临床经验 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2006. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2006-09-18; 14(26): 2632-2635
在线出版日期: 2006-09-18. doi: 10.11569/wcjd.v14.i26.2632
胃癌组织中幽门螺杆菌cagA和vacA的表达及与其感染的相关性
佟书娟, 陈军, 詹瑧, 杨丹丹, 刘亚平
佟书娟, 詹瑧, 杨丹丹, 南京中医药大学基础医学院 江苏省南京市 210029
陈军, 中国人民解放军宁夏军区政治部 宁夏回族自治区银川市 750021
刘亚平, 中国人民解放军第5医院病理科 宁夏回族自治区银川市 750004
基金项目: 宁夏教育厅科研基金资助项目, No. JY2002125.
通讯作者: 佟书娟, 210029, 江苏省南京市, 南京中医药大学基础医学院. tongshujuan6@sina.com
电话: 025-85811925
收稿日期: 2006-05-23
修回日期: 2006-06-26
接受日期: 2006-08-10
在线出版日期: 2006-09-18

目的: 研究H. pylori cagA和H. pylori vacA在胃癌、胃黏膜不典型增生和胃炎组织中的表达及与H. pylori感染的相关性.

方法: 采用Warthin-Starry嗜银染色法检测胃癌组织39例, 胃黏膜不典型增生组织24例和慢性胃炎组织33例中H. pylori感染情况; PCR法检测上述标本中H. pylori cagA和H. pylori vacA的表达.

结果: 胃癌组织中H. pylori, H. pylori cagA+株和H. pylori vacA+株感染率显著高于慢性胃炎组织(χ2 = 7.00, P<0.05; χ2 = 15.20, P<0.05; χ2 = 12.43, P<0.05); 胃黏膜不典型增生组织中H. pylori, H. pylori cagA+株和H. pylori vacA+株感染率显著高于慢性胃炎组织(χ2 = 6.25, P<0.05; χ2 = 11.04, P<0.05; χ2 = 11.61, P<0.05); 低分化胃癌组织中H. pylori, H. pylori cagA+和H. pylori vacA+株感染率显著高于高中分化胃癌组织(χ2 = 8.19, P<0.05; χ2 = 13.14, P<0.05; χ2 = 6.62, P<0.05). 慢性胃炎、不典型增生和胃癌组织中H. pylori与H. pylori cagA和H. pylori vacA表达均呈正相关(慢性胃炎: r = 0.56, P<0.01; r = 0.64, P<0.01; 不典型增生组织: r = 0.64, P<0.01; r = 0.92, P<0.01; 胃癌: r = 0.90, P<0.01; r = 0.95, P<0.01).

结论: H. pylori感染是慢性胃炎向胃黏膜不典型增生及胃癌发展的重要启动因子, H. pylori感染可能通过诱导cagA表达促使胃黏膜上皮细胞增殖加快, 诱导vacA表达促使胃黏膜上皮细胞损伤; 他们的协同作用可能在胃癌发生、发展过程中发挥了重要作用.

关键词: 胃癌; 幽门螺杆菌; 细胞毒素相关基因A; 空泡细胞毒素基因A
引文著录: 佟书娟, 陈军, 詹瑧, 杨丹丹, 刘亚平. 胃癌组织中幽门螺杆菌cagA和vacA的表达及与其感染的相关性. 世界华人消化杂志 2006; 14(26): 2632-2635
Expression of Helicobacter pylori cagA and vacA and their correlations with Helicobacter pylori infection in gastric cancer
Shu-Juan Tong, Jun Chen, Zhen Zhan, Dan-Dan Yang, Ya-Ping Liu
Shu-Juan Tong, Zhen Zhan, Dan-Dan Yang, Basic Medical College, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Jun Chen, Department of Politics, Ningxia Military Command of Chinese PLA, Yinchuan 750021, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Ya-Ping Liu, Department of Pathology, the Fifth Hospital of Chinese PLA, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by: the Science Research Foundation from Department of Education of Ningxia Hui Autonomous Region, No. JY2002125.
Correspondence to: Shu-Juan Tong, Basic Medical College, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China. tongshujuan6@sina.com
Received: May 23, 2006
Revised: June 26, 2006
Accepted: August 10, 2006
Published online: September 18, 2006

AIM: To explore the expression of H. pylori cagA and vacA in gastric cancer and their correlations with H. pylori infection.

