基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2006-12-08; 14(34): 3268-3272
在线出版日期: 2006-12-08. doi: 10.11569/wcjd.v14.i34.3268
DDFA方案对重症急性胰腺炎大鼠心肌细胞凋亡及Bax, Bcl-2表达的影响
陆正明, 方驰华, 朱明德, 史学深
陆正明, 方驰华, 朱明德, 史学深, 南方医科大学珠江医院肝胆外科 广东省广州市 510282
陆正明, 2003年南方医科大学硕士生, 主要从事肝胆胰外科疾病的研究.
通讯作者: 方驰华, 510282, 广东省广州市工业大道中, 南方医科大学珠江医院普外科. fch58520@sina.com
收稿日期: 2006-07-23
修回日期: 2006-09-27
接受日期: 2006-09-28
在线出版日期: 2006-12-08

目的: 探讨DDFA方案对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表达的影响.

方法: SD大鼠45只随机分为假手术组、SAP组和DDFA治疗组(DDFA: 地塞米松、低分子右旋糖酐、5-氟脲嘧啶、抑肽酶)大鼠SAP模型采用0.05牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射法建立, 建模后6, 12, 18 h时测定血心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ, mg/L)和肌酸激酶同功酶(CK-MB, nkat/L), 光镜观察心肌组织病理变化, TUNEL法测定心肌细胞凋亡指数(AI), SABC免疫组化染色法测定心肌Bax和Bcl-2基因表达.

结果: SAP组血cTnⅠ(6 h: 2.14±0.09 vs 0.18±0.07; 12 h: 3.30±0.25 vs 0.20±0.08; 18 h: 3.74±0.42 vs 0.19±0.08), CK-MB (6 h: 7681 ±252 vs 3389±204; 12 h: 11576±251 vs 2553 ±205; 18 h: 12972±458 vs 3522±218)和心肌细胞凋亡指数(6 h: 5.73±0.84 vs 0.99±0.13; 12 h: 8.79±0.68 vs 1.00±0.44; 18 h: 14.09±1.22 vs1.02±0.32)、Bax(6 h: 4.42±1.05 vs 1.03±0.13; 12 h: 7.39±0.38 vs 1.08±0.13; 18 h: 8.51±1.07 vs 1.02±0.12)和Bcl-2(12 h: 1.83±0.18 vs 1.11±0.11; 18 h: 3.31±0.75 vs 1.02±0.12)表达较假手术组升高(P<0.01), 光镜下见心肌组织损害明显; 经DDFA治疗后, 血cTnⅠ(6 h: 0.87±0.06; 12 h: 1.73±0.12; 18 h: 2.48±0.34)、CK-MB(6 h: 5858±232; 12 h: 8275±257; 18 h: 8975±430)和心肌细胞凋亡指数(6 h: 2.44±0.27; 12 h: 5.93±0.39; 18 h: 8.75±0.66)、Bax表达(6 h: 3.05±0.87; 12 h: 6.46±0.36; 18 h: 6.97±1.04)下降(P<0.05), 而Bcl-2表达(6 h: 3.05±0.87; 12 h: 4.86±0.46; 18 h: 4.53±1.04)增强(P<0.05), 光镜下见心肌组织损害减轻. 心肌细胞凋亡与血CK-MB、cTnⅠ呈正相关(r = 0.812,P<0.05; r = 0.807, P<0.05).

结论: 心肌细胞凋亡、Bax和Bcl-2表达参与SAP发病机制, 在SAP早期给予DDFA治疗对减轻心脏损害程度、改善预后是有益的.

关键词: 重症急性胰腺炎; 心肌; 细胞凋亡; DDFA方案
引文著录: 陆正明, 方驰华, 朱明德, 史学深. DDFA方案对重症急性胰腺炎大鼠心肌细胞凋亡及Bax, Bcl-2表达的影响. 世界华人消化杂志 2006; 14(34): 3268-3272
Effects of DDFA on cardiac myocyte apoptosis and expression of Bax and Bcl-2 in rats with severe acute pancreatitis
Zheng-Ming Lu, Chi-Hua Fang, Ming-De Zhu, Xue-Shen Shi
Zheng-Ming Lu, Chi-Hua Fang, Ming-De Zhu, Xue-Shen Shi, Department of Hepatobiliary Surgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Correspondence to: Chi-Hua Fang, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China. fch58520@sina.com
Received: July 23, 2006
Revised: September 27, 2006
Accepted: September 28, 2006
Published online: December 8, 2006

AIM: To explore the effects of DDFA (dexamethasone, dextran, 5-fluorouracil and appotininum) on the cardiac myocyte apoptosis and expression of Bax and Bcl-2 in rats with severe acute pancreatitis (SAP).

