临床经验 Open Access
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世界华人消化杂志. 2006-12-08; 14(34): 3321-3325
在线出版日期: 2006-12-08. doi: 10.11569/wcjd.v14.i34.3321
系统检测慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞免疫表型的临床意义
吴引伟, 文剑, 赵伟, 张亮, 宋玉华, 谈国蕾, 赵磊
吴引伟, 文剑, 赵伟, 张亮, 宋玉华, 谈国蕾, 赵磊, 东南大学医学院附属南京市第二医院细胞室 江苏省南京市 210003
基金项目: 2003年度南京市医学科技发展项目, No. YKK0328; 2003年度江苏省社会发展指导性项目, No. BS2003601.
通讯作者: 吴引伟, 江苏省南京市鼓楼区钟阜路1号, 南京市第二医院细胞室. njchongchong@163.com
电话: 025-83432214-2155 传真:025-83471484
收稿日期: 2006-08-28
修回日期: 2006-09-17
接受日期: 2006-09-20
在线出版日期: 2006-12-08

目的: 系统研究慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞免疫表型以及与临床的关系.

方法: 用流式细胞术测定28例慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞膜CD3, CD4, CD5, CD25, CD28及CD38等相关CD分子的表达情况, 并与22例健康对照组比较, 并分析其与HBV DNA及临床的相关性.

结果: 28例慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+, CD8+HLADR+CD38+, CD3-CD19+, CD5-CD19+及CD19+CD38+淋巴细胞数明显高于健康对照组(t = 2.37, 3.71, 4.10, 2.31, 2.17, P<0.05), 而CD3-CD8+, CD8+CD28-及CD3-CD(16+56)+淋巴细胞数明显低于健康对照组(t = 3.14, 3.20, 2.51, P<0.05). 外周血中HBV DNA含量>109 copies/L的患者其CD3+CD8+, CD8+CD28+, CD4+CD45RA+CD62L+, CD8+CD45RA+CD62L+及CD4+CD38+淋巴细胞数均显著高于HBV DNA含量<109 copies/L的患者, 差别有统计学意义(t = 2.16, 2.42, 2.83, 3.01, 2.50, P<0.01或P<0.05).

结论: 慢性乙型肝炎患者T、B两种淋巴细胞的活化程度均较高, NK细胞数量减少; 体内HBV复制活跃的患者其T淋巴细胞活化程度较高.

关键词: 淋巴细胞; 免疫表型; 流式细胞术; 乙肝病毒; 慢性乙型肝炎
引文著录: 吴引伟, 文剑, 赵伟, 张亮, 宋玉华, 谈国蕾, 赵磊. 系统检测慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞免疫表型的临床意义. 世界华人消化杂志 2006; 14(34): 3321-3325
Clinical values of systemic analysis of peripheral blood mononuclear cell subsets in patients with chronic hepatitis B
Yin-Wei Wu, Jian Wen, Wei Zhao, Liang Zhang, Yu-Hua Song, Guo-Lei Tan, Lei Zhao
Yin-Wei Wu, Jian Wen, Wei Zhao, Liang Zhang, Yu-Hua Song, Guo-Lei Tan, Lei Zhao, Cell Laboratory, the Second Hospital of Nanjing Affiliated to Medical College of Southeast University, Nanjing 210003, Jiangsu Province, China
Supported by: the Medical Science and Technology Foundation of Nanjing City, Jiangsu Province, No. YKK0328, and the Societal Directive Research Programs of Science and Technology Commission of Jiangsu Province, No.BS2003601.
Correspondence to: Yin-Wei Wu, Cell Laboratory, the Second Hospital of Nanjing Affiliated to Medical College of Southeast University, 1 Zhongfu Road, Gulou District, Nanjing 210003, Jiangsu Province, China. njchongchong@163.com
Received: August 28, 2006
Revised: September 17, 2006
Accepted: September 20, 2006
Published online: December 8, 2006

AIM: To study the clinical values of systemic detection for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) subsets in patients with chronic hepatitis B (CHB).

METHODS: Flow cytometry (FCM) was used to detect the expression of CD3, CD4, CD5, CD25, CD28 and CD38 in peripheral blood lymphocytes from 28 CHB patients and 22 healthy controls, and their correlations between the quantification of hepatitis B virus (HBV) DNA.