METHODS: H. pylori infection was determined by Warthin-Starry silver staining in gastric cancer (n = 39), gastric mucosal atypical hyperplasia (n = 24) and chronic gastritis (n = 33). Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expression of H. pylori cagA and vacA.

RESULTS: The infection rates of H. pylori, cagA+H. pylori and vacA+H. pylori in gastric cancer tissues were significantly higher than those chronic gastritis tissue (χ2 = 7.00, P < 0.05; χ2 = 15.20, P < 0.05; χ2 = 12.43, P < 0.05); the infection rates of H. pylori, cagA+H. pylori and vacA+H. pylori in gastric mucosal atypical hyperplasia were markedly higher than those in chronic gastritis (χ2 = 6.25, P < 0.05; χ2 = 11.04, P < 0.05; χ2 = 11.61, P < 0.05). The infection rates of H. pylori, cagA+H. pylori and vacA+H. pylori were significantly higher in poorly-differentiated gastric cancer in comparison with those in moderately- and well-differentiated one (χ2 = 8.19, P < 0.05; χ2 = 13.14, P < 0.05; χ2 = 6.62, P < 0.05). H. pylori infection was positively related to H. pylori cagA and vacA expression in chronic gastritis, gastric mucosal atypical hyperplasia and gastric cancer (chronic gastritis: r = 0.56, P < 0.01; r = 0.64, P < 0.01; atypical hyperplasia: r = 0.64, P < 0.01; r = 0.92, P < 0.01; gastric cancer: r = 0.90, P < 0.01; r = 0.95, P < 0.01).

CONCLUSION: H. pylori infection is an important promoter in the development of chronic gastritis into atypical hyperplasia and gastric cancer, and it may accelerate the proliferation and injury of gastric mucosa epithelial cells by inducing cagA and vacA expression, respectively. Their synergistic effects may play important roles in the pathogenesis of gastric cancer.

Key Words: Gastric cancer; Helicobacter pylori; Cytotoxin associated gene A; Vacuolating cytotoxin gene A
0 引言

胃癌发病率居全世界恶性肿瘤的第二位, 居消化道恶性肿瘤的第一位, 我国是胃癌的高发区. 在我国, 胃癌的病死率居各种癌症之首位. 现研究发现, 生物致病因子幽门螺杆菌(H. pylori)感染[1-2]可能是慢性胃炎向胃黏膜不典型增生及胃癌发展的重要启动因子. 1994年世界卫生组织已把H. pylori列为第一级致癌物质, 但关于H. pylori感染在胃癌发生过程中的确切机制并未完全阐明. 我们采用Warthin-Starry嗜银染色(W-S染色)法检测胃癌组织39例, 胃黏膜不典型增生组织24例和慢性胃炎组织33例中的H. pylori感染情况; 采用PCR法检测上述标本中细胞毒素相关基因A和空泡细胞毒素基因A的表达, 探讨H. pylori感染、细胞毒素相关基因A和空泡细胞毒素基因A表达与胃癌发生的相关性及意义.

1 材料和方法
1.1 材料

解放军第5医院2002-01/2003-12纤维内镜活检存档蜡块标本96例, 胃癌39例, 男32例, 女7例, 平均年龄63.4 (34-87)岁; 胃黏膜不典型增生24例, 男17例, 女7例, 平均年龄59.9 (47-79)岁; 慢性胃炎33例, 男14例, 女19例, 平均年龄46.8 (19-92)岁.

1.2 方法

标本40 g/L甲醛固定, 常规脱水, 石蜡包埋, 4 mm厚连续切片. H. pylori感染采用W-S染色, H. pylori呈棕黑色, 弯曲成弧形、S形或海鸥状, 多位于胃黏膜表面和/或胃小凹及胃癌旁黏膜腺窝内. 细胞毒素相关基因A (cytotoxin associated gene A, cagA)和空泡细胞毒素基因A (vacuolating cytotoxin gene A, vacA)的检测采用PCR法. cagA引物序列: 引物1: 5'GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG3', 引物2: 5'CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA3'; vacA引物序列: 引物1: 5'GTCAGCATCACACCGCAAC3', 引物2: 5'CTGCTTGAATGCGCCAAAC3', 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; Taq DNA酶、PCR染液购自北京赛百圣基因技术有限公司; dNTP购自南京生兴生物技术有限公司. 取石蜡块切片3片(厚12 mm), 经二甲苯脱蜡后, 消化液(500 mg/L蛋白酶K, 10 mmol Tris-HCI pH 8.0, 10 mmol NaCl, 1 mmol EDTA, 100 g/L SDS)消化, 酚-氯仿抽提DNA, -20 ℃备用. cagA PCR反应体系为50 mL, 包括DNA模板2 mL, cagA引物1和引物2各0.75 mL, Taq DNA酶0.5 mL, 10×Taq缓冲液5 mL, PCR染液5 mL, dNTP 1 mL, ddH2O 35 mL. vacA PCR反应体系为50 mL, 包括DNA模板2 mL, vacA引物1和引物2各1 mL, Taq DNA酶0.5 mL, 10×Taq缓冲液5 mL, PCR染液5 mL, dNTP 1 mL, ddH2O 34.5 mL. cagA PCR反应条件: 95 ℃预变性4 min后, 95 ℃变性60 s, 50 ℃退火60 s, 72 ℃延伸60 s, 共30个循环, 循环结束后72 ℃延伸7 min. vacA PCR反应条件: 94 ℃预变性4 min后, 94 ℃变性60 s, 52 ℃退火60 s, 72 ℃延伸60 s, 共30个循环, 循环结束后72 ℃延伸7 min. 反应结束后取13 mL扩增水相用15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, cagA在349 bp出现电泳带为阳性, vacA在190 bp出现电泳带为阳性, 否则为阴性.

统计学处理 采用计算机统计分析软件SPSS 12.0进行数据处理, 胃黏膜组织H. pylori, H. pylori cagA+株和H. pylori vacA+株表达情况, 高、中、低分化胃癌组织中H. pylori, H. pylori cagA和H. pylori vacA的表达情况采用χ2检验, 慢性胃炎、不典型增生和胃癌组织中H. pylori与H. pylori cagA和H. pylori vacA的相关性采用spearman等级相关分析.

2 结果
2.1 胃黏膜组织H. pylori, H. pylori cagA+株和H. pylori vacA+株感染率(表1)
表1 胃黏膜组织H. pylori, cagA+株和vacA+株感染率及在不同分化程度的胃癌组织中的表达 (n/%).
分组nH. pyloricagA+vacA+
慢性胃炎3310(30.3)4(12.1)5(15.2)
不典型增生2412(50.0)7(29.2)9(37.5)
胃癌3924(61.5)a22(56.4)a23(58.6)a
高、中分化155(33.3)3(20.0)5(33.3)
低分化2419(79.2)b19(79.2)b18(75.0)b
aP<0.05 vs 慢性胃炎;
bP<0.01 vs 高中分化.

胃癌组织中H. pylori感染率(61.5%)高于慢性胃炎组织(30.3%), 有显著性差异(P<0.05, χ2 = 7.00); 胃黏膜不典型增生和胃癌组织中H. pylori感染率(57.1%)高于慢性胃炎组织(30.3%), 有显著性差异(P<0.05, χ2 = 6.25); 胃癌组织中H. pylori cagA+株感染率(56.4%)高于慢性胃炎组织(12.1%), 有显著性差异(P<0.05, χ2 = 15.20); 胃黏膜不典型增生和胃癌组织中H. pylori cagA+株感染率(46.0%)高于慢性胃炎组织(12.1%), 有显著性差异(P<0.05, χ2 = 11.04). 胃癌组织中H. pylori vacA+株感染率(58.6%)高于慢性胃炎组织(15.2%), 有显著性差异(P<0.05, χ2 = 12.43); 胃黏膜不典型增生和胃癌组织中H. pylori vacA+株感染率(50.8%)高于慢性胃炎组织(15.2%), 有显著性差异(P<0.05, χ2 = 11.61). 低分化胃癌组织中H. pylori感染率(79.2%)高于高中分化胃癌组织(33.3%), 有显著性差异(P<0.05, χ2 = 8.19); 低分化胃癌组织中H. pylori cagA+株感染率(79.2%)高于高、中分化胃癌组织(20.0%), 有显著性差异(P<0.05, χ2 = 13.14); 低分化胃癌组织中H. pylori vacA+株感染率(75.0%)高于高、中分化胃癌组织(33.3%), 有显著性差异(P<0.05, χ2 = 6.62).

2.2 胃黏膜组织H. pylori与H. pylori cagA和H. pylori vacA表达的相关性(表2)
表2 H. pylori与cagA和vacA表达的相关性 (r).
项目慢性胃炎
不典型增生
胃癌
cagAvacAcagAvacAcagAvacA
H. pylori0.560.640.640.920.900.95
P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

慢性胃炎组织中H. pylori与H. pylori cagA和H. pylori vacA表达均呈正相关(P<0.01, r = 0.56; P<0.01, r = 0.64); 不典型增生组织中H. pylori与H. pylori cagA和H. pylori vacA表达均呈正相关(P<0.01, r = 0.64; P<0.01, r = 0.92); 胃癌组织中H. pylori与H. pylori cagA和H. pylori vacA表达均呈正相关(P<0.01, r = 0.90; P<0.01, r = 0.95).

3 讨论

1983年澳大利亚学者Warren和Marshall首次报道从人胃黏膜中培养出H. pylori, 经过20余年的研究, 已经证实H. pylori感染是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的主要病因, 与胃癌的发生亦有密切关系[1-5]. 以往研究发现, 有60%-70%的胃癌患者感染了H. pylori. 一般认为, H. pylori定居于胃黏膜上皮细胞后激活免疫炎症反应, 大量炎症细胞侵入黏膜下层, 释放一系列细胞因子, 如肿瘤坏死因子-a (turmor necrosis factor-a, TNF-a), 白细胞介素-1 (interleukin-1, IL-1), 白细胞介素-6 (IL-6), 白细胞介素-8 (IL-8)等, 同时也易致胃黏膜细胞DNA的损伤及增加出现非整倍体的危险性, 进一步形成多种致癌或致突变物质, 因此认为, H. pylori感染是慢性胃炎向萎缩性胃炎, 肠上皮化生、不典型增生及胃癌发展的主要启动因子[6-7]. 对H. pylori致病作用的研究已表明, 他的可能致病物质包括细菌的鞭毛、黏附素、尿素酶、蛋白酶、内毒素、细胞毒素等, cagA和vacA表达的CagA蛋白和VacA蛋白是H. pylori产生的两种主要细胞毒素. Odenbreit et al[8]研究发现, H. pylori定居于胃黏膜上皮细胞后产生CagA蛋白, 在上皮细胞内, CagA蛋白的酪氨酸残基被磷酸化, 并与真核生物的信号传递系统和细胞重塑相连而引起细胞的增殖. 体外实验表明, vacA基因编码的VacA蛋白能使多种哺乳动物细胞发生广泛的空泡样变性, 最终导致细胞死亡[9]. 由于VacA蛋白对上皮细胞具有损伤作用, 因而被认为是H. pylori的一种重要致病因子, 也是H. pylori毒力分型的标志, 与H. pylori感染者的临床发病有密切关系. 本结果显示, 胃黏膜不典型增生和胃癌组织中H. pylori, H. pylori cagA+株和H. pylori vacA+株感染率显著高于慢性胃炎组织, 证实H. pylori感染是慢性胃炎向胃黏膜不典型增生及胃癌发展的重要启动因子, H. pylori cagA和vacA的过度表达与胃癌的发生、发展密切相关. 本研究发现, H. pylori, H. pylori cagA和vacA在低分化程度的胃癌组织中的表达明显高于分化程度较高的胃癌组织中的表达, 提示H. pylori, H. pylori cagA和vacA的高表达, 使胃癌细胞具有更大的侵袭力, 可能与胃癌的恶性程度、预后、进展有关. 慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌组织中H. pylori与H. pylori cagA和vacA的表达呈正相关, 说明cagA和vacA编码的CagA蛋白和VacA蛋白是H. pylori产生两种主要毒力因子; H. pylori感染可能通过诱导cagA基因表达促使胃黏膜上皮细胞增殖加快, 诱导vacA基因表达促使胃黏膜上皮细胞损伤; 他们的协同作用可能在胃癌发生、发展过程中发挥了重要作用.

评论
背景资料

胃癌的发生是一个多因素、多阶段和多基因的演变过程, 微生物、寄生虫等生物致病因子是导致胃癌形成的重要病因, 研究发现, 生物致病因子幽门螺杆菌(H. pylori)感染与胃癌的发生密切相关.

研发前沿

目前, H. pylori研究的热点为H. pylori的毒力因子cagA和vacA与胃癌发生的关系及对致癌物形成的影响, 胃黏膜H. pylori感染与上皮细胞增殖、细胞凋亡的关系, H. pylori感染对胃黏膜线粒体DNA稳定性的影响, 胃癌基因和免疫治疗的策略.

相关报道

目前, H. pylori的研究主要集中于其致胃癌作用机制的研究, H. pylori的耐药性, HpcagA和vacA基因片段克隆、表达及序列测定, H. pylori L型感染的诊断和治疗等.

创新盘点

本研究证实, H. pylori感染是慢性胃炎向胃黏膜不典型增生及胃癌发展的重要启动因子, H. pylori cagA和H. pylori vacA基因的过度表达可能在胃癌发生、发展过程中发挥了重要作用.

应用要点

本文通过对慢性胃炎、胃黏膜不典型增生和胃癌组织中H. pylori, H. pylori cagA+株和H. pylori vacA+株感染率的检测, 进一步深化了H. pylori致胃癌的可能机制, 同时对胃癌的基因治疗、疗效和预后的判定提供了帮助.

同行评价

本研究探讨了H. pylori致胃癌的可能机制, 选题较新, 实验设计合理, 有科学性. 论文书写流畅, 数据可信, 参考文献较新, 有临床参考意义.

电编:张敏 编辑:张焕兰

1.  佟 书娟, 刘 亚平, 尹 清云. 幽门螺杆菌感染与胃癌中VEGF的表达及肿瘤血管形成的关系. 实用肿瘤学杂志. 2005;19:161-163.  [PubMed]  [DOI]
2.  佟 书娟, 刘 亚平, 杨 丹丹. 幽门螺杆菌在胃癌发生过程中的作用机制. 第四军医大学学报. 2005;26:2219-2222.  [PubMed]  [DOI]
3.  Vandenplas Y. Helicobacter pylori infection. World J Gastroenterol. 2000;6:20-31.  [PubMed]  [DOI]
4.  Takeuchi K, Ohno Y, Tsuzuki Y, Ando T, Sekihara M, Hara T, Kuwano H. Helicobacter pylori infection and early gastric cancer. J Clin Gastroenterol. 2003;36:321-324.  [PubMed]  [DOI]
5.  姚 永莉, 张 万岱. 幽门螺杆菌致病因子研究进展. 世界华人消化杂志. 2002;10:455-458.  [PubMed]  [DOI]
6.  Wagner S, Beil W, Westermann J, Logan RP, Bock CT, Trautwein C, Bleck JS, Manns MP. Regulation of gastric epithelial cell growth by Helicobacter pylori: offdence for a major role of apoptosis. Gastroenterology. 1997;113:1836-1847.  [PubMed]  [DOI]
7.  van Doorn LJ, Glupczynski Y, Kusters JG, Megraud F, Midolo P, Maggi-Solca N, Queiroz DM, Nouhan N, Stet E, Quint WG. Accurate prediction of macrolide resistance in Helicobacter pylori by a PCR line probe assay for detection of mutations in the 23S rRNA gene: multicenter validation study. Antimicrob Agents Chemother. 2001;45:1500-1504.  [PubMed]  [DOI]
8.  Odenbreit S, Puls J, Sedlmaier B, Gerland E, Fischer W, Haas R. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion. Science. 2000;287:1497-1500.  [PubMed]  [DOI]
9.  Tombola F, Oregna F, Brutsche S, Szabo I, Del Giudice G, Rappuoli R, Montecucco C, Papini E, Zoratti M. Inhibition of the vacuolating and anion channel activities of the VacA toxin of Helicobacter pylori. FEBS Lett. 1999;460:221-225.  [PubMed]  [DOI]