程中发挥着重要的作用.

同行评价

本文利用现代分子生物学技术, 通过对胃癌组织中3种基因检测, 探讨胃癌不同中医证型的分子机制, 研究将传统中医与现代基础医学理论和技术紧密相结合, 立题与结果均有一定新意, 且具有科学性, 可读性.

备注

电编: 张敏 编辑: 王晓瑜

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