METHODS: A total of 45 rats were randomized into 3 groups: pseudo-operation group (n = 15), SAP group (n = 15) and DDFA treatment group (n = 15). SAP model was established by retrograde injection of 50 g/L sodium taurocholate solution into the bilio-pancreatic duct of rats. At the 6th, 12th and 18th hour after the establishment of models, blood cardiac troponin Ⅰ (cTnⅠ, mg/L) and creatine kinase isoenzyme MB (CK-MB, nkat/L) were determined. The myocardiac tissues were collected for light microscopic observation, and myocyte apoptosis was determined by TUNEL method. The expression of Bax and Bcl-2 was detected by SABC immunohistochemical staining.

RESULTS: The blood cTnⅠ(6 h: 2.14 ± 0.09 vs 0.18 ± 0.07; 12 h: 3.30 ± 0.25 vs 0.20 ± 0.08; 18 h: 3.74 ± 0.42 vs 0.19 ± 0.08) and CK-MB (6 h: 7681 ± 252 vs 3389 ± 204; 12 h: 11576 ± 251 vs 2553 ± 205; 18 h: 12972 ± 458 vs 3522 ± 218) level, the myocyte apoptosis index (6 h: 5.73 ± 0.84 vs 0.99 ± 0.13; 12 h: 8.79 ± 0.68 vs 1.00 ± 0.44; 18 h: 14.09 ± 1.22 vs1.02 ± 0.32), and the expression of Bax (6 h: 4.42 ± 1.05 vs 1.03 ± 0.13; 12 h: 7.39 ± 0.38 vs 1.08 ± 0.13; 18 h: 8.51 ± 1.07vs 1.02 ± 0.12) and Bcl-2 (12 h: 1.83 ± 0.18 vs 1.11 ± 0.11; 18 h: 3.31 ± 0.75 vs 1.02 ± 0.12) were significantly higher in SAP group than those in pseudo-operation group (P < 0.01), and the damages of myocardiac tissues were observed. However, after DDFA treatment, the blood cTnⅠ(6 h: 0.87 ± 0.06; 12 h: 1.73 ± 0.12; 18 h: 2.48 ± 0.34) and CK-MB (6 h: 5858 ± 232; 12 h: 8275 ± 257; 18 h: 8975 ± 430) level, the myocyte apoptosis index (6 h: 2.44 ± 0.27; 12 h: 5.93 ± 0.39; 18 h: 8.75 ± 0.66), and Bax expression (6 h: 3.05 ± 0.87; 12 h: 6.46 ± 0.36; 18 h: 6.97 ± 1.04) were significantly decreased (P < 0.05), while Bcl-2 expression (6 h: 3.05 ± 0.87; 12 h: 4.86 ± 0.46; 18 h: 4.53 ± 1.04) was increased (P < 0.05). Meanwhile, the pathological changes of myocardiac tissues were relieved. The apoptosis of myocytes was positively correlated with blood level of CK-MB and cTnⅠ(r = 0.812, P < 0.05; r = 0.807, P < 0.05).

CONCLUSION: Myocyte apoptosis and Bax and Bcl-2 expression may be involved in the pathogenesis of SAP. DDFA administration in the early stage is helpful for reducing the severity of myocardiac injury and improving the prognosis of SAP.

Key Words: Severe acute pancreatitis; Myocardium; Apoptosis; DDFA
0 引言

重症急性胰腺炎(SAP)常并发多器官功能障碍, 其胰外器官损伤中心功能障碍(胰心综合征)较为常见, 重型或出血坏死型胰腺炎出现休克高达22%, 3.8%死于心功能不全, SAP时的心血管失代偿是导致病死率较高的并发症之一[1]. 细胞凋亡在外科多种疾病的发生和转归中已受到越来越多的关注, Bax和Bcl-2是细胞凋亡的重要调控基因, 随着对SAP的发病机制过程的认识日趋深入, 人们越来越重视治疗过程中对重要脏器的保护. 1997年方驰华 et al[2]应用DDFA方案(D: 地塞米松, dexamethasone; D: 低分子右旋糖酐, dextran; F: 5-氟脲嘧啶, 5-fluorouracil; A: 抑肽酶, appotininum)治疗SAP取得明显效果, DDFA组较非DDFA组各项检测指标恢复快. 我们利用SAP心脏损害大鼠模型, 探讨细胞凋亡和Bax, Bcl-2基因表达在SAP心脏损害发病机制中的作用以及应用DDFA治疗后的影响.