RESULTS: The levels of CD4+CD25+, CD8+HLADR+CD38+, CD3-CD19+, CD5-CD19+ and CD19+CD38+ lymphocytes in CHB patients with chronic hepatitis B were significantly higher than those in the controls (t = 2.37, 3.71, 4.10, 2.31, 2.17, P < 0.05), while the levels of CD3-CD8+, CD8+CD28- and CD3-CD(16+56)+ lymphocytes were lower than those in the controls (t = 3.14, 3.20, 2.51, P < 0.05). In the patients with high replication of HBV DNA (more than 109 copies/L), the numbers of CD3+CD8+, CD8+CD28+, CD4+CD45RA+CD62L+, CD8+CD45RA+CD62L+ and CD4+CD38+ cells were increased dramatically as compared with those in the patients with low HBV replication (t = 2.16, 2.42, 2.83, 3.01, 2.50, P < 0.01 or P < 0.05).

CONCLUSION: The activation of T and B lymphocytes is up-regulated in the peripheral blood of CHB patients, while the number of natural killer cells is decreased. Meanwhile, the levels of T lymphocytes are increased in patients with high HBV replication.

Key Words: Lymphocytes; Immune phenotype; Flow cytometry; Hepatitis B virus; Chronic hepatitis B
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)是一种非细胞毒性病毒, 其所致的肝细胞损坏是由机体针对HBV特异性抗原的免疫反应所引起, HBV感染所致的不同临床结果与机体不同的免疫状态密切相关[1]. 目前, 国内外关于T细胞免疫在乙型肝炎发病中的报道较多[2-3], 但系统的对慢性乙型肝炎患者体内淋巴细胞的研究相对较少, 本研究旨在系统的探讨T、B两种淋巴细胞及其活化状况在慢性乙型肝炎的发病机制以及治疗和预后中的意义.

1 材料和方法
1.1 材料

28例慢性乙型肝炎患者均为本院 2004-08/2005-05收治的住院患者, 其中男20例, 女8例, 年龄14-55(平均28.6±13.5)岁. 所有病例的诊断均符合2000-09全国第10次传染病寄生虫病学术会议所修定的《病毒性肝炎防治方案》的诊断标准[4]. 22例健康对照者为本院正常体检的职工, 其中男15例, 女性7, 年龄18-35(平均24.5±6.9)岁. 流式细胞仪为美国Bectond-Dickinson公司的FACSCalibur型; EDTA. K2抗凝管为美国Bectond-Dickinson公司产品; CD3, CD4, CD5, CD19, CD28及CD38等各种荧光标记mAb为美国Beckman Coulter公司产品.

1.2 方法

1.2.1 T、B两种淋巴细胞及其活化状况的检测: 对慢性乙型肝炎患者及健康对照者的抗凝全血应用以下荧光素: 异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、藻红蛋白-花青组合染料(PE-Cy5)及别藻蓝蛋白(APC)标记的单抗组合进行染色: MsIgG2a-FITC, MsIgG2a-PE, MsIgG2a-PE-Cy5, MsIgG2a-APC; CD3, CD19, CD8, CD4; CD62L, CD45RA, CD8, CD4; CD45RO, CD45RA, CD8, CD4; CD95, CD28, CD8, CD4; CD29, CD25, CD8, CD4; CD38, HLADR, CD8, CD4; CD38, CD23, CD19, CD5; CD3, CD(16+56). 室温避光孵育15 min, 加入溶血素100 mL, 室温孵育10 min, 再加入ddH2O 1000 mL, 室温孵育10 min, FACSCELLQUEST软件进行检测分析, 共收集10 000个细胞. 流式细胞仪结果分析: 以前向角散射光(FSC)为横坐标, 侧向角散射光(SSC)为纵坐标, 对淋巴细胞群进行设门, 以同型对照(MsIgG2a)分别设定不同荧光素的阴性界限; 确定T、B两种淋巴细胞的百分率并分别分析淋巴细胞表面各种CD分子的表达情况.

1.2.2 慢性乙型肝炎患者外周血中HBV DNA的定量测定: 检测患者T、B淋巴细胞的同时, 检测患者血清中HBV DNA的含量, 方法为荧光定量PCR法, 仪器为罗氏公司的实时荧光定量PCR仪, HBV DNA的检测阈值为5×105 copies/L.

统计学处理 用SPSS10.0软件包进行统计学分析, 均数间的比较采用t检验.

2 结果
2.1 慢性乙型肝炎患者外周血T、B淋巴细胞及其活化状况

28例慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+, CD8+HLADR+CD38+, CD3-CD19+, CD5-CD19+及CD19+CD38+淋巴细胞数明显高于健康对照组; CD3-CD8+, CD8+CD28-及CD3-CD(16+56)+淋巴细胞数明显低于健康对照组, 差别均有统计学意义(表1).

表1 慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞及其活化状况的测定结果(mean±SD, %).
组别
tP
慢乙肝组 (n = 28)对照组 (n = 22)
CD3+57.7±13.453.1±13.31.18>0.05
CD3+CD4+33.5±11.128.6±10.71.55>0.05
CD3+CD8+21.3±7.919.2±6.21.03>0.05
CD3-CD8+3.4±2.06.7±4.83.14<0.01
CD3+CD4+CD8+2.9±8.42.5±5.20.21>0.05
CD3+CD4-CD8-12.5±4.713.4±8.30.50>0.05
CD4+CD29+21.2±8.718.7±11.00.88>0.05
CD4+CD29-13.3±11.410.8±5.50.94>0.05
CD4+CD28+34.7±11.428.9±10.01.85>0.05
CD4+CD28-0.8±0.91.3±1.31.42>0.05
CD8+CD28+20.1±6.717.8±7.01.19>0.05
CD8+CD28-5.8±3.510.4±6.33.20<0.01
CD4+CD45RA+CD62L+38.0±10.143.7±12.01.78>0.05
CD4+CD45RO+CD45RA-47.7±14.944.2±13.70.84>0.05
CD8+CD45RA+CD62L+43.1±13.939.3±14.00.94>0.05
CD8+CD45RO+CD45RA-24.5±15.423.4±11.70.27>0.05
CD4+CD25+18.3±9.012.6±7.22.37<0.05
CD4+HLADR+3.7±5.92.3±2.70.99>0.05
CD4+CD38+5.5±3.75.5±3.40.05>0.05
CD4+CD95+12.8±6.811.9±7.40.44>0.05
CD4+HLADR+CD38+3.0±2.62.1±1.61.37>0.05
CD4+CD8+CD25+3.7±10.75.3±11.40.48>0.05
CD4+CD8+HLADR+3.2±9.92.1±6.10.43>0.05
CD4+CD8+CD38+0.5±1.30.35±0.90.58>0.05
CD4+CD8+CD95+0.8±2.21.8±2.51.40>0.05
CD8+HLADR+CD38+16.6±8.29.0±5.33.71<0.01
CD8+CD28+CD95-61.4±18.160.8±16.30.11>0.05
CD8+CD28-CD95+0.12±0.30.3±0.81.21>0.05
CD3-CD(16+56)+10.2±6.115.4±8.22.51<0.05
CD3+CD(16+56)+3.5±3.43.6±2.80.15>0.05
CD3-CD19+13.2±5.77.7±2.84.1<0.05
CD19+CD5+4.1±12.70.3±0.41.38>0.05
CD19+CD5-4.3±3.72.3±1.32.31<0.05
CD19+CD23+6.9±12.12.2±1.41.79>0.05
CD19+CD23-2.1±4.50.6±0.51.45>0.05
CD19+CD38+2.2±4.30.3±0.22.17<0.01
2.2 HBV DNA含量不同的慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞及其活化状况

外周血中HBV DNA含量>109 copies/L的患者其CD3+CD8+, CD8+CD28+, CD4+CD45RA+CD62L+, CD8+CD45RA+CD62L+及CD4+CD38+淋巴细胞数均显著高于HBV DNA含量<109 copies/L的患者, 差别有统计学意义(P<0.05, 表2).

表2 HBV DNA含量不同的慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞及其活化状况(mean±SD, %).
CD分子标志组别
tP
HBV DNA≥109 copies/L组 (n = 14)HBV DNA<109 copies/L组 (n =12 )
CD3+CD8+25.2±7.417.2±7.72.16<0.05
CD8+CD28+23.1±5.816.2±7.12.42<0.05
CD4+CD45RA+CD62L+43.2±9.029.9±6.12.83<0.01
CD8+CD45RA+CD62L+49.2±9.931.9±13.33.01<0.01
CD4+CD38+7.7±4.53.2±2.62.50<0.05
3 讨论

HBV并不直接引起肝细胞的损伤, 机体免疫应答是引起肝细胞损害的重要原因. 目前研究认为, 细胞免疫反应是HBV感染后引起肝细胞损害的主要机制[5-8], 包括特异性杀伤T细胞、T辅助细胞、非特异性单核巨噬细胞和NK细胞, 其中特异性杀伤T细胞被认为是免疫应答的主要效应细胞, 在病毒感染尤其是持续性病毒感染的清除中起了重要作用[9-10]. 根据外周血淋巴细胞表面CD分子的表达不同, 可以将其分为T、B两种淋巴细胞, 并可进一步分为许多亚群, 包括辅助性T细胞(CD3+CD4+, CD4+CD28+, CD4+CD25+等)、活化的辅助性T细胞(CD4+CD95+, CD4+CD25+, CD4+CD38+等)、抑制性/细胞毒性T细胞(CD3+CD8+, CD4+CD28+等)、活化的抑制性/细胞毒性T细胞(CD8+ CD25+, CD4+CD38+, CD4+CD95+等)、B淋巴细胞(CD3-CD19+)、活化的B淋巴细胞(CD19+CD5+, CD19+, CD23+, CD19+, CD38+等)及NK细胞(CD3-CD8+, CD3-CD(16+56)+)等. 不同亚群的细胞在肌体的免疫反应中扮演着不同的角色, 如CD8+CD28+细胞是MHC2类限制性细胞前体细胞, 具有MHC2类限制细胞毒活性,在CD4+T细胞分泌细胞因子的作用下, 分化为效应性Tc, 对病毒感染后的靶细胞有特异性杀伤作用, CD8+CD28-(Ts)细胞亚群有免疫抑制作用可抑制抗体的产生及同种异体抗体所诱导的细胞增殖反应, 抑制CD4+T细胞产生细胞因子, 从而抑制Tc细胞的毒性[11].本实验结果表明, 慢性乙型肝炎患者外周血CD8+CD28+细胞数高于健康对照组, 但差别无统计学意义, 而CD8+CD28-细胞数明显低于健康对照组, 差别具有统计学意义(P<0.01). 说明慢性乙型肝炎患者体内特异性杀伤T细胞作用有所增强, 而免疫抑制作用明显减弱, 导致肝脏慢性炎症的持续存在.

HBV是一种非细胞毒性病毒, 但由于HBV在复制过程中, 其病毒抗原往往表达于肝细胞膜上或细胞质内, 当机体免疫细胞作用于这些抗原时引起肝细胞的损坏. 作者检测了慢性乙型肝炎患者的T淋巴细胞活化情况, 结果表明, 慢性乙型肝炎患者CD8+CD38+HLADR+细胞数明显高于健康对照组, 这反映出慢性乙肝患者体内存在着淋巴细胞的明显激活, 这可能正是其肝细胞损伤的原因之一. 说明慢性肝炎的病情加重及持续, 主要是由于CD8+细胞毒性淋巴细胞(即CTL)的作用, 即CTL通过人类MHC类抗原和对乙肝抗原的双重识别, 而直接杀伤肝细胞. 另外, 最近有研究表明, CD4+CD25+调节性T淋巴细胞可抑制T细胞免疫反应, transwell室研究显示, CD4+CD25+细胞介导的抑制作用呈剂量依赖性且需要细胞间的接触, 在调控自身免疫性疾病的发生、炎症反应和T细胞稳态中发挥重要作用[12-13]. 结果显示, 慢性乙型肝炎患者其外周血中CD4+CD25+细胞数明显高于健康对照组, 由此推论, CD4+CD25+T淋巴细胞通过抑制细胞与细胞接触式的HBV特异性T细胞反应, 导致慢性乙型肝炎患者体内HBV的持续存在. NK细胞是不同于T、B淋巴细胞而具有直接杀伤靶细胞效应的一个特殊淋巴细胞系, 他具有抗肿瘤、抗感染、免疫调节等功能. NK细胞在体内针对病毒感染细胞的作用不需要特异性抗原的刺激, 免疫复合物、靶细胞表面结构及某些细胞因子均可直接诱发NK细胞的快速免疫反应, 并可在数小时或1 d内达到高峰. NK细胞在抗病毒感染中至少表现以下两方面功能, 首先NK细胞能直接杀伤被感染的细胞, 其次NK细胞能够分泌大量的具有抗病毒效应的炎性细胞因子[14]. 作者通过研究发现, 慢性乙型肝炎患者体内的NK细胞(CD3-CD8+, CD3-CD(16+56)+)明显低于健康对照, 说明慢性乙型肝炎患者体内NK细胞的减少与慢性乙型肝炎的慢性化进程有一定的相关关系.

以往体液免疫在慢乙肝发病中的作用研究得相对较少, 本研究发现, 28例慢乙肝患者外周血中B淋巴细胞(CD3-CD19+)以及活化的B淋巴细胞(CD5-CD19+, CD19+CD38+)数明显高于健康人, 而且, 患者血清免疫球蛋白(IgG, IgA及IgM)含量也显著高于健康人[15], 说明体液免疫在慢性肝炎的病程中也起到了关键作用. 提示患者在发生HBV感染后, 通过各种病毒抗原激发机体免疫系统使致敏B细胞转化为浆细胞, 并产生了能与相应抗原结合的抗体, 这些抗体能对血液中的HBV进行反应加以杀灭. 虽然HBV抗原大多位于胞质内, 但仍有部分位于胞膜上及核内, 因此在抗原抗体发生免疫反应过程中, 受病毒感染过的肝细胞亦遭到攻击,使肝细胞受到损害. 抗原和抗体之间量的不平衡决定了乙型肝炎病变的程度, 当体内产生的抗体不足以清除抗原时会出现抗原过剩, 则表现为慢性肝炎, 这就可以解释为什么慢乙肝患者B淋巴系统被激活的原因了. 我们还发现, HBV DNA高复制组(HBV DNA>109 copies/L)的CD3+CD8+(CTL)、CD8+CD28+(细胞毒前体/效应T细胞)、CD4+CD45RA+CD62L+(真正幼稚的CD4+细胞), CD8+CD45RA+CD62L+(真正幼稚的CD8+细胞)及CD4+CD38+(活化的辅助性T细胞)细胞均显著升高, 说明HBV的高复制状态能刺激静止和细胞毒性CTL细胞以及效应杀伤细胞的前体细胞的增殖, 也进一步证实了细胞免疫在慢性乙型肝炎发病过程中起到了至关重要的作用.

总之, 慢性乙型肝炎患者T、B两种淋巴细胞的活化程度均较高, NK细胞数量减少, 细胞免疫在慢性乙型肝炎发病过程中起到了重要的作用; 活化的B淋巴细胞通过体液免疫能改善患者的肝功能状况. 体内HBV复制活跃的患者其T淋巴细胞活化程度较高.通过系统检测慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞免疫表型, 可以推断慢性乙型肝炎患者的发病状况, 为临床的诊治提供参考依据.

评论
背景资料

乙型肝炎的肝细胞损伤主要是通过机体一系列免疫应答所造成, 其中以细胞免疫为主. 机体免疫反应的强弱及免疫调节机能是否正常与乙型肝炎临床类型及转归有密切关系. 淋巴细胞在慢性乙型肝炎的发病、治疗和预后中都扮演了重要的角色, 但是在慢性乙型肝炎患者的发病过程中, 到底是哪一种淋巴细胞、哪一种淋巴细胞亚群参与了炎性反应, 以及其在种类或数量上具体有何改变, 国内外文献都未见有详细报道.

创新盘点

本文应用流式细胞术技术以及淋巴细胞亚群分析高级组合的方法, 对慢性乙型肝炎患者外周血中的淋巴细胞进行全面深入的研究, 从质和量两个方面来阐明了淋巴细胞及其亚群在慢性乙型肝炎发病机理中的变化规律, 系统地分析了慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞的变化与临床的关系, 并探求具有诊断价值和评估疗效的免疫学指标.

创新盘点

本文应用流式细胞术技术以及淋巴细胞亚群分析高级组合的方法, 对慢性乙型肝炎患者外周血中的淋巴细胞进行全面深入的研究, 从质和量两个方面来阐明了淋巴细胞及其亚群在慢性乙型肝炎发病机理中的变化规律, 系统地分析了慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞的变化与临床的关系, 并探求具有诊断价值和评估疗效的免疫学指标.

电编:李琪 编辑:王晓瑜

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