1 材料和方法
1.1 材料

SD大鼠45只, 雌雄不限, 体质量250-300 g, 由南方医科大学实验动物中心提供. 随机分成3组: 假手术组(SO组)15只: SAP组15只: DDFA治疗组15只. 每组再分为6, 12, 18 h 3个时间点, 每个时间点分配5只大鼠.

1.2 方法

术前禁食不禁水12 h, SAP组用30 g/L戊巴比妥钠ip麻醉, 作上腹正中切口入腹, 近肝门处暂时夹闭胆总管, 于十二指肠降部找到胰胆管开口, 在对侧肠壁上选一无血管区, 用穿刺针扎穿肠壁, 将穿刺导管从针孔送入肠腔后穿入胰胆管内1 cm, 注入50 g/L牛磺胆酸钠(10 mL/kg)制备SAP模型(注射速度0.2 mL/min), 指压穿刺点, 查无漏胆, 逐层关腹. SO组仅行胰胆管穿刺操作, 不注射药物: DDFA组在SAP模型诱发后, 经股静脉注射地塞米松(0.5 mg/kg)+低分子右旋糖酐(40 mL/kg)+5-氟脲嘧啶(40 mg/kg)+抑肽酶(50 kU/kg). 造模后6, 12, 18 h等各时间点处死大鼠, 心脏穿刺抽血, 快速切取心脏, 测定各项指标.

1.2.1 全自动生化分析仪测定血CK-MB: 采用放射免疫法测定cTnⅠ. 各心肌组织光镜标本以多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋、HE染色, 光镜观察.

1.2.2 心肌细胞凋亡的测定: 采用DNA末端原位标记法(TUNEL法, 试剂盒购自武汉博士德公司). 切片常规脱蜡入水, 经30 mL/L H2O2处理、蛋白酶K消化后, 加入TDT和Dig.dUTP 4 ℃过夜, 封闭后加生物素化抗地高辛抗体, 洗涤, 加SABC, DAB显色, 光镜下计算心肌细胞凋亡指数(apoptotic index, AI). AI计算方法: 细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞, 即凋亡细胞, 数5个高倍视野, 分别计算凋亡细胞数和总细胞数, AI = 凋亡细胞数/总细胞数×100%.

1.2.3 心肌细胞Bax, Bcl-2的测定: 采用SABC免疫组化染色法(免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司). 染色模式: 胞膜或胞质. 根据染色强度分为阳性(棕黄色): 弱阳性(浅黄色): 阴性(不着色). 各组切片均采用图像分析系统对免疫组化染色阳性反应产物进行定量分析. 取切片在光学显微镜下以相同倍数(40×10)随机选取10个视野, 利用图像分析系统分析阳性面积和阳性区域平均灰度值, 并将阳性面积和平均灰度值按文献方法[3]换算成阳性单位(positive unit, PU), 以PU值大小代表阳性产物表达的多少.

统计学处理 采用SPSS10.0统计软件建立数据库, 均数比较用完全随机设计资料的方差分析, SO和DDFA组与SAP组间的比较用DunnettT3法. 细胞凋亡与心功能损害的相关性用相关性分析P≤0.05为差异有显著性意义.

2 结果
2.1 心脏组织病理学改变

SO组大体未见异常: SAP组6 h时心脏水肿不明显: 12 h时心脏水肿, 可见血性胸水: 18 h时心脏水肿加重, 可见血性胸水: DDFA组各时间点心脏变化均较SAP组减轻. 光镜下SO组未见异常: SAP组18 h心肌细胞浊肿及肌间隙白细胞浸润加重, 肌束结构排列紊乱, 有少许心内膜下心肌出血: DDFA组各时间点镜下所见均较SAP组减轻.

2.2 血CK-MB及cTnⅠ的变化

SAP时血CK-MB及cTnⅠ明显升高, 且随着病程延长而逐渐增高: 应用DDFA治疗后, 血CK-MB及cTnⅠ下降, 但仍有随着病程延长而逐渐增高的趋势(表1).

表1 胰腺炎大鼠cTnⅠ和CK-MB(nkat/L)含量检测结果(mean±SD).
指标组别6 h12 h18 h
cTnⅠ(μg/L)SO0.18±0.07b0.20±0.08b0.19±0.08b
SAP2.14±0.093.30±0.253.74±0.42
DDFA0.87±0.06b1.73±0.12a2.48±0.34a
CK-MB(nkat/L)SO3389±204b2553±205b3522±218b
SAP7681±25211576±25112972±458
DDFA5858±232a8275±257a8975±430a
aP<0.05,
bP<0.01 vs SAP组.
2.3 心肌细胞凋亡和凋亡基因情况

SO组仅见极少量凋亡细胞, SAP组凋亡细胞明显增多, 凋亡指数升高, 并随着病程延长而逐渐增高, DDFA组凋亡指数较SAP组明显下降(图1, 表2). 心肌细胞凋亡与血CK-MB呈正相关(r = 0.812, P<0.05), 与 cTnⅠ也呈正相关(r = 0.807, P<0.05). SO组心肌Bax, Bcl-2的表达均很弱: SAP组两基因的表达均增强: DDFA组与SAP组比较, Bax表达明显下调, 而Bcl-2表达明显上调(图2-3, 表2).

图1
图1 各组大鼠心肌细胞调亡的检测结果(TUNEL×400). A: SO组急性胰腺炎大鼠心肌细胞凋亡; B: SAP组18 h凋亡细胞明显增多; C: DDFA组18 h凋亡细胞较SAP组减少.
表2 胰腺炎大鼠心肌细胞凋亡指数、Bax及Bcl-2的表达(mean±SD).
指标组别6 h12 h18 h
AISO0.99±0.13b1.00±0.44b1.02±0.32b
SAP5.73±0.848.79±0.6814.09±1.22
DDFA2.44±0.27b5.93±0.39a8.75±0.66b
Bax(PU)SO1.03±0.13b1.08±0.13b1.02±0.12b
SAP4.42±1.057.39±0.388.51±1.07
DDFA3.05±0.87a6.46±0.36a6.97±1.04b
Bcl-2(PU)SO1.03±0.131.11±0.11a1.02±0.12b
SAP1.22±0.141.83±0.183.31±0.75
DDFA3.05±0.87a4.86±0.46b4.53±1.04a
aP<0.05,
bP<0.01 vs SAP组.
图2
图2 急性胰腺炎大鼠心肌Bax表达(SABC×400). A: SO组表达较弱; B: SAP组18 h较SO组明显增强; C: DDFA组18 h较SAP组减弱.
图3
图3 急性胰腺炎大鼠心肌Bcl-2表达(SABC×400). A: SO组较弱; B: SAP组18 h较SO组增强; C: DDFA组18 h较SAP组进一步增强.
3 讨论

缩短SAP病程及降低其死亡率的关键是防治多脏器功能损害. 因此, 探讨SAP心脏损伤及发生机制, 为其治疗提供新思路, 具有重要意义. 心肌酶可反映心肌细胞的完整性, CK-MB绝大部分存在于心肌细胞质内, 心肌损害时可从心肌细胞逸出, 导致血清心肌酶的活性升高, 该酶是一种比较特异的酶, 对心肌疾病的特异性、敏感性较强, 心肌损伤时的阳性率达97.5%, 特异性达100%[4], CK-MB是确定心肌损害的关键指标, 可作为判断心肌损伤程度的重要依据, 能早期敏感地反映心肌细胞受损的情况, CK-MB活性越高, 提示心肌损伤程度就越重. cTnＩ是一种肌肉收缩蛋白,当心肌细胞受到损伤而细胞膜完整性遭到破坏时, 胞质内游离cTnＩ迅速入血, 3-6 h即可在外周血测得其异常, 持续至伤后24 h, 因此可以早期从血中检出, cTnＩ敏感性和特异性较高, 这是因为cTnＩ特异性分布于心肌, 是心肌特异性抗原, 其释放入血循环是心肌损伤的高度敏感性和特异性标志[5].

细胞凋亡是基因调控的细胞生理性死亡形式, 是一种主动、自发性的过程, 是目前生物学和医学界的研究热点. SAP时可出现胰腺细胞、肾细胞调亡[6-7]. 过去认为在终末分化的成人细胞中如心肌细胞和神经元细胞并不发生细胞凋亡, 但是最近几年的研究发现, 心肌细胞在缺氧条件下培养以及体外缺血再灌注后的心肌都出现了细胞凋亡[8]. 我们的观察结果发现, SAP大鼠心脏的细胞凋亡数明显增多, 凋亡指数增高, 凋亡发生部位与病理改变明显的部位吻合, 心肌细胞凋亡指数与心功能的损害程度呈正相关, 说明SAP心脏损伤至少部分是通过细胞凋亡机制引起的. SAP引起心肌细胞凋亡的机制可能是: (1)SAP早期低血容量、缺氧、疼痛和应激等可使心肌b-肾上腺素能神经兴奋性增加: SAP大量渗液进人腹腔后, 刺激腹腔神经丛反射性引起包括冠状动脉在内的广泛血管痉挛, 导致心肌缺血缺氧, 而心肌在缺血缺氧条件下可出现细胞凋亡; (2)SAP时产生大量氧自由基, 其细胞毒作用的重要机制之一就是诱导细胞凋亡: 而凋亡相关基因Bcl-2基因的蛋白表达产物, 定位于氧自由基产生的核膜、内质网和线粒体膜, 这一分布与防止脂质过氧化的功能密切相关[9]; (3)SAP时白细胞过度激活发生瀑布效应, 产生包括TNF-α在内的大量细胞因子: 同时肠道细菌移位导致内毒素血症, 内毒素血症一方面可刺激血清TNF-α升高, 一方面可直接诱导心肌组织产生TNF-α. Kapadia et al[10]证明在内毒素的刺激下心脏心肌细胞和巨噬细胞几乎产生同样多的TNF-α; 而血清和心肌自身产生的TNF-α, 均可通过鞘氨醇依赖的机制诱导心肌细胞凋亡[11]. 细胞凋亡是受基因调控的, 在调控细胞凋亡的基因中, Bcl-2家族是最受重视者之一, 其中Bcl-2蛋白是最重要的凋亡抑制基因, Bax也是Bcl-2基因家族成员, 他的功能与Bcl-2相反, 主要是促进细胞凋亡. 我们的实验发现, SAP时心肌Bax基因表达明显上升, 并且随病程延长而逐渐增高, Bcl-2的表达也有所上升, 但幅度相对较小, 可能是机体代偿所致. 而应用DDFA治疗后, Bax基因表达明显下调, 而Bcl-2基因表达明显上调.

总之, SAP时随着心肌凋亡细胞数增多, 心功能进一步恶化, DDFA可明显改善心脏功能, 并能调节Bcl-2和Bax基因, 减少心肌细胞凋亡, 因此认为, DDFA对心功能的保护作用可能部分是通过调节凋亡相关基因Bax和Bcl-2从而影响细胞凋亡实现的.

评论
背景资料

重症急性胰腺炎(SAP)常并发多器官功能障碍(MODS), 其胰外器官损伤中, 心功能障碍(胰心综合征)较为常见, 重型或出血坏死型胰腺炎出现休克高达22%, 3.8%死于心功能不全, SAP时的心血管失代偿是导致病死率最高的并发症. DDFA已经临床证实对SAP有明显的治疗效果, 但其治疗SAP的机制如何, 是否通过调控细胞凋亡对SAP起治疗作用, 对机体各重要脏器细胞凋亡是否有影响, 在什么时间、用什么方式、什么剂量应用影响最大、效果最好, DDFA各药物间在影响细胞凋亡方面是否有协同或拮抗作用, 进一步调整该方案、调整药物间的剂量组合是否有更好的效果, 等等, 这些问题都需要进行验证和探索.

研发前沿

细胞凋亡及凋亡相关基因是目前生物医学领域的研究热点, 在外科多种疾病的发生和转归中已受到越来越多的关注.

应用要点

本文拟通过动物实验解决这些问题中的一部分, 以利于临床DDFA方案的进一步完善, 并为此方案临床推广应用提供理论依据.

同行评价

本文检测DDFA对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响, 以此观察DDFA对SAP的治疗作用, 并就此阐明DDFA对SAP脏器保护作用的机制, 提供了有意义的信息, 内容较新, 具有一定的意义及价值.

电编:李琪 编辑:潘伯荣